Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

Миграция клеток является биологическим феноменом, который участвует в многочисленных физиологических, таких как заживление ран и иммунных реакций, и патофизиологических процессов, как рак. 3D-коллагеновый матрикс анализа миграции является универсальным инструментом для анализа миграционных свойств различных типов клеток в в 3D физиологическая-среде.

Abstract

Способность переносить является отличительным признаком различных типов клеток и играет важную роль в нескольких физиологических процессов, в том числе эмбрионального развития, заживления ран, и иммунного ответа. Тем не менее, миграция клеток также является ключевым механизмом в рака позволяет эти раковые клетки отделяются от первичной опухоли, чтобы начать метастазирование. В течение последних лет различные анализы миграцию клеток были разработаны для анализа миграционного поведения различных типов клеток. Поскольку двигательные поведение клеток заметно отличается между двумерной (2D) и трехмерной (3D) окружающей среды, можно предположить, что анализ миграции клеток, внедренных в 3D-среде даст более существенный миграцию клеток Данные. Преимущество описанного 3D коллагеновой матрицы анализа миграции является то, что клетки встроены в физиологическом 3D сети коллагеновых волокон, представляющих основной компонент внеклеточной матрицы. Благодаряпокадровой видео микроскопии миграции клеток в реальном измеряется позволяет определить несколько параметров миграции, а также их изменения в ответ на про-миграционных факторов или ингибиторов. Различные типы клеток могут быть проанализированы с помощью этой техники, в том числе лимфоцитов / лейкоцитов, стволовые клетки и раковые клетки. Точно так же, также кластеры клеток или сфероидов может быть встроен в коллагеновой матрицы, одновременно с анализом эмиграции отдельных клеток от клеток кластера / сфероида в коллагена решетки. Мы пришли к выводу, что 3D коллагеновый матрикс анализа миграции является универсальным методом для анализа миграции клеток в пределах физиологической, как 3D-среде.

Introduction

Как слияния клеток (краткий обзор см 1,2) миграция клеток еще один биологический феномен, который участвует в многочисленных физиологических процессах, включая эмбриональное развитие, заживление ран и иммунных реакций (для обзора см 3). Тем не менее, способность к миграции также является необходимым условием для опухолевые клетки к метастазированию (для обзора посмотреть 3,4).

Миграция клеток является сложным, еще не полностью изучены процесс, который направлен на взаимодействие нескольких путей передачи сигналов по инициативе различных лиганда (например, цитокины, хемокины, факторы роста, гормоны, компоненты внеклеточного матрикса) рецепторов (например, рецептор тирозинкиназы, рецепторы хемокинов, интегрины) взаимодействий 5, в конечном счете, вызывающие реорганизацию цитоскелета одновременно с де- и повторной сборки фокальной адгезии комплексов и интегрином-опосредованной сигнализации 6.

в пробирке и в естественных условиях миграции клеток анализов были разработаны в последние десятилетия, в том числе Бойден камера / Transwell анализа 7, царапины анализ / заживления ран анализа 8-10, трехмерная ( 3D) коллагеновой матрицы миграции анализ 11, а также прижизненной визуализации / микроскопии (обзор см 12). Каждый из этих миграции клеток анализов имеет плюсы и минусы, например, в отношении расходов и необходимость оборудования, обработки или надежность полученных данных.

И Бойден камера / Transwell анализ и царапины анализ / заживления ран анализ легко, недорогой и хорошо развитые анализы для измерения клеточной миграции в пробирке 7-10. В камере Boyden / Transwell анализов клетки высевают на вершине вставки, содержащий пор (примерно 8 мкм в диаметре) - так называемого верхнего отсека 7. Дополнительно, вставка может быть покрыта внеклеточного мКомпоненты Atrix, например, фибронектин, коллаген и т.д., чтобы имитировать более физиологической среде. Кроме того, эндотелиальные клетки могут быть выращены на верхней части вставки, таким образом, имитируя эндотелиальных клеток барьер 13. Те клетки, которые прошли через поры в течение определенного интервала времени в нижнем отсеке, несущего носители и добавки, такие как факторы роста и хемокины, которые используются в качестве считывания для количественной оценки миграции клеток (или экстравазации).

В царапинам анализа / заживления ран анализов клетки высевают в виде пластин и выращивали до слияния 10. В зависимости от экспериментальных условий пластин может быть предварительно покрыта компонентов внеклеточного матрикса, таких как фибронектин. После создания царапины / раны путем соскабливания Клеточный монослой отдельные клетки с каждой стороны от нуля / рана может мигрировать в зазор, тем самым заполнение / заживления, что 10. Расстояние между двумя сторонами царапины / ран определяетсяв зависимости от времени и используется в качестве считывания для миграционной активности клеток 10. Тем не менее, различать клеточной пролиферации (который также может привести к заправочной / заживления царапин / раны) и миграции клеток рекомендуется сочетать анализ с покадровой видео микроскопия и одна ячейка отслеживания 10.

