Summary
Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.
Abstract
Het vermogen om te migreren is een kenmerk van verschillende celtypes en speelt een cruciale rol in verscheidene fysiologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, en immuunresponsen. Echter, celmigratie is ook een belangrijk mechanisme bij kanker waarmee dit kankercellen los van de primaire tumor metastatische verspreiding starten. In de afgelopen jaren verschillende celmigratie assays ontwikkeld om het migratiegedrag van verschillende celtypen analyseren. Omdat het motorisch gedrag van cellen sterk verschilt tussen een tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) omgeving kan worden aangenomen dat de analyse van de migratie van cellen die zijn ingebed in een 3D omgeving oplevert in significantere celmigratie data. Het voordeel van de beschreven 3D collageenmatrix migratietestsysteem is dat cellen worden ingebed bij een fysiologische 3D netwerk van collageenvezels die de belangrijkste component van de extracellulaire matrix. Doortime-lapse microscopie video real celmigratie gemeten waarbij het bepalen van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, waaronder lymfocyten / leukocyten, stamcellen en tumorcellen. Evenzo kan ook celgroepen of bolvormige deeltjes worden ingebed in de collageen matrix gelijktijdig met de analyse van de emigratie van enkele cellen uit de cel cluster / spheroid in de collageen rooster. We concluderen dat de 3D collageenmatrix migratie assay is een veelzijdige methode om de migratie van cellen te analyseren in een fysiologisch-achtige 3D-omgeving.
Introduction
Like celfusie (voor een overzicht zie 1,2) celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een grote verscheidenheid aan fysiologische processen zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing en immuunresponsen (voor review zie 3). Echter, het vermogen om te migreren is een voorwaarde voor tumorcellen uitzaaien (voor review zie 3,4).
Cel migratie een complex, nog volledig begrepen proces dat wordt geleid door de wisselwerking van verschillende signaaltransductieroutes geïnitieerd door verschillende ligand (bijvoorbeeld cytokines, chemokines, groeifactoren, hormonen, extracellulaire matrixcomponenten) receptor (bijvoorbeeld receptor tyrosine kinases, chemokine-receptoren, integrines) interacties 5 uiteindelijk veroorzakend de reorganisatie van het actine cytoskelet gelijktijdig met de- en hermontage van focale adhesie complexen en integrine-gemedieerde signalering 6.
in vitro en in vivo celmigratie testen analyseren ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van de Boyden kamer / transwell assay 7, scratch test / wondgenezende assay 8-10, drie-dimensionale ( 3D) collageenmatrix migratie assay 11 evenals intravitale beeldvorming / microscopie (voor een overzicht zie 12). Elk van deze cel migratie assays heeft voor-en nadelen, bijvoorbeeld met betrekking tot de kosten en de behoefte van de apparatuur, het hanteren of de betrouwbaarheid van de verkregen gegevens.
Zowel de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezende assay gemakkelijk, goedkoop en goed ontwikkelde assays celmigratie gemeten in vitro 7-10. In de Boyden kamer / transwell assay cellen worden bovenop een insert met poriën (ongeveer 8 micrometer in diameter) - de zogenaamde bovenste compartiment 7. Optioneel, kan het inzetstuk worden bekleed met extracellulaire matrix componenten, bijvoorbeeld fibronectine, collageen, etc., om een fysiologische omgeving nabootsen. Evenzo kan endotheelcellen worden gekweekt boven het inzetstuk, waardoor een endotheliale barrière 13 nabootsen. Die cellen die gedurende een bepaalde tijdsinterval in het onderste compartiment herbergen media en supplementen, zoals groeifactoren en chemokinen doorgegeven via de poriën, worden gebruikt als een uitlezing celmigratie (of extravasatie) kwantificeren.
In de scratch test / wondgenezing assay cellen worden gezaaid in platen en zijn uitgegroeid tot samenvloeiing 10. In afhankelijkheid van de experimentele setting platen kunnen vooraf worden bekleed met extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine. Nadat een kras / ontbonden door schrapen celmonolaag enkele cellen van elke kant van de kras / wond kan migreren in de spleet, waardoor het vullen / genezing te 10. De afstand tussen de twee kanten van de kras / wonden wordt bepaaldafhankelijk van de tijd en wordt gebruikt als een uitlezing voor het trekkende activiteit van de cellen 10. Echter, onderscheid maken tussen celproliferatie (die ook kan leiden tot het vullen / genezing van de kras / wond) en celmigratie wordt aanbevolen de assay te combineren met time-lapse microscopie en video cel volgen 10.
Zowel de Boyden kamer / transwell test en scratch test / wondgenezende assay, zijn eerder onvolmaakte over een fysiologische-achtige cellulaire omgeving. In de Boyden kamer / transwell assay cellen migreren door een plastic porie, terwijl in de scratch test / wondgenezende assay cellen worden op een twee-dimensionale pre-gecoate kunststoffen plaat. Zo wordt ook goed ingezien dat het migratiegedrag aanzienlijk verschilt tussen een tweedimensionale en 3D-omgeving 3. Bijvoorbeeld, drie-dimensionale matrix adhesies fibroblasten verschillen van focale adhesies fibrillair kenmerkt tweedimensionale substraten in de inhoud van α5β1 en avß3 integrines, paxillin, andere cytoskelet componenten, en tyrosine fosforylering van focal adhesion kinase 14. Evenzo cellen ingebed in een 3D-omgeving getoond ook een veranderde migratiegedrag 15. Aldus celmigratie analyse nauwkeuriger een migratietestsysteem wordt aanbevolen zodat de migratie van afzonderlijke cellen in een 3D fysiologisch of fysiologisch-achtige omgeving meten.
Intravitaal imaging / microscopie is de gouden standaard voor het meten van celmigratie in een 3D fysiologische context. Dit geldt niet alleen tot extracellulaire matrix-cel interacties, maar ook om de interacties tussen verschillende celtypen zoals tumorcellen en endotheelcellen tijdens extravasatie 16 of lymfocyttransport binnen de lymfeklier 17, die tot op heden mogelijk, als gevolg verbeterde fluorescentie microscopie, zoals 2-photonconfocale laser scanning microscopie, het gebruik van vitale fluorescente kleurstoffen en transgene muizenstammen expressie fluorescerende eiwitten derivaten 12,16,17. Daarnaast kan intravitale beeldvorming / microscopie worden gecombineerd met handmatige en geautomatiseerde cel bijhouden 18. Vanwege de noodzaak van een 2-foton confocale laser scanning microscopie en dieren (en geschikte transgene diermodellen) intravitale beeldvorming / microscopie is een nogal dure techniek.
Om de beperkingen van de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezing assay overwinnen en de migratie van verschillende celtypen te analyseren in een 3D-omgeving 3D collageenmatrix migratie assay ontwikkeld 11,19. Daarbij migreren cellen ingebed in een 3D collageenvezelnetwerk, die meer lijkt op de in vivo situatie. Gezamenlijk, als gevolg van time-lapse video microscopie echte cel migratie wordt gemeten zodat de VASTSTELLInatie van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, zoals lymfocyten en leukocyten 11,20, hematopoëtische stam / progenitorcellen 21-24 en tumorcellen 5,25-29. Naast enkele cellen ook clusters cel of sferoïden kunnen worden ingebed in de collageen matrix samenvalt met de analyse van de emigratie van afzonderlijke cellen van de cel cluster / sferoïde in het collageen rooster 30,31.
Dit protocol geeft een overzicht van een eenvoudige maar krachtige techniek het migrerende gedrag van verschillende celtypes in een 3D-omgeving te analyseren - een in vitro methode die in de resultaten die dicht bij de in vivo situatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van Migratie Chambers
- Bereid een paraffine / petroleum jelly (1: 1) mengsel en verhit tot het mengsel is gesmolten. Met een penseel en teken 2-3 lagen van de paraffine / petroleum jelly (1: 1) meng het midden van het glaasje volgens de figuren 1B-1D.
LET OP: Wij maken gebruik van gemeenschappelijke glas dia's (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) - Breng de gesmolten paraffine / vaseline mix snel op het glaasje om stolling te voorkomen tijdens het tekenen. Zorg ervoor dat de paraffine / vaseline laag ongeveer 2-2,5 cm lang en 0,3-0,5 cm in de breedte. De dikte van de paraffine / vaseline laag moet ongeveer 0,1-0,15 cm.
- Voeg een dekglaasje aan de gestolde paraffine / vaseline mix en verzegelt het met 2-3 lagen paraffine / vaseline mix (figuren 1E, 1F). Gebruik 4-8 migratie kamers voor een gemeenschappelijke cel migratie experiment. Plaats migratie kamers in rechtop in een rek.
2 Voorbereiding van het Collageen Suspension Cell Mix
- De oogst (bijvoorbeeld met 0,25% trypsine / EDTA) en tel cellen van belang. Resuspendeer de cellen in compleet medium bevattende foetaal kalfsserum (FCS), antibiotica en aanbevolen supplementen. Bereid 4-8 1,5 ml reageerbuisjes en 20 ui celsuspensie met 4-6 x 10 4 cellen (het totale aantal cellen afhankelijk van het celtype te analyseren) en vul tot 50 gl met complete media.