Однако, как Бойден камера / Transwell анализ и царапин анализ / заживления ран анализа, довольно несовершенное по поводу физиологического типа клеточной среде. В камере Boyden / анализов клетки Transwell должны мигрировать через пластиковую поры, в то время как в пустом анализа / заживления ран опробования клетки высевают на двумерной предварительно покрытых пластиковой пластины. Кроме того, она хорошо известна, что миграционное поведение заметно отличается от двумерной и 3D среде 3. Например, трехмерная-матричные спайки фибробластов отличаться от координационных и фибриллярных спаек, характеризующихся на двамерные субстраты в их содержании α5β1 и V 3 интегринов, паксиллин, других цитоскелета компонентов, и фосфорилирования тирозина фокальной адгезии киназы 14. Точно так же, клетки, встроенные в 3D-среде также отображается измененное миграционное поведение 15. Таким образом проанализировать миграцию клеток точнее миграции анализ целей рекомендуется позволяющая измерять миграцию отдельных клеток в 3D-физиологической или физиологическая-среде.

Прижизненные изображения / микроскопия является золотым стандартом для измерения клеточной миграции в 3D-физиологическом аспекте. Это не только относится к внеклеточным матриксом-клеточных взаимодействий, но и взаимодействий между различными типами клеток, таких как опухолевые клетки и эндотелиальных клеток в течение 16 или экстравазации торговли лимфоцитов в лимфатическом узле 17, который, на сегодняшний день, возможно за счет улучшенные методы флуоресцентной микроскопии, такие как 2-фотонаконфокальной лазерной сканирующей микроскопии, использование жизненно важных красителей и флуоресцентных трансгенных линий мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки производные 12,16,17. Кроме того, прижизненной визуализации / микроскопия может быть в сочетании с ручной и автоматизированной клеток отслеживания 18. Однако, в связи с необходимостью из 2-фотона конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, а также животных (и соответствующих трансгенных животных моделях) прижизненной визуализации / микроскопии является метод довольно дорогостоящим.

Чтобы преодолеть ограничения на Бойдена камеры / Transwell анализа и царапины анализ / заживления ран анализа и анализа миграции различных типов клеток в 3D-среде 3D коллагеновый матрикс миграции был разработан анализ 11,19. Таким образом, мигрирующие клетки, встроенные в 3D сети коллагеновых волокон, которые больше напоминает в в естественных условиях обстановки. Совместно, в связи с покадровой видео микроскопии миграции в реальном клеток измеряется позволяя установнация из нескольких параметров миграции, а также их изменения в ответ на про-миграционных факторов или ингибиторов. Различные типы клеток могут быть проанализированы с помощью этой техники, в том числе лимфоцитов и лейкоцитов, 11,20 / гемопоэтических стволовых клеток-предшественников 21-24 и опухолевых клеток 5,25-29. В дополнение к одиночных клеток также кластеры клеток или сфероидов может быть встроен в коллагеновой матрицы, одновременно с анализом эмиграции отдельных клеток от клеток кластера / сфероида в коллагена решетки 30,31.

Этот протокол представляет обзор о простой, но мощной техники для анализа миграционное поведение различных типов клеток в 3D-среде - методом в пробирке уступая в результатах, которые близки к в естественных условиях ситуации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Подготовка миграции палат

  1. Подготовьте парафин / вазелин (1: 1) смесь и тепла, пока смесь растает. Использование Кисти малярные и привлечь 2-3 слоев парафина / вазелином (1: 1) смешать в середине стекло согласно рис 1B-1D.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем общие предметные стекла (76 х 26 х 1,0-1,5 мм (Ш / Д / В))
  2. Применить расплавленный парафин / вазелин смесь быстро на стекло, чтобы избежать кристаллизации во время рисования. Убедитесь, что слой желе парафиновый воск / петролейный около 2-2,5 см в длину и 0,3-0,5 см в ширину. Толщина желе слоем парафина / петролейный должна быть около 0,1-0,15 см.
  3. Добавить покровное к затвердевший парафин / вазелин смеси и запечатать его с 2:58 слоев твердого парафина / вазелин микс (рис 1E, 1F). Используйте 4-8 миграции камер для эксперимента общей клеточной миграции. Место миграции камеры Iп вертикальное положение в стойке.