OPMERKING: Aanvullende verbindingen (bijvoorbeeld groeifactoren, chemokinen, inhibitors, etc.) worden toegevoegd aan de celsuspensie. Gebruik geschikte voorraadoplossingen zodanig dat het eindvolume celsuspensie niet meer dan 50 pl. - Bereid een totaal bedrag van 452 ul laatste collageen schorsing voor vier cel migratie-experimenten. Voeg 50 gl 10x MEM (pH 5,1-5,5) en 27 gl 7,5% natriumbicarbonaat (pH 9,0-9,5) Naar een 1,5 ml reageerbuis en meng. Let op de kleur van de oplossing turn van geel-oranje tot intens paarse (pH 9,0-9,5). Voeg collageensuspensie 375 ul vloeistof aan de 10x MEM / natriumbicarbonaat-oplossing en meng. De pH van de uiteindelijke collageen suspensie moet ongeveer 7,5 zijn (aangegeven door een licht paarse kleur).
OPMERKING: Controleer de pH van de 7,5% oplossing van natriumbicarbonaat. Als de pH ongeveer 7,5 plaats natriumbicarbonaat oplossing met open deksel in een incubator (37 ° C, 5% CO2) om met CO2 verzadigd en verhoog de pH (ongeveer 9,0-9,5). De pH van collageen suspensie celmengsel is cruciaal voor de stabiliteit van het collageen netwerk. Als het te lage collageenrooster stort tijdens de celmigratie experiment.
LET OP: Voor dit protocol, vloeibare collageen (pH 1,9-2,2) van runderen achterpoten (2,9-3,3 mg / ml collageen; 95% collageen type I, 5% collageen type IV). Voorbeelden van verdere collageenrooster bereiding protocollen gebruiktType I collageen uit andere bronnen, zoals varkens en ratten, zijn in 32,33. Laat het volume van de gebruikte oplossingen niet veranderen omdat dit de ultieme collageen concentratie van 1,67 mg / ml van het rooster zal veranderen. Een hogere of lagere concentratie collageen invloed van de dichtheid van collageenvezels en de gemiddelde afstand tussen gelijktijdig met de cellen migratiegedrag 34. - Voeg 100 ul van de uiteindelijke collageen schorsing tot 50 pi celsuspensie en meng thoroughly.The laatste collageen suspensie (1,67 mg / ml collageen) is licht viskeuze. Om de juiste hoeveelheid (100 pl) overdragen, pipet de laatste collageen oplossing een keer op en neer voordat de overdracht aan de celsuspensie.
Opmerking: Als de collageensuspensie celmengsel wordt gecombineerd met de 10x MEM / natriumbicarbonaatoplossing en de pH waarde is veranderd naar 7,5 de collageenvezels onmiddellijk beginnen te polymeriseren. - Breng de laatste collageen schorsing cel mix van the reageerbuisjes de migratie kamers. Tik de migratie kamer gelijkelijk verdelen de collageensuspensie celmengsel aan de onderkant van de migratie kamer (Figuur 1H). Plaats de migratie kamers rechtop in een rek en incubeer gedurende ongeveer 30 min (37 ° C, 5% CO2) om polymerisatie van de collageenvezels mogelijk.
- Merk op dat de gepolymeriseerde collageenrooster enigszins troebel maar nog steeds licht paarse kleur. Vul de migratie kamers met compleet medium of compleet medium met supplementen van belangstelling en sluit de migratie kamer met paraffine / vaseline mix (figuren 1I, 1J).
3 Registratie en analyse van cel-migratie
Deze paragraaf beschrijft de opname van de cel migratie door time-lapse video microscopie en analyse van de cel migratie door handmatige cell tracking.
- Schakel de microscoop en de microscoop podium heater. Breng de temperatuur op 37 ° C. Gebruik een 10X objectief. Plaats migratie kamer onder een microscoop en zich ongeveer 50 cellen of meer in het gezichtsveld.
- Record cel migratie in time-lapse-modus met behulp van een multi-camera video surveillance software. Spaar cel migratie films in een geschikt formaat, bijvoorbeeld "* avi" of "* .mov". Koppel de celmigratie filmbestanden een database met ondersteunende informatie zoals celtype en de testomstandigheden.
OPMERKING: We opneemt lymfocyten en HSPCs tot 2 uur met een time-lapse factor 1:80, waardoor 0,75 sec in time-lapse gelijk aan 1 min in real-time. Tumorcellen zijn traag bewegende cellen en dus genoteerd voor ten minste 16 uur met een time-lapse factor 1: 1800 (0.5 sec in time-lapse gelijk aan 15 min in real-time). - Analyseer cel migratie films met behulp van een geschikte cell tracking software applicatie, zoals ImageJ software plugins(Een overzicht wordt gegeven in 18). Voor een onpartijdige analyse is het van cruciaal belang dat de cellen willekeurig worden geselecteerd zonder de kennis of de cellen zijn trekvogels actief is of niet.