2 Подготовка Cell Mix Подвеска коллагена

  1. Урожай (например, с 0,25% Трипсин / ЭДТА) и рассчитывать клетки интерес. Ресуспендируют клеток в полной среде, содержащей фетальной телячьей сыворотки (FCS), антибиотиков и рекомендуемые добавки. Подготовьте 4-8 1,5 мл реакционных труб и 20 мкл клеточной суспензии, содержащей 4-6 × 10 4 клеток (общее число клеток, зависит от типа клеток для анализа) и заполнить до 50 мкл с полной среде.
    Примечание: Дополнительные соединения (например, факторы роста, хемокины, ингибиторы и т.п.) добавляют к суспензии клеток. С помощью соответствующих исходных растворов так, чтобы конечный объем клеточной суспензии не превышает 50 мкл.
  2. Подготовить общую сумму 452 мкл окончательного суспензии коллагена в течение четырех экспериментов миграции клеток. Добавить 50 мкл 10х MEM (рН 5,1-5,5) и 27 мкл 7,5% раствора бикарбоната натрия (рН 9,0-9,5) В 1,5 мл реакционной трубы и тщательно перемешать. Соблюдайте цветовом решении поворот от желто-оранжевого до интенсивного фиолетового (рН 9,0-9,5). Добавить 375 мкл жидкости суспензии коллагена в 10 раз MEM / раствором бикарбоната натрия и тщательно перемешать. РН конечного коллагена суспензии должна быть около 7,5 (обозначено светло-пурпурного цвета).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте рН 7,5% раствора бикарбоната натрия. Если рН около 7,5 местом раствор бикарбоната натрия с открытой крышкой в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2), чтобы быть насыщенной СО 2 и повышения рН (около 9,0 - 9,5). РН коллагена смеси суспензий клеточных имеет решающее значение для стабильности коллагена сети. Если оно слишком низкое коллаген решетка рухнет во время эксперимента миграции клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, использовать жидкий коллаген (рН 1,9-2,2) от бычьего ланью (2,9-3,3 мг / мл коллагена; 95% коллаген типа I, 5% коллаген типа IV). Примеры протоколов подготовки решетки дополнительно коллагена с использованиемколлаген типа I из других источников, таких как свиньи или крысы, приведены в 32,33. Не изменяйте объемы используемых решений, так как это приведет к изменению конечной концентрации коллагена 1,67 мг / мл решетки. Выше или ниже концентрация коллагена влияет на плотность коллагеновых волокон и среднее расстояние между ними сопутствующей с клетками миграционное поведение 34.
  3. Добавить 100 мкл конечного суспензии коллагена к суспензии 50 мкл клеток и смешать thoroughly.The окончательного коллагена суспензии (1,67 мг / мл коллагена) является слегка вязкая. Чтобы передать необходимое количество (100 мкл), пипетки окончательное решение коллагена один раз вверх и вниз, до передачи его в клеточной суспензии.
    Примечание: После того, как смесь коллагена суспензии клеток в сочетании с 10-кратным раствором бикарбоната MEM / натрия и величина рН была изменена на 7,5 коллагеновые волокна сразу же начинают полимеризацию.
  4. Трансфер окончательный микс коллаген суспензии клеток от гое реакционные трубы к миграции камер. Аккуратно нажмите на камеру миграции в равной степени распределить смесь коллагена клеточной суспензии на нижней части камеры миграции (рисунок 1H). Поместите миграции камеры в вертикальном положении в стойке, и инкубируют в течение примерно 30 мин (37 ° С, 5% СО 2), чтобы позволить полимеризацию коллагеновых волокон.
  5. Обратите внимание, что полимеризуется коллаген решетка слегка мутная, но все же светло-фиолетовый цвет. Заполните миграционные камеры с полной среде или полной среде с добавками интересов и запечатать миграции камеру с парафин / вазелином смеси (Цифры 1I, 1J).

3 Запись и анализ миграции клеток

В этом разделе описывается запись миграции клеток путем покадровой видео микроскопии и анализа миграции клеток путем отслеживания ручной клеток.

  1. Включите микроскопом и столик микроскопа слухтер. Регулировка температуры до 37 ° С. Используйте цели 10X. Поместите миграции камеру под микроскопом и сосредоточиться около 50 клеток или более в поле зрения.
  2. Запись миграции клеток в режиме покадровой помощью программного приложения видеонаблюдения с нескольких камер. Сохранить миграции клеток фильмы в соответствующем формате, например, "* .avi" или "* .mov". Ссылка файлов миграции клеток ролика в базе данных, содержащей вспомогательную информацию, например, типа клеток и экспериментальных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы записываем лимфоциты и HSPCs до 2 часов с использованием коэффициента покадровой 1:80, что означает, что 0,75 сек в покадровой равна 1 мин в режиме реального времени. Опухолевые клетки медленно движущихся клетки и, таким образом, записал, по крайней мере 16 часов, используя коэффициент покадровой 1: 1800 (0,5 сек в покадровой равна 15 мин в режиме реального времени).
  3. Анализ миграции клеток фильмы помощью соответствующего программного обеспечения приложение отслеживания клеток, как программных плагинов ImageJ(Обзор приведен в 18). Для непредвзятого анализа имеет решающее значение, что клетки будут случайным образом выбраны без ведома клетки являются ли миграционная активным или нет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем самостоятельно разработанные приложения программного обеспечения вручную отслеживать пути не менее 30 клеток на эксперименте, следуя движущихся клеток точно с помощью курсора мыши (который расположен к ядру). Хотя отслеживание, ху координаты гусеничных клеток определяются автоматически в соответствии с режимом, используемым покадровой. Для лимфоцитов / HSPCs ху-координаты определяются каждый 0,75 сек (равный 1 мин реальном времени), в то время как для опухолевых клеток ху координаты определяются каждый 0,5 сек (равный 15 мин реальном времени).
  4. Определите в общей сложности 60 XY-координат в ячейке для типичного эксперимента миграции клеток. Это равно 1 ч в режиме реального времени для лимфоцитов / HSPCs и 15 ч в режиме реального времени для опухолевых клеток. "," Указывает на то, что клетки не перемещается между TWо временных точек, в то время как "числового значения" указывает расстояние в "пикселей" клетка перемещают между 2 временных точках (Рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: отслеживание Руководство клеток требуется опыт. Особенно быстро мигрирующие клетки трудно отследить и каждый тип клеток экспонат отличается миграционное поведение, что может быть вызвано, дополненных факторов. В случае деления клеток, при движении камеры, случайным образом выбирать один дочерней клетки для продолжения отслеживания. Клетки, которые мигрируют из смотрового поле или умереть в то время как отслеживание не пренебречь, но считаются для анализа.

Анализ 4. данных

  1. Анализ данных отслеживания клеток с использованием соответствующего программного приложения, например, электронные таблицы.
    1. Анализ данных отслеживания клеток путем копирования ячейку отслеживания необработанных данных (Рисунок 2А), в собственной разработки шаблона электронной таблицы. Умножьте сумму "числовыми значениями", представляющиеобщее расстояние клеток мигрировал с поправочный коэффициент для преобразования "пиксель" в "мкм".
    2. Определите два параметра миграции клеток: двигательную активность (что эквивалентно скорости миграции) и время активного движения (рис 2в, 2г).
    3. Определение клеток, которые мигрировали меньше, чем 25 мкм (пороговый уровень, чтобы уменьшить количество ложно-положительных клеток) в качестве неподвижных клеток. Заменить "числовые значения» этих клеток с ",".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметр "двигательной активности" (или скорость миграции) представляет собой процент клеток отслеживаемой клеточной популяции, которые перешли между двумя точками времени (Рисунок 2D). "Числовое значение" определяется как движущейся клетки, в то время как "," определяется как не движется клетки. Параметр "время активного движения" (время активно) представляет собой процент от общего времени клетка перекочевал в ренодательство в сроки от периода наблюдения (Рисунок 2C). "Числовое значение" указывает на то, что клетка переместилась, в то время как "," указывает на то, что клетки не перемещается. Этот параметр используется в дальнейшем для определения количества клеток, которые еще не перешли.
  2. Рассчитать статистической значимости и миграционных данных БС.
    1. Расчет статистической значимости средней двигательной активности клеток (скорость миграции) с использованием теста Манна-Уитни U. Рассмотрим р-значение <0,05 как значительное.
    2. Дисплей среднего двигательную активность клеток, как ху-диаграммы, BoxPlot схемы или в виде гистограммы диаграмме. Дисплей данные одноклеточные основе, такие как время активного движения или скорость, в виде гистограммы схеме или в виде гистограммы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбранный редактор электронных таблиц программа не содержит BoxPlot диаграммы или гистограммы диаграммы инструмент онлайн поиск должен быть проведен в течение ищете подходящего ТУtorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используется 3D-коллагеновый матрикс анализа миграции в сочетании с покадровой видео-микроскопии и отслеживания клеток с помощью компьютера позволяет для определения различных параметров миграции клеток в том числе как параметра населения на основе (например, средней двигательной активности) и отдельных параметров на основе клеток (например, время активного движения, скорость, расстояние мигрировали). Пример полученных наборов данных слежения клеток, обработки данных и представления данных приведены на рисунке 2. Ячейка отслеживания файл данных напоминает таблицы (рисунок 2А). Каждая колонка стоит в течение одного гусеничного клетки, в результате чего на эксперимент клеточной миграции 30 клетки отслеживаются. Строки содержит информацию, был ли клетка перемещается или не между двумя точками времени. Сумма «числовых значений», представляющих расстояние в "пикселя" клетке переехал между двумя точками времени, является общее расстояние эта ячейка мигрировала. Это умножается на переменном токеКоэффициент orrection преобразовать "пиксель" в "мкм". Клетки, которые мигрировали меньше, чем 25 мкм, определяются как неподвижные клетки, чтобы уменьшить количество ложно-положительных клеток. Скорость (мкм / мин) каждой ячейки вычисляется путем деления "общее расстояние мигрировал" на "общее время (мин) периода наблюдения".