OPMERKING: We gebruiken een zelf ontwikkelde softwaretoepassing om de paden van ten minste 30 cellen per experiment handmatig volgen door de bewegende cellen nauwkeurig met de muiscursor (die is gepositioneerd om de kern). Wanneer volgen, worden de xy-coördinaten van de bijgehouden cellen automatisch bepaald in overeenstemming met de gebruikte time-lapse mode. Voor lymfocyten / HSPCs xy-coördinaten worden bepaald elke 0,75 sec (gelijk aan 1 min realtime), terwijl voor de tumorcellen van de xy-coördinaten worden bepaald elke 0,5 seconde (gelijk aan 15 min realtime). - Bepaal totaal 60 xy-coördinaten per cel voor een typische celmigratie experiment. Dit is gelijk aan 1 uur real time voor lymfocyten / HSPCs en 15 uur real-time tumorcellen. A "," aan dat een cel niet is overgegaan tussen two tijdstippen, terwijl een "numerieke waarde" geeft de afstand in "pixels" een cel is verhuisd tussen 2 tijdstippen (Figuur 2A).
OPMERKING: Manual cell tracking vereist ervaring. Bijzonder snel migrerende cellen zijn moeilijk op te sporen en elk celtype vertonen een uitgesproken trekkende gedrag dat zou kunnen worden veroorzaakt door factoren aangevuld. In het geval van de celdeling, terwijl het bijhouden van, willekeurig kiest een dochter cel voor de voortzetting van tracking. Cellen die migreren uit het zicht veld of sterven, terwijl het bijhouden van zijn niet verwaarloosd, maar worden beschouwd voor analyse.
4 Data Analysis
- Analyseer cell tracking data met behulp van een geschikte softwaretoepassing, bijvoorbeeld een spreadsheet programma.
- Analyseer cell tracking data door het kopiëren van de cel volgen ruwe data (Figuur 2A), in een zelf ontworpen spreadsheet template. Vermenigvuldigen som van de "numerieke waarden", wat neerkomtde totale afstand van een cel is gemigreerd met een correctiefactor om te zetten "pixel" in "micrometer".
- Bepaal twee celmigratie parameters: motorische activiteit (wat equivalent is aan migratie percentage) en begintijd van actieve beweging (figuren 2C, 2D).
- Identificeer de cellen die minder dan 25 urn (drempelwaarde voor het aantal vals-positieve cellen te verminderen) gemigreerd als niet bewegend cellen. Vervang "numerieke waarden" van deze cellen met ",".
OPMERKING: De parameter "locomotorische activiteit" (of migratie percentage) is het percentage van cellen van het gevolgde celpopulatie die verplaatst tussen twee tijdstippen (figuur 2D). Een "numerieke waarde" is gedefinieerd als een bewegend cel, terwijl "," gedefinieerd als een niet-bewegende cel. De parameter "tijd van actieve beweging" (tijd gezien) is het percentage van de totale tijd van een cel gemigreerd in rening aan het tijdsbestek van de observatieperiode (figuur 2C). Een "numerieke waarde" geeft aan dat een cel zich verplaatst, terwijl "," aan dat een cel niet is overgegaan. Deze parameter wordt verder gebruikt om het aantal cellen dat niet heeft bewogen bepalen.
- Bereken statistische significantie en weergave celmigratie data.
- Bereken statistische significantie van de gemiddelde motorische activiteit van de cellen (migratiesnelheid) met de Mann-Whitney U test. Overweeg p-waarde <0,05 als significant.
- Toon de gemiddelde motorische activiteit van cellen als xy-diagram, boxplot diagram, of als een staafdiagram. Tonen enkele cel-gebaseerde data, zoals de tijd van de actieve beweging en snelheid, als een staafdiagram diagram of als een histogram.
OPMERKING: Als de gekozen spreadsheet software applicatie een boxplot grafiek of histogram functie bevat een online zoektocht moet voor het zoeken van geschikte tu worden uitgevoerdtorials.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gebruikte 3D-collageenmatrix migratietestsysteem combinatie met time-lapse video-microscopie en computerondersteunde cell tracking maakt de bepaling van verschillende celmigratie parameters zowel populatie gebaseerde parameter (bijvoorbeeld gemiddelde motorische activiteit) en eencellige gebaseerde parameters (bijvoorbeeld tijd van actieve beweging, snelheid, afstand gemigreerd). Een voorbeeld van de verkregen cell tracking datasets verwerking en presentatie van gegevens zijn aangegeven in figuur 2. Cel bijhouden databestand lijkt op een tafel (Figuur 2A). Elke kolom staat voor een bijgehouden cel, waarbij per cel migratie experiment 30 cellen worden bijgehouden. De rijen bevat de informatie of een cel of tussen twee tijdstippen is verhuisd. De som van de "numerieke waarden", die de afstand in "pixel" een cel is verhuisd tussen twee tijdstippen, is de totale afstand deze cel is geëmigreerd. Het wordt vermenigvuldigd met acorrection factor om te zetten "pixel" in "micrometer". Cellen die minder dan 25 urn hebben gemigreerd worden gedefinieerd als niet-bewegende cellen om het aantal vals-positieve cellen verminderen. De snelheid (um / min) van elke cel wordt berekend door "totale afstand gemigreerd" door "totale tijd (min) van de observatieperiode".
Om het motorische gedrag van cellen gewoonlijk twee parameters worden gebruikt karakteriseren. Locomotorische activiteit (figuur 2D) vertegenwoordigt het gemiddelde motorische activiteit (of migratie percentage) van de geanalyseerde celpopulatie, terwijl de tijd van actieve beweging (figuur 2C) geeft de totale tijd een cel gemigreerd binnen de observatieperiode. Deze parameter wordt verder gebruikt om het aantal cellen dat niet heeft bewogen bepalen. De reden om twee celmigratie parameters voor analyse wordt toegeschreven aan het feit dat de motorische activiteit van cellen kan worden geactiveerd door different mechanismen. Er zijn drie mogelijkheden hoe, bijvoorbeeld een groeifactor, kan "induceren" celmigratie: a) in vergelijking met de controle meer cellen migreren, b) het aantal bewegende cellen in vergelijking met de controle is niet veranderd, maar groeifactor behandeld cellen een verhoogde tijd van actieve beweging, waardoor deze cellen migreren langer, en c) een combinatie van a) en b).
Het diagram in Figuur 2B toont schematisch hoe de motorische activiteit en tijd van actieve beweging wordt berekend. In dit voorbeeld de migrerende activiteiten van 120 cellen (die gelijk is aan vier onafhankelijke experimenten) weergegeven. Elke diamant geeft aan dat een cel zich verplaatst tussen ten minste twee tijdstippen (onafhankelijk van de afstand de cel gemigreerd!). De grijze lijnen werden toegevoegd bij het diagram blijkt dat de geanalyseerde celpopulatie bestaat uit bewegende en niet-bewegende cellen. De parameter "Locomotievenotory activiteit "staat voor de motorische activiteit van de geanalyseerde celpopulatie in afhankelijkheid van elk tijdspunt (Figuur 2D). Bijvoorbeeld, een motorische activiteit van 10% bij t = 5 h aangeeft dat tussen t = 4,45 h en t = 5 uur 10% van de geanalyseerde cellen verplaatst. Wanneer deze wordt weergegeven als een xy-diagram de parameter motorische activiteit geeft de dynamica van de geanalyseerde celpopulatie. Een andere mogelijkheid om de motorische activiteit van een celpopulatie weer is de boxplot diagram (figuur 2F).
De parameter "tijd van actieve beweging" (tijd actief) wordt gecorreleerd aan de totale tijd van een cel tijdens de observatieperiode bewogen, waarbij een tijd van activiteit van "0" geeft aan dat een cel niet is overgegaan (figuur 2C). Het actieve van de cellen worden getoond als een histogram.
Het samenspel van EGFR / HER2 / PLC-γ1 en HER2 / HER3- / PI3K signalering draagt bij aan eentrekkende fenotype van EGFR / HER2 / HER3- positieve borstkankercellen 25. PI3K signalering wordt voor het genereren van fosfatidyl-3,4,5-trisfosfaat (PIP 3), die fungeert als een anker molecuul voor PLC-1, waardoor dit enzym naar de plasmamembraan werven worden geactiveerd door receptortyrosinekinasen 35. Stimulatie van uitsluitend EGFR positieve MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) borstkankercellen geresulteerd in langdurige PLC-γ1 tyrosinefosforylatie gelijktijdig met aanhoudende IP3 en DAG niveaus produceren van sinusvormige calcium oscillaties 27. Daarentegen weergegeven EGFR / HER2 positieve MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) borstkankercellen basislijn voorbijgaande calcium oscillaties na EGF behandeling als gevolg van kortdurende PLC-γ1 tyrosine activering en korte termijn IP3 en DAG omzet 27 aangeeft dat HER2 expressie werd gecorreleerd aan een differentiële PLC-γ1 kinetiek en signalering.
Analyse van het migratiegedrag van de MDA-HER2 en MDA-NEO borstkankercellijnen bleek dat beide cellijnen vertoonden een vergelijkbare spontane motorische activiteit (MDA-HER2: 23,0-28,9%, mediaan 26,7% vs MDA-NEO: 19,3-24,4%, mediaan: 21.5%; Figuren 3A-3D ). De parameter tijd gezien, die de tijd van actieve beweging van afzonderlijke cellen in relatie tot de observatieperiode, toonde een iets groter aantal spontaan bewegen MDA-HER2-cellen (64% Figuur 3E) vergeleken met MDA-NEO borstkankercellen ( 53%; Figuur 3F). Stimulatie met 100 ng / ml EGF resulteerde in een significant verhoogde motorische activiteit van beide cellijnen. De migrerende activiteit van EGF behandelde MDA-HER2 verhoogd tot 30,4-35,2% (mediaan 33,7%, Figuren 3A, 3C), die werd toegeschreven aan zowel een toegenomen aantal bewegende cellen (100 ng / ml EGF: 81% versus controle: 64%) en een toegenomen tijd van actieve beweging. Bijvoorbeeld, de hoeveelheid MDA-HER2 cellen vertonen een tijd gezien van 40% wasgestegen van 20% (controle) tot 28% (100 ng / ml EGF). Soortgelijke gegevens werden verkregen voor MDA-NEO borstkankercellen die migrerende activiteit werd verhoogd tot 25,2-35,2 (mediaan 30,4%, figuren 3B, 3D) op EGF stimulatie. Gezamenlijk meer MDA-NEO cellen gemigreerd in reactie op stimulatie EGF (100 ng / ml EGF: 66% versus controle: 53%) en toonde een verschoven tijd gezien patroon (Figuur 3F). Zo werd de hoeveelheid cellen bezitten een tijd gezien van 60% sterk toegenomen tot 30% in de aanwezigheid van EGF in vergelijking met onbehandelde cellen MDA-NEO (13%).
Behandeling van MDA-HER2 en MDA-NEO borstkankercellen met de PLC-γ1 inhibitor U73122 resulteerde in een remming van zowel de spontane en EGF geïnduceerde migratie van de cellen (Figuur 3A-D). Vergeleken met MDA-NEO borstkankercellen het remmende effect van U73122 van de spontane migratie van MDA-HER2 cellen nogal matig, maar nietteminsignificant (controle: 23,0-28,9%, mediaan: 26,7% versus 2 uM U73122: 17,8-21,5%, mediaan: 20,0%; Figuur 3C). Analyse van de parameter tijd gezien toonde een licht verhoogde hoeveelheid nietbewegende cellen in de aanwezigheid van U73122 (control: 36% vs 2 uM U73122: 48% Figuur 3E). Ook U73122 behandeling blokkeerde de EGF geïnduceerde migratie van MDA-HER2 borstkanker cellen (100 ng / ml EGF: 30,4-35,2%, mediaan 33,7% versus 100 ng / ml EGF + 2 uM U73122: 19,3-24,1%, mediaan 22,6 % Figuur 3C). Overeenkomstig uitsluitend U73122 behandelde MDA-HER2 cellen dit remmende effect werd eerder toegeschreven aan een grotere hoeveelheid niet-bewegende cellen, maar niet veranderde tijd gezien patroon (Figuur 3C). In feite, een lichte verschuiving naar een grotere tijd van actieve beweging werd gedetecteerd in MDA-HER2 migrerende cellen behandeld met EGF en U73122 (Figuur 3C).
DaarentegenBehandeling van MDA-NEO cellen met 2 uM U73122 resulteerde in een sterk verminderde locomotorische activiteit van 5,6-10,7% (mediaan: 9,3% Figuur 3F) die hoofdzakelijk toegeschreven aan een grotere hoeveelheid niet-bewegende cellen (controle: 47% vs. 2 uM U73122: 79%; Figuur 3F). Ook de EGF geïnduceerde migratie van MDA-NEO borstkankercellen werd duidelijk door U73122 geblokkeerd om 1,1-7,4% (mediaan: 4,8%), die werd toegeschreven aan een grotere hoeveelheid niet-bewegende cellen (100 ng / ml EGF: 34 % vs 100 ng / ml EGF + 2 pM U73122: 70%) en een verminderde tijd gezien patroon (Figuur 3F).
Figuur 1 Schematisch overzicht van de bereiding van celmigratie kamers. (AE) A celmigratie kamer wordt voorbereid door het opstellen 02:58 lagen van gesmolten paraffin wax / petroleum jelly mix op een glasplaatje. (F, G) een dekglaasje wordt toegevoegd en afgedicht met gesmolten paraffine / vaseline mix. (H) De migratie kamer wordt gebracht rechtop gevolgd door toevoeging van collageen-cell suspensie. Vervolgens wordt de migratie kamer in een incubator geplaatst waardoor de collageen-celsuspensie te polymeriseren. (I, J) wordt de migratie kamer gevuld met media en verzegeld met gesmolten paraffine / vaseline mix aan de vierde zijde. Daarna worden de migratie kamers onder een microscoop geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Schematische weergave van de cel migratie data-analyse. (A) Cell bijhouden databestand. The migrerende activiteiten van 30 cellen wordt bepaald per experiment, waarbij 60 tijdstippen geanalyseerd. A "," aan dat een cel niet is overgegaan tussen twee punten, terwijl "numerieke waarde" geeft celbeweging. (B) Dit schema is een schematisch aanzicht van gegevens in (A). Elke diamant geeft aan dat een heeft verplaatst tussen twee tijdstippen; een regel geeft aan meer beweging. De grijze lijnen opgenomen te visualiseren dat de celpopulatie uit stilstaande en bewegende cellen cellen (die echter maak pauzes). (C) Tijd van actieve beweging (tijd gezien) is het percentage van de totale tijd een cel gemigreerd in verhouding tot de totale tijd van de waarnemingsperiode. Een tijd actief van 20% en een totale tijd van 15 uur geeft aan dat deze cel is verhuisd in totaal 3 uur. Deze parameter wordt verder gebruikt om het aantal niet bewegende cellen, wat overeenkomt met een actieve tijd van 0% vastgesteld. (D) (E) Als alternatief kan de motorische activiteit van de geanalyseerde cellen worden weergegeven als een boxplot diagram. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Representatieve celmigratie data van MDA-HER2 en MDA-NEO borstkankercellen. Cellen werden behandeld met 100 ng / ml EGF, 2 uM U73122 of een co mbination van beide. (A, B) Gemiddelde locomotorische activiteit van MDA-HER2 (A) en MDA-NEO (B) cellen in afhankelijkheid van de tijd. (C, D) boxplot diagram van de gemiddelde motorische activiteit, die de 2 uur aan 13 uur tijdsinterval (zie bar in (A, B)) van MDA-HER2 (C) en MDA-NEO (D) cellen. Statistische significantie werd berekend met behulp van de Mann-Whitney- U-test. *** = P <0,001. (E, F) Histogram plots van de tijd gezien van MDA-HER2 (E) en MDA-NEO (F) cellen. Het resultaat gezien van 0% betekent dat de cellen niet tijdens de observatieperiode. Gezamenlijk een tijd gezien van 20% betekent dat, gezien een observatieperiode van 15 uur, deze cellen zijn bewogen tot 3 uur. Getoond zijn het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten.blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen om te migreren is een kenmerk van tumorcellen 4. Zonder de mogelijkheid om los te maken van de primaire tumor en migreren door het omringende bindweefsel tumorcellen kunnen geen secundaire laesies, die de belangrijkste doodsoorzaak van bijna alle kankerpatiënten zaad. Vanwege deze relatie veel studies zijn gericht op kankercellen migratie. Het doel van deze studie is de identificatie van nieuwe doelmoleculen en doel wegen die efficiënt blokkeren migratie van tumorcellen, waardoor afbreuk of afremmen metastasevorming. Een voorbeeld voor een dergelijke inspanning kan zijn β-blokkers, waarvan is aangetoond dat het remmen metastatische verspreiding van borstkankercellen in vitro en in vivo 36 en die zijn geassocieerd met een verbeterde recidiefvrije overleving bij patiënten met triple-negatieve borstkanker kankercellen 37. We hebben onlangs aangetoond dat hybride cellen die afkomstig zijn van spontaneous fusiegebeurtenissen tussen een menselijke borst epitheel cellijn een humane borstkanker cellijn, maar niet de parentale cellen, reageerde op de chemokine CCL21 met een verhoogde migratie activiteit 26. CCL21 is geassocieerd met lymfeknoop metastase vorming van verschillende soorten kanker, zoals borst 38, suggereert dat celfusie een werkwijze hoe tumor (hybride) cellen metastatische eigenschappen 39,40 kunnen verkrijgen zijn.
De 3D collageenmatrix migratietestsysteem heeft verschillende voordelen ten opzichte van de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezende assay. Eerst worden cellen ingebed in een 3D fysiologische omgeving. Zoals hierboven vermeld, heeft de migratiegedrag van cellen tussen een tweedimensionale en 3D omgeving 3,14,15 aanzienlijk verschilt. Derhalve kan worden geconcludeerd dat het migratiegedrag van cellen ingebed in een 3D collageenrooster lijkt meer op de in vivo situatie dan LOCOMotory activiteit van cellen kruipen op een tweedimensionaal oppervlak. Ten tweede, door time-lapse video-opname is het mogelijk om de migratie van cellen te analyseren in een bepaald tijdsbestek, waarin de bepaling van verschillende celmigratie parameters mogelijk maakt. Daarentegen, in de Boyden kamer / transwell assay slechts die cellen worden geacht voor analyse die zijn verhuisd naar het onderste compartiment. Die cellen die migreren bijvoorbeeld bovenop het membraan niet in de gegevensanalyse hoewel ze trekkende actief.
De 3D collageen matrix te combineren met microfluïdische inrichtingen, die naast nabootsen van de extracellulaire matrix kan ook de interstitiële vloeistof, dat is aangetoond dat de morfologie en migratie van verschillende celtypes, zoals fibroblasten, kankercellen, endotheelcellen beïnvloeden nabootsen en mesenchymale stamcellen 41. Gegevens van Haessler et al. Blijkt dat interstitiële stroming verhoogt het percentagecellen die trekkende worden en verhoogt de migratierichting snelheid ongeveer 20% van de cellen 42. Naast de chemotactische gedrag van cellen, bijvoorbeeld leukocyten / lymfocyten of tumor cellen te bestuderen, een 3D microfluïdische instelling is ook een geschikt instrument om tumorcellen intravasation en endotheliale barrièrefunctie 43 bestuderen.
Hoewel de 3D collageenmatrix migratietestsysteem een geschikt hulpmiddel om de migratie van cellen te analyseren in respons op een stimulus of een inhibitor of een combinatie van beide moet worden opgemerkt dat deze test niet heeft ook een aantal beperkingen. Zo is enkel collageen type I voor het nabootsen van de extracellulaire matrix, die echter een complex mengsel van verschillende componenten zoals proteoglycanen, niet-proteoglycanen (bijvoorbeeld hyaluronzuur), collageenvezels, en fibronectine en laminine en welke samenstelling varieert verder sterk tussen verschillende bindweefsels in verschillende organen
Een ander kritisch punt in het ontcijferen van de cellen trekkende activiteit is de cel volgen procedure. Om geldige en objectieve gegevens te verkrijgen is het verplicht dat het pad van enkele cellen nauwkeurig wordt geanalyseerd. Cell tracking wordt handmatig uitgevoerd door de hand, die cell tracking ervaring om vraagtkrijgen objectieve gegevens. Verdere verbetering van de gegevens en een kritisch aantal vals-positieve cellen te vermijden gebruiken we een cut-off niveau van 25 micrometer, wat betekent dat cellen, die zijn gemigreerd minder dan 25 micrometer, werden uitgesloten van data-analyse. Ook worden cellen willekeurig gekozen voor het volgen zonder te weten of zij migrerend actief of niet vertekende gegevens te voorkomen.
In de afgelopen jaren zijn verschillende geautomatiseerde cell tracking software toepassingen ontwikkeld, waarbij sommige geschikt te analyseren cellen en deeltjes volgen in een 3D instelling 18. Het voordeel van dergelijke toepassingen is dat migrerende cellen echt op een objectieve manier worden geanalyseerd. Vanwege dat het interessant zou zijn om geautomatiseerde cell tracking gegevens te vergelijken met de hand gemaakte cell tracking data.
Zoals hierboven vermeld, de gouden standaard celmigratie geanalyseerd binnen een 3D fysiologische context is het gebruik van intravitale imaging gecombineerd wido 2-foton laser scanning confocale microscopie. Het voordeel van deze test is dat migrerende cellen worden ingebed in de fysiologische omgeving die bestaat uit specifieke oplosbare factoren, hormonen, etc., extracellulaire matrix componenten en cel-cel interacties. Opmerkelijk films zien hoe lymfocyten verhandelen in een lymfeknoop 17, hoe immuuncellen communiceren met elkaar 48 of hoe geneesmiddelen verdeeld in vivo op een enkele cel niveau 12,49.
Echter, intravitale imaging gecombineerd met 2-foton laser scanning confocale microscopie is een vrij kosten-dure techniek vanwege de noodzaak van een geschikte microscoop en gepaste diermodellen. Evenzo is het niet echt geschikt de invloed van afzonderlijke oplosbare factoren / remmers voor de migratie van bepaalde cellen of de analyse van celmigratie gerelateerde signaaltransductie cascades bestuderen. Voor deze doeleinden cel mitie assays worden aanbevolen waardoor de analyse van discrete celtypes, die verder kan worden gemodificeerd, bijvoorbeeld overexpressie of knockdown doelmoleculen, in bepaalde experimentele omstandigheden. Vanwege de cruciale relatie tussen een 3D-omgeving en het motorisch gedrag van cellen we concluderen dat de 3D collageenmatrix migratietestsysteem is dus een veelzijdige methode om de migratie van cellen te bestuderen in een in vitro omgeving die dicht bij de in vivo situatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petroleum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use |
References
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