Для характеристики двигательной поведение клеток обычно используются два параметра. Двигательной активности (рисунок 2D) представляет собой среднее двигательной активности (или) скорость миграции из анализируемой популяции клеток, в то время как время активного движения (фиг.2С) представляет собой общее время клетки мигрировали в течение периода наблюдения. Последний параметр в дальнейшем используется для определения количества клеток, которые еще не перешли. Причина использования двух параметров миграции клеток для анализа объясняется тем, что двигательной активности клеток могут быть вызваны differeмеханизмы NT. Есть три возможности, как, например, фактор роста, может "побудить" миграцию клеток: а) по сравнению с контролем больше клеток, мигрирующих, б) количество перемещении ячеек по сравнению с контролем не изменилась, но фактор роста лечение клетки проявляют повышенную время активного движения, что означает, что эти клетки будут мигрировать в течение более длительного времени, и в) сочетание а) и б).

Диаграмма на фиг.2В схематично иллюстрирует, как двигательной активности и время активного движения вычисляется. В этом примере отображаются перелетные деятельность 120 клеток (что равно четырем независимых экспериментов). Каждый бриллиант указывает, что клетка переместилась между по меньшей мере двумя точками времени (независимо от расстояния клетка мигрировал!). Серые линии были добавлены к этой диаграмме, чтобы показать, что анализируемый популяция клеток состоит из подвижной и неподвижных клеток. Параметр "locomotory активность "обозначает двигательной активности анализируемого клеточной популяции в зависимости от каждой временной точки (рисунок 2D). Например, двигательной активности 10% при Т = 5 часов означает, что между Т = 4,45 ч и т = 5 ч 10% из проанализированных клеток переехали. Когда отображается в виде ху диаграмме параметр двигательной активности указывает на динамичность анализируемого клеточной популяции. Другая возможность для отображения двигательной активности клеточной популяции является BoxPlot схема (Рисунок 2F).

Параметр "время активного движения" (время активно) коррелирует с общим временем клетка переместилась в течение периода наблюдения, в результате чего время активе "0" означает, что ячейка не переехал (Рисунок 2C). Время активного клеток могут быть отображены в виде гистограммы.

Взаимодействие EGFR / HER2 / PLC-γ1 и HER2 / HER3 / сигнализации PI3K способствуетмиграционная фенотип EGFR / HER2 / HER3 раковых клеток положительный рак молочной железы 25. PI3K сигнализации требуется для генерации фосфатидил-3,4,5-трифосфата (PIP3), который действует как молекулы анкер для PLC-1, таким образом, на работу этого фермента к плазматической мембране должен быть активирован с помощью рецепторных тирозинкиназ 35. Стимуляция исключительно EGFR положительных MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) клеток рака молочной железы в результате долгосрочного PLC-γ1 фосфорилирования тирозина, одновременно с устойчивым IP3 и уровней DAG производящих синусоидальные колебания кальция 27. В отличие от этого, EGFR / HER2 положительные MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) клетки рака молочной железы отображается базовых переходных колебаний кальция после обработки EGF за счет краткосрочной PLC-γ1 активации тирозин и краткосрочной IP3 и DAG оборота 27 с указанием что выражение HER2 коррелировала с дифференциальным PLC-γ1 кинетики и сигнализации.

Анализ миграционного поведения MDA-HER2 и MDA-NEO линии клеток рака молочной железы показало, что оба клеточные линии выставлены подобный спонтанный двигательной активности (MDA-HER2: 23,0 - 28,9%, средний: 26,7% против MDA-NEO: 19,3 - 24,4%, средней: 21,5%; 3А-3D ). Время активного параметр, представляющий время активного движения отдельных клеток в отношении периода наблюдения, показали слегка большее количество подвижных самопроизвольно MDA-HER2 клеток (64%; рис 3E) по сравнению с MDA-NEO клеток рака молочной железы ( 53%; Рисунок 3F). Стимуляция с 100 нг / мл ЭФР привело к значительному увеличению двигательной активности обеих клеточных линий. Миграционной активности EGF обрабатывают MDA-HER2 повышают до 30,4 - 35,2% (в среднем 33,7%; 3А, 3С), что объясняется как увеличением числа подвижных элементов (100 нг / мл EGF: 81% по сравнению с контролем: 64%) и увеличение времени активного движения. Например, количество MDA-HER2 клетки, обладающие время активно в 40%увеличилась с 20% (контроль) до 28% (100 нг / мл EGF). Аналогичные данные были получены для MDA-NEO клеток рака молочной железы, которые миграционной активности был увеличен до 25,2 до 35,2 (в среднем 30,4%, рис 3B, 3D) при ЭФР стимуляции. Совместно, больше MDA-NEO клетки мигрировали в ответ на стимуляцию EGF (100 нг / мл ЭФР: 66% по сравнению с контролем: 53%) и отображается в сдвинуты времени активный шаблон (рисунок 3F). Например, количество клеток, обладающих время активное 60% было заметно возросло до 30% в присутствии EGF по сравнению с необработанными MDA-NEO-клеток (13%).

Лечение MDA-HER2 и MDA-NEO клеток рака молочной железы с ПЛК-γ1 ингибитора U73122 привело к ингибированию как спонтанной, и EGF индуцированной миграции клеток (Фигура 3А-D). Тем не менее, по сравнению с MDA-NEO клеток рака молочной железы ингибирующий эффект U73122 на спонтанную миграцию МДА-HER2 клеток была довольно умеренной, но тем не менеезначительное (контроль: 23.0-28.9%, средний: 26,7% против 2 мкМ U73122: 17.8-21.5%, средний: 20,0%; 3С). Анализ времени активного параметра показал слегка повышенное количество неподвижных клеток в присутствии U73122 (контроль: 36% по сравнению с 2 мкМ U73122: 48%; рис 3E). Кроме того, лечение U73122 блокировали EGF, индуцированную миграцию MDA-HER2 клеток рака молочной железы (100 нг / мл EGF: 30.4-35.2%, медиана 33,7% против 100 нг / мл EGF + 2 мкМ U73122: 19.3-24.1%, средний 22,6 %; фиг.3С). В соответствии с исключительно U73122 обрабатывают MDA-HER2 клетки этом ингибирующее действие было достаточно обусловлено увеличением количества неподвижных клеток, но не измененное время активно шаблон (рисунок 3C). В самом деле, небольшое смещение в сторону повышенной время активного движения был обнаружен в переходе MDA-HER2 клетки лечат с EGF и U73122 (3C) Рис.

В отличие от этого, Лечение MDA-NEO клеток с 2 мкМ U73122 привело заметно снизилась двигательную активность 5,6 до 10,7% (медиана: 9,3%; Рисунок 3F), что в первую очередь обусловлено увеличением количества неподвижную клетки (контроля: 47% против 2 мкМ U73122: 79%; Рисунок 3F). Кроме того, ЭФР индуцированной миграции MDA-NEO клеток рака молочной железы было значительно блокирован U73122 до 1,1 до 7,4% (медиана: 4,8%), что было обусловлено увеличением количества неподвижных клеток (100 нг / мл ЭФР: 34 % по сравнению с 100 нг / мл EGF, + 2 мкМ U73122: 70%), а также к уменьшению времени активного шаблон (рисунок 3F).

Рисунок 1
1. Схема обзор подготовки миграции клеток камер. (AE) миграция клеток камера подготовленный рисунок 2:58 слои расплавленного paraffiн воск / вазелин смешать на предметное стекло. (F, G) добавил Покровное и скреплено расплавленный парафин / вазелином смеси. (H) Миграция камера ставится в вертикальном положении с последующим добавлением коллагена-клетку подвеска. Впоследствии миграции камера помещают в термостат, позволяющий коллаген-клеточную суспензию для полимеризации. (I, J) миграции камера заполнена до со средствами массовой информации и скреплено расплавленный парафин, / вазелин смеси на четвертой стороне. После этого, миграционные камеры размещаются под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. схематический обзор анализа данных о миграции клеток. () Файла данных отслеживания сотовый. Чте перелетные деятельность 30 ячеек определяется на эксперимент, в котором анализируются 60 временных точек. "," Указывает на то, что клетки не перемещается между двумя точками, в то время как "числовое значение" указывает на движение клеток. (В) Эта диаграмма представляет собой схематический вид из данных, представленных в (А). Каждый бриллиант указывает на то, что был перемещен между двумя моментами времени; линия указывает длительный движение. Серые линии были включены, чтобы визуализировать, что популяция клеток состоит из неподвижных и движущихся клеток клетки (которые, однако, сделать паузы). (С) Время активного движения (время активный) представляет собой процент от общего времени клетка имеет мигрировали в отношении к общему времени периода наблюдения. Время активное 20% и общем времени от 15 ч показывает, что эта клетка переместилась в общей сложности в течение 3 часов. Этот параметр дополнительно используется для определения количества неподвижных клеток, что эквивалентно времени активного 0%. (D) (E) С другой стороны, двигательной активности анализируемых клеток могут отображаться в виде диаграммы BoxPlot. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис.3 Типичные миграции клеток данные MDA-HER2 и MDA-NEO клеток рака молочной железы. Клетки обрабатывали 100 нг / мл EGF, 2 мкМ U73122 или с CO mbination того и другого. (А, В) Среднее двигательной активности МДА-HER2 (А) и MDA-NEO (B) клеток в зависимости от времени. (С, D) BoxPlot схема средней двигательной активности, представляющий 2 ч, чтобы 13 ч интервал времени (см бар в (A, B)) в MDA-HER2 (C) и MDA-NEO (D) клеток. Статистическая значимость была рассчитана с использованием -test Манн-Whitney- U. *** = Р <0,001. (E, F) Гистограмма времени активного из MDA-HER2 (E) и MDA-NEO (F) клеток. Время активного 0% означает, что клетки не переехал в период наблюдения. Совместно, время активных из 20% означает, что, с учетом периода наблюдения 15 часов, эти клетки переместились на срок до 3 часов. Показаны средние по меньшей мере, в трех независимых экспериментах.пустой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способность мигрировать является отличительной чертой опухолевых клеток 4. Без способности отделить от первичной опухоли и мигрировать через окружающие соединительной ткани опухолевых клеток не будет возможности раздавать вторичных поражений, которые являются основной причиной смерти почти всех больных раком. Из этого отношения многие исследования сосредоточены на миграции раковых клеток. Целью этих исследований является выявление новых молекул-мишеней и целевых путей, которые эффективно блокируют миграцию опухолевых клеток, тем самым ухудшая или замедления образования метастазов. Примером таких усилий может быть β-блокаторы, которые были показаны, чтобы препятствовать метастазирование клеток рака молочной железы в пробирке и в естественных 36 и которые были связаны с улучшенным безрецидивной выживаемости у больных с тройным негативным груди раковые клетки 37. Недавно мы показали, что гибридные клетки, полученные из которых SpontaneOUS события слияния между человеческим линии груди эпителиальных клеток и человеческой линии клеток рака молочной железы, однако не имеет родительских клеток, ответил на хемокинов CCL21 с повышенным миграционной активности 26. CCL-21 была связана с образованием метастазов в лимфатических узлах различных типов рака молочной железы, в том числе 38, предполагая, что слияние клеток может представлять собой процесс, как опухоли (гибридное) клетки могут приобрести метастатических свойств 39,40.

3D коллагеновый матрикс миграции анализ имеет несколько преимуществ по сравнению с Бойден камеры / Transwell анализа и царапинам анализа / заживления раны анализа. Во-первых, клетки встроены в 3D-физиологической среде. Как указано выше, миграционное поведение клеток заметно отличается между двумерной и 3D среде 3,14,15. Таким образом, можно сделать вывод, что миграционное поведение клеток встраиваться в 3D коллагена решетки напоминает больше к ситуации в естественных условиях, чем locomotory активность клеток, ползающих на двумерной поверхности. Во-вторых, в связи с покадровой записи видео можно анализировать миграцию нескольких клеток в течение определенного периода времени, что позволяет определить различные параметры миграции клеток. В отличие от этого, в камере Boyden / Transwell анализа только те клетки, которые рассматриваются для анализа, которые перемещен в нижнее отделение. Те клетки, которые мигрируют, например, в верхней части мембраны не включены в анализ данных, даже если они являются мигрирующими активным.

Коллагеновый матрикс 3D могут быть объединены с микрофлюидальных устройств, которые в дополнение к имитации внеклеточный матрикс действительно также имитировать интерстициальной жидкости, которая, как было показано, чтобы влиять на морфологию и миграцию различных типов клеток, таких как фибробласты, раковые клетки, эндотелиальные клетки , и мезенхимальные стволовые клетки 41. Данные Haessler и соавт. Показали, что интерстициальный потока увеличивает процентклеток, которые становятся перелетных, а также увеличивает миграционный скорость примерно в 20% клеток 42. Кроме того, чтобы изучить хемотактическую поведение клеток, например, лейкоцитов / лимфоцитов или опухолевых клеток, 3D Микрожидкостных установка также является подходящим инструментом для изучения опухолевых клеток intravasation и эндотелия барьерную функцию 43.

Несмотря на то, 3D-коллагеновый матрикс анализа миграции является подходящим инструментом для анализа миграции клеток в ответ на стимул, или в качестве ингибитора или в комбинации того и другого он имеет Следует отметить, что этот анализ делают также имеет некоторые недостатки. Например, только коллаген типа I используется для имитации внеклеточного матрикса, которые, однако, представляет собой сложную смесь из нескольких компонентов, в том числе протеогликаны, не являющихся протеогликанов (например, гиалуроновая кислота), коллагеновых волокон, а также фибронектин и ламинин и которые Кроме того, композиция изменяется значительно между различными соединительной ткани в различных органах 45 одновременно с дифференциальным результата. Например, β1-интегрина стимуляция вызвало активацию ERK в моноцитов в то время как β2-стимуляция сделал не 46. Точно так же, PI3K требовалось для β1-integrin-, но не β2-integrin-, опосредованной NF-kB активации 46. С другой стороны, коллаген типа I является наиболее распространенным коллагена в организме человека 47 предполагая, что миграция клеток, главным образом, вызваны этой коллагена типа.

Другим важным моментом в расшифровке клеток миграционной активности является процедура отслеживания клеток. Для получения достоверной и объективной информации является обязательным, что путь отдельных клеток анализируется точно. Отслеживать сотового выполняется вручную вручную, что требует отслеживания сотовый опытполучить объективные данные. Для дальнейшего улучшения данных и избежать критической количество ложных положительных клеток мы используем уровень отсечки 25 мкм, что означает, что клетки, которые мигрировали меньше, чем 25 мкм, были исключены из анализа данных. Кроме того, клетки выбраны случайным образом для отслеживания без знания, являются ли они мигрирующих активным или нет, чтобы избежать смещенные данные.

В течение последних лет несколько автоматизированные отслеживания сотовый программные приложения были разработаны, в результате чего некоторые из них пригодны для анализа клеток и отслеживание частиц в 3D установка 18. Преимущество таких приложений является то, что мигрирующие клетки действительно анализировали на объективной основе. В связи с этим было бы интересно сравнить автоматизированные отслеживания данных клеток с вручную сделанных отслеживания данных клеток.

Как упоминалось выше, золотой стандарт для анализа миграции клеток в пределах физиологической 3D контексте является использование прижизненной визуализации в сочетании Wiй 2-фотона лазерного сканирования конфокальной микроскопии. Преимущество этого анализа состоит в том, мигрирующие клетки встроены в их физиологической среде, состоящей из конкретных растворимых факторов, гормонов и т.д., компонентов внеклеточного матрикса, а также от клетки к клетке-взаимодействий. Примечательно, чтобы увидеть фильмы, показывающие, как лимфоциты с торговлей людьми в лимфатического узла 17, как иммунные клетки общаются друг с другом 48 или, как наркотики распространяются в естественных условиях на уровне одной клетки 12,49.

Тем не менее, прижизненной визуализации в сочетании с 2-фотонов лазерного сканирования конфокальной микроскопии является метод, а экономически дорого в связи с необходимостью соответствующего микроскопа и соответствующих животных моделях. Кроме того, она не совсем подходит для изучения влияния отдельных растворимых факторов / ингибиторов на миграцию конкретных клеток или анализа клеток миграции, связанные передачи сигнала каскадов. Для этих целей клеточных миGration анализы рекомендуется позволяя анализ дискретных типов клеток, которые могут быть дополнительно модифицированы, например, повышенной экспрессией или нокдаун молекул-мишеней, в определенных экспериментальных условиях. В связи с ключевой взаимосвязи между 3D-среде и опорно-двигательного поведения клеток мы заключаем, что 3D коллагеновый матрикс анализа миграции, таким образом, универсальный метод для изучения миграции клеток в обстановке в пробирке, что близко к в естественных условиях ситуации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

Биоинженерия выпуск 92 миграции клеток 3D коллагеновый матрикс отслеживания клеток
Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter