Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Analisi della migrazione delle cellule all'interno di una tridimensionale di collagene Matrix

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.

Abstract

La capacità di migrare è un segno distintivo di vari tipi di cellule e svolge un ruolo fondamentale in numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, e le risposte immunitarie. Tuttavia, la migrazione cellulare è anche un meccanismo chiave nel cancro consentire queste cellule tumorali a staccarsi dal tumore primario per avviare la diffusione metastatica. All'interno di questi ultimi anni sono stati sviluppati vari metodi di migrazione delle cellule per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule. Poiché il comportamento locomotorio di cellule differisce notevolmente tra un bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) ambiente si può presumere che l'analisi della migrazione delle cellule che sono incorporati in un ambiente 3D produrrebbe nella migrazione cellulare più significativo dati. Il vantaggio della matrice di collagene 3D dosaggio migrazione descritto è che le cellule sono incorporate all'interno di una rete fisiologica 3D di fibre di collagene che rappresentano il principale componente della matrice extracellulare. A causa ditime-lapse videomicroscopia migrazione cellulare reale viene misurata permettendo la determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, tra cui linfociti / leucociti, cellule staminali e cellule tumorali. Allo stesso modo, anche i gruppi di cellule o sferoidi possono essere incorporati all'interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel reticolo di collagene. Concludiamo che la matrice di collagene 3D test di migrazione è un metodo versatile per analizzare la migrazione delle cellule all'interno di un ambiente 3D fisiologico-like.

Introduction

Come la fusione cellulare (per una rassegna cfr 1,2) migrazione delle cellule è un altro fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie (per una rassegna vedi 3). Tuttavia, la capacità di migrare è anche un prerequisito per le cellule tumorali a metastatizzare (per una rassegna vedi 3,4).

Migrazione delle cellule è un complesso, non ancora pienamente compreso processo che è diretto dal gioco delle diverse vie di trasduzione del segnale iniziata da diversi ligando (ad esempio, citochine, chemochine, fattori di crescita, ormoni, componenti della matrice extracellulare) del recettore (ad esempio, tirosin-chinasi del recettore, recettori per le chemochine, integrine) interazioni 5 in ultima analisi, che causano la riorganizzazione del citoscheletro di actina concomitante con de- e rimontaggio di complessi di adesione focale e integrina-mediata segnalazione 6.

in vitro e in vivo test di migrazione delle cellule sono stati sviluppati negli ultimi decenni, tra cui il saggio di Boyden camera / transwell 7, scratch test / guarigione della ferita test 8-10, tridimensionale ( 3D) matrice di collagene migrazione dosaggio 11, nonché l'imaging intravitale / microscopia (per una rassegna vedi 12). Ciascuno di questi saggi di migrazione cellulare ha pro e contro, ad esempio, in materia di costi e necessità di attrezzature, il trattamento o l'affidabilità dei dati ottenuti.

Sia la camera di Boyden / transwell test e il test graffio / dosaggio guarigione della ferita sono facili, a basso costo e saggi ben sviluppati per misurare la migrazione delle cellule in vitro 7-10. Nella camera di Boyden / transwell cellule test vengono seminate sulla cima di un inserto contenente pori (circa 8 micron di diametro) - il cosiddetto vano superiore 7. Opzionale, l'inserto può essere rivestito con m extracellularecomponenti ATRIX, ad esempio, la fibronectina, collagene, ecc, per simulare un ambiente più fisiologico. Allo stesso modo, le cellule endoteliali possono essere coltivate sulla parte superiore dell'inserto, imitando in tal modo una barriera di cellule endoteliali 13. Quelle cellule che sono passati attraverso i pori durante un intervallo di tempo definito nel vano inferiore ospitare media e integratori, come i fattori di crescita e chemochine, sono usati come-out lettura di quantificare la migrazione cellulare (o stravaso).

Nel saggio graffio / guarigione cellule test ferite vengono seminate in piastre e sono coltivate a confluenza 10. In dipendenza delle piastre di regolazione sperimentali potrebbe essere pre-rivestito con componenti della matrice extracellulare, quali fibronectina. Dopo aver creato un graffio / ferita raschiando le singole cellule monostrato cellulare da ogni lato del graffio / ferita può migrare nello spazio vuoto, riempimento / guarigione è 10 quindi. La distanza tra i due lati del graffio / ferite è determinatain dipendenza del tempo ed è utilizzato come un out lettura per l'attività migratoria delle cellule 10. Tuttavia, per discriminare tra proliferazione cellulare (che potrebbe anche tradursi in riempimento / guarigione del graffio / ferita) e la migrazione cellulare si consiglia di combinare l'analisi con microscopio video time-lapse e di singola cellula di monitoraggio 10.

Tuttavia, sia la camera di Boyden / transwell test e scratch test / guarigione della ferita test, sono piuttosto imperfetto, concernente un ambiente cellulare fisiologico-like. Nella camera di Boyden / cellule dosaggio transwell devono migrare attraverso un poro di plastica, mentre nel scratch test / guarigione della ferita cellule del test vengono seminate su un piatto di plastica bidimensionale pre-rivestito. Allo stesso modo, è ben noto che il comportamento migratorio differisce marcatamente tra un ambiente bidimensionale e 3D 3. Per esempio, aderenze tridimensionale a matrice di fibroblasti differiscono da adesioni focali e fibrillari caratterizzati su duesubstrati -dimensionale nel loro contenuto di α5β1 e integrine αvβ3, paxillina, altri componenti del citoscheletro, e la fosforilazione della tirosina chinasi di adesione focale 14. Allo stesso modo, le cellule incorporati all'interno di un ambiente 3D visualizzate anche un comportamento migratorio alterato 15. Così per analizzare la migrazione cellulare più accuratamente un saggio di migrazione è raccomandato consentendo di misurare la migrazione di cellule singole all'interno di un ambiente fisiologico o fisiologico simile 3D.

Imaging intravitale / microscopia è il gold-standard per misurare la migrazione delle cellule all'interno di un contesto fisiologico 3D. Questo non appartiene solo alle interazioni matrice extracellulare delle cellule, ma anche per le interazioni tra diversi tipi di cellule, come le cellule tumorali e le cellule endoteliali durante stravaso 16 o il traffico dei linfociti nel linfonodo 17, che, ad oggi, è possibile grazie al miglioramento delle tecniche di microscopia a fluorescenza, come 2-fotonemicroscopio confocale a scansione laser, l'uso di coloranti fluorescenti vitali e ceppi di topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti derivati ​​12,16,17. Inoltre, l'imaging intravitale / microscopia può essere combinato con il monitoraggio delle cellule manuale e automatica 18. Tuttavia, a causa della necessità di un 2-fotone microscopio confocale a scansione laser e animali (e appropriati modelli animali transgenici) intravitale immagini / microscopia è una tecnica piuttosto intenso costi.

Per superare le limitazioni della camera di Boyden / transwell test e il test di guarigione scratch test / ferita e per analizzare la migrazione di diversi tipi di cellule all'interno di un ambiente 3D 3D matrice di collagene test di migrazione è stato sviluppato 11,19. In tal modo, le cellule che migrano sono incorporate all'interno di una rete in fibra di collagene 3D, che più somiglia alla situazione in vivo. Congiuntamente, a causa di time-lapse microscopia video di migrazione delle cellule reale si misura permettendo determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, compresi i linfociti e leucociti 11,20, staminali emopoietiche / progenitrici 21-24, e le cellule tumorali 5,25-29. Oltre alle cellule singole anche cellulare cluster o sferoidi possono essere incorporati all'interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel collagene reticolo 30,31.

Questo protocollo presenta una panoramica su una tecnica semplice, ma potente per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule all'interno di un ambiente 3D - un metodo in vitro ottenendo dei risultati che sono vicine alla situazione in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Preparazione della migrazione Chambers

  1. Preparare una gelatina di cera di paraffina / petrolio (1: 1) mix e calore finché il composto si sarà sciolto. Utilizzando un pennello e disegnare 2-3 strati della gelatina paraffina / petrolio (1: 1) mescolare a metà del vetrino in base alle figure 1B-1D.
    NOTA: Stiamo usando vetrini comuni (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H))
  2. Applicare la cera di paraffina / petrolio mix gelatina sciolta rapidamente sul vetrino per evitare la solidificazione durante il disegno. Assicurarsi che lo strato di gelatina di cera di paraffina / petrolio è di circa 2-2,5 cm di lunghezza e 0,3-0,5 cm di larghezza. Lo spessore dello strato di gelatina paraffina / petrolio dovrebbe essere di circa 0,1-0,15 cm.
  3. Aggiungere un coprioggetto alla cera di paraffina solidificata / petrolio mix gelatina e sigillare con 2-3 strati di paraffina mix gelatina di cera / di petrolio (Figure 1E, 1F). Utilizzare 4-8 camere di migrazione per un esperimento di migrazione cellulare comune. Camere Luogo di migrazione in per una posizione eretta in un rack.

2 Preparazione del collagene Sospensione Mix cellulare

  1. Harvest (ad esempio, con il 0,25% tripsina / EDTA) e contare le cellule di interesse. Risospendere le cellule in mezzi completi contenenti siero fetale bovino (FCS), antibiotici e integratori consigliato. Preparare 4-8 1.5 ml provette di reazione e 20 microlitri di sospensione cellulare contenente 4-6 x 10 4 cellule (il numero totale di cellule dipende dal tipo di cellula da analizzare) e riempire fino a 50 microlitri con completo supporto.
    NOTA: i composti supplementari (ad esempio, fattori di crescita, chemochine, inibitori, ecc) vengono aggiunti alla sospensione cellulare. Usare appropriate soluzioni madri tale che il volume finale della sospensione cellulare non supera i 50 ml.
  2. Preparare un importo totale di 452 microlitri di sospensione collagene finale per quattro esperimenti di migrazione delle cellule. Aggiungere 50 microlitri 10x MEM (pH 5,1-5,5) e 27 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio (pH 9,0-9,5) Per un tubo di reazione da 1,5 ml e mescolare accuratamente. Osservare il colore turno soluzione dal giallo-arancio al porpora intenso (pH 9,0-9,5). Aggiungi sospensione collagene 375 microlitri di liquido al / soluzione di bicarbonato di sodio 10x MEM e mescolare accuratamente. Il pH della sospensione collagene finale dovrebbe essere di circa 7,5 (indicato da una luce di colore viola).
    NOTA: Controllare il pH della soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5%. Se il pH è circa 7,5 posto la soluzione di bicarbonato di sodio con un coperchio aperto in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) di essere saturo di CO 2 e aumentare il pH (circa 9,0-9,5). Il pH della miscela di collagene sospensione cellulare è fondamentale per la stabilità della rete di collagene. Se è troppo bassa del reticolo di collagene crollerà durante l'esperimento migrazione cellulare.
    NOTA: Per questo protocollo, utilizzare il collagene liquido (pH 1,9-2,2) dal posteriore bovina (2,9-3,3 mg / ml di collagene; il 95% collagene di tipo I, 5% collagene di tipo IV). Esempi di ulteriore collagene protocolli di preparazione reticolo utilizzandocollagene di tipo I da altre fonti, come ad esempio suini o di ratto, sono indicati in 32,33. Non modificare i volumi delle soluzioni utilizzate in quanto ciò altera la concentrazione di collagene finale di 1,67 mg / ml del reticolo. Una concentrazione di collagene superiore o inferiore ha un impatto sulla densità delle fibre di collagene e la distanza media tra di loro in concomitanza con le cellule comportamento migratorio 34.
  3. Aggiungere 100 ml di sospensione finale di collagene per sospensione cellulare 50 microlitri e mescolare thoroughly.The sospensione collagene finale (1,67 mg / ml di collagene) è leggermente viscoso. Per trasferire l'importo corretto (100 ml), pipetta la soluzione di collagene finale una volta su e giù prima di trasferirlo alla sospensione cellulare.
    NOTA: Una volta che la miscela di cellule di sospensione collagene è combinato con la soluzione di bicarbonato / sodio 10x MEM e il valore del pH è cambiato a 7,5 le fibre di collagene cominciano immediatamente a polimerizzare.
  4. Trasferire la miscela di cellule di sospensione di collagene finale da thprovette di reazione di e alle camere di migrazione. Battere delicatamente la camera di migrazione per distribuire equamente il mix di cellule di sospensione di collagene sul fondo della camera di migrazione (Figura 1H). Collocare le camere migrazione in posizione verticale in un rack e incubare per circa 30 min (37 ° C, 5% CO 2) per consentire la polimerizzazione delle fibre di collagene.
  5. Si noti che il collagene reticolo polimerizzato è leggermente torbida, ma ancora in fase di luce di colore viola. Riempire le camere di migrazione con terreno completo o mezzo completo con supplementi di interesse e sigillare la camera di migrazione con gelatina di cera di paraffina / miscela di petrolio (Figure 1I, 1J).

3 Registrazione e analisi della migrazione delle cellule

Questa sezione descrive la registrazione di migrazione delle cellule mediante microscopia time-lapse video e l'analisi della migrazione delle cellule dal monitoraggio delle cellule manuale.

  1. Accendere il microscopio e la hea palco microscopioter. Regolare la temperatura a 37 ° C. Utilizzare un obiettivo 10X. Mettere camera di migrazione sotto un microscopio e mettere a fuoco circa 50 cellule o più nel campo visivo.
  2. Migrazione cellulare Record in modalità time-lapse utilizzando un'applicazione software di video sorveglianza multi-camera. Salvare i filmati di migrazione cellulare in un formato appropriato, ad esempio, "* avi" o "* mov". Collegare i file video di migrazione delle cellule di un database contenente informazioni di supporto, come il tipo di cellula e condizioni sperimentali.
    NOTA: Stiamo registrando linfociti e HSPCs per un massimo di 2 ore utilizzando un fattore di time-lapse di 1:80, il che significa che 0,75 sec in time-lapse è pari a 1 min in tempo reale. Le cellule tumorali sono cellule in movimento lento e sono quindi registrate per almeno 16 ore utilizzando un fattore di time-lapse di 1: 1.800 (0,5 sec in time-lapse è pari a 15 minuti in tempo reale).
  3. Analizzare i film migrazione cellulare utilizzando un'applicazione software di monitoraggio cella appropriata, come i plugin software ImageJ(Una visione d'insieme è dato in 18). Per un'analisi imparziale è di cruciale importanza che le cellule saranno selezionati a caso senza la conoscenza se le cellule sono migratrici attivo o meno.
    NOTA: Stiamo usando un software di auto-sviluppato per tenere traccia manualmente i percorsi di almeno 30 cellule per sperimentare seguendo le cellule si muovono con precisione con il cursore del mouse (che è posizionato al nucleo). Durante il monitoraggio, xy coordinate delle celle cingolati sono determinati automaticamente in base alla modalità time-lapse utilizzato. Per linfociti / HSPCs xy coordinate sono determinate ogni 0,75 secondi (pari a 1 minuto in tempo reale), mentre per le cellule tumorali xy coordinate sono determinate ogni 0,5 secondi (pari a 15 minuti in tempo reale).
  4. Determinare un totale di 60 xy coordinate per cella per un tipico esperimento migrazione cellulare. Questo è uguale a 1 ora in tempo reale per i linfociti / HSPCs e 15 ore in tempo reale per le cellule tumorali. A "," indica che una cella non è spostato tra two punti di tempo, mentre un "valore numerico" indica la distanza in "pixel" una cellula è spostato tra 2 punti temporali (Figura 2A).
    NOTA: il monitoraggio delle cellule manuale richiede esperienza. In particolare, le cellule migrano veloce sono difficili da rintracciare e ogni tipo di cellula mostrano un comportamento migratorio netto che potrebbe essere innescato da fattori integrati. In caso di divisione cellulare, mentre il monitoraggio, scegliere a caso una cellula figlia per continuare il monitoraggio. Le cellule che migrano fuori del campo di vista o muoiono durante il monitoraggio non sono trascurati, ma sono considerati per l'analisi.

Analisi 4. Dati

  1. Analizzare i dati di tracciamento cellulare utilizzando un'applicazione software appropriato, ad esempio, un foglio di calcolo.
    1. Analizzare i dati di monitoraggio delle cellule copiando la cella di rilevamento dati grezzi (Figura 2A), in un modello di foglio di calcolo auto-progettato. Moltiplicare somma dei "valori numerici", che rappresentala distanza totale di una cella ha migrato con un fattore di correzione per convertire i "pixel" in "micron".
    2. Determinare due parametri di migrazione cellulare: l'attività motoria (che equivale al tasso di migrazione) e il tempo di movimento attivo (Figure 2C, 2D).
    3. Identificare le cellule che sono migrate minore di 25 micron (livello di soglia per ridurre il numero di cellule falsi positivi) come cellule non-movimento. Sostituire "valori numerici" di queste cellule con ",".
      NOTA: Il parametro "attività motoria" (o tasso di migrazione) rappresenta la percentuale di cellule della popolazione di cellule cingolato che si sono trasferiti tra due punti di tempo (Figura 2D). Un "valore numerico" è definito come una cellula in movimento, mentre "," è definito come una cella non in movimento. Il parametro "tempo di movimento attivo" (attiva) rappresenta la percentuale del tempo totale di una cella è migrato nel rimento per il periodo di tempo del periodo di osservazione (Figura 2C). Un "valore numerico" indica che una cellula è spostato, mentre "," indica che una cella non è mossa. Questo parametro viene inoltre utilizzato per determinare il numero di cellule che non si è mosso.
  2. Calcolare la significatività statistica e dei dati di migrazione delle cellule di visualizzazione.
    1. Calcola significatività statistica dell'attività locomotoria medio della cellule (tasso di migrazione) utilizzando il test di Mann-Whitney. Consideriamo p-value <0.05 come significativo.
    2. Visualizzare l'attività locomotoria medio di cellule come xy-diagramma, schema BoxPlot, o come un diagramma grafico a barre. Visualizzare i dati basati su celle singole, come il tempo di movimento attivo o la velocità, come un diagramma grafico a barre o un istogramma.
      NOTA: Se l'applicazione software foglio di calcolo scelto non contiene una tabella o un grafico istogramma strumento BoxPlot una ricerca online deve essere effettuata per la ricerca di idonei tutorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il 3D-collagene test di migrazione matrice utilizzata in combinazione con time-lapse video-microscopia e di monitoraggio delle cellule assistita da computer consente la determinazione di vari parametri di migrazione delle cellule, compreso sia il parametro basato sulla popolazione (ad esempio, l'attività locomotoria media) e parametri basati su celle singole (ad esempio, il tempo di movimento attivo, velocità, distanza migrato). Un esempio di set di dati di monitoraggio delle cellule ottenuti, l'elaborazione dei dati e presentazione dei dati sono indicate nella figura 2. Una cellula di monitoraggio file di dati assomiglia a una tabella (Figura 2A). Ogni colonna è sinonimo di una cella rintracciato, in base al quale per ogni esperimento la migrazione delle cellule 30 cellule sono tracciati. Le righe contengono le informazioni se una cellula è spostato o non tra due punti di tempo. La somma dei "valori numerici", che rappresenta la distanza in "pixel" una cellula è spostato tra due punti di tempo, la distanza totale questa cella è migrata. Esso viene moltiplicato per acfattore orrection convertire "pixel" in "micron". Le cellule che sono migrate minore di 25 micron sono definite come cellule non-movimento per ridurre il numero di cellule falsamente positivi. La velocità (micron / min) di ogni cella viene calcolata dividendo "distanza totale migrato" da "tempo totale (min) del periodo di osservazione".

Per caratterizzare il comportamento motorio di cellule comunemente vengono utilizzati due parametri. Attività locomotoria (Figura 2D) rappresenta l'attività locomotoria (o tasso di migrazione) medio della popolazione cellulare analizzata, mentre il tempo di movimento attivo (Figura 2C) rappresenta il tempo totale di una cellula è migrata entro il periodo di osservazione. Quest'ultimo parametro viene inoltre utilizzato per determinare il numero di cellule che non si è mosso. La ragione per l'utilizzo di due parametri di migrazione delle cellule per l'analisi è attribuito al fatto che l'attività locomotoria delle cellule può essere innescato da differemeccanismi NT. Ci sono tre possibilità come, ad esempio, un fattore di crescita, può "indurre" la migrazione delle cellule: a) rispetto al controllo più cellule migrano, b) il numero di cellule in movimento rispetto al controllo non è cambiato, ma il fattore di crescita trattati cellule mostrano un aumento del tempo di movimento attivo, il che significa che queste cellule migrano più a lungo, e c) una combinazione di a) e b).

Il diagramma in Figura 2B illustra schematicamente come viene calcolato l'attività locomotoria e l'ora del movimento attivo. In questo esempio vengono visualizzate le attività migratorie di 120 cellule (che è uguale a quattro esperimenti indipendenti). Ogni diamante indica che una cellula si è spostato tra almeno due punti di tempo (indipendentemente dalla distanza della cella è migrata!). Le linee grigie sono stati aggiunti a questo diagramma per dimostrare che la popolazione analizzata di cellule consiste di movimento e di cellule non-movimento. Il parametro "LOCOMattività otory "rappresenta l'attività locomotoria della popolazione cellulare analizzata in funzione di ogni punto di tempo (Figura 2D). Ad esempio, un'attività locomotoria del 10% at = 5 h indica che tra t = 4.45 hr e t = 5 h 10% delle cellule analizzate sono spostati. Quando viene visualizzato come un diagramma xy l'attività locomotoria parametro indica la dinamicità della popolazione cellulare analizzata. Un'altra possibilità di visualizzare l'attività locomotoria di una popolazione di cellule è il diagramma BoxPlot (Figura 2F).

Il parametro "tempo di movimento attivo" (attiva) è correlato al tempo totale di una cella è spostata durante il periodo di osservazione, per cui una volta attiva "0" indica che una cella non è mossa (Figura 2C). Il tempo attivo delle celle può essere visualizzato come un istogramma.

L'interazione di EGFR / HER2 / PLC-γ1 e HER2 / HER3 segnalazione / PI3K contribuisce ad unfenotipo migratorio di EGFR / HER2 / HER3 seno positivo le cellule tumorali 25. È richiesta la segnalazione di PI3K per la generazione di fosfatidil-3,4,5-trifosfato (PIP3), che agisce come una molecola di ancoraggio per PLC-1, reclutando quindi questo enzima alla membrana plasmatica per essere attivato da tirosin-chinasi del recettore 35. Stimolazione di MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO), le cellule del cancro al seno esclusivamente EGFR positivi ha portato a lungo termine PLC-γ1 concomitante fosforilazione della tirosina con IP3 sostenuta e livelli di DAG producono oscillazioni sinusoidali di calcio 27. Al contrario, HER2 / MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) le cellule del cancro al seno positivi EGFR visualizzate basali oscillazioni di calcio transitori dopo il trattamento FEG a causa di breve termine attivazione tirosina PLC-γ1 e IP3 a breve termine e DAG fatturato 27 indica che l'espressione di HER2 è stata correlata ad un differenziale cinetica e segnalazione PLC-γ1.

Analisi del comportamento migratorio di MDA-HER2 e MDA-NEO linee di cellule di cancro al seno hanno rivelato che entrambe le linee cellulari hanno mostrato una simile attività locomotoria spontanea (MDA-HER2: 23,0-28,9%, mediana: 26,7% vs MDA-NEO: 19,3-24,4%, mediana: 21,5%; Figure 3A-3D ). Il tempo di parametro attiva, che rappresenta il tempo di movimento attivo delle singole cellule in relazione al periodo di osservazione, ha rivelato un numero leggermente superiore di spontaneo movimento delle cellule MDA-HER2 (64%; Figura 3E) rispetto alle cellule di carcinoma mammario MDA-NEO ( 53%; Figura 3F). La stimolazione con 100 ng / ml di EGF ha determinato un significativo aumento dell'attività locomotoria di entrambe le linee cellulari. L'attività migratoria di EGF trattati MDA-HER2 portato al 30,4-35,2% (mediana 33.7%; figure 3A, 3C), che è stato attribuito sia un aumento del numero di cellule in movimento (100 ng / ml FEG: 81% vs controllo: 64%) e un aumento del tempo di movimento attivo. Per esempio, la quantità di cellule MDA-HER2 esibendo un tempo attivo del 40% eraaumentata dal 20% (controllo) al 28% (100 ng / ml EGF). Dati simili sono stati ottenuti per le cellule MDA-NEO cancro al seno, che l'attività migratoria è stata aumentata a 25,2-35,2 (mediana 30,4%; figure 3B, 3D) su stimolazione EGF. Congiuntamente, più cellule MDA-NEO migrati in risposta alla stimolazione EGF (100 ng / ml FEG: 66% vs controllo: 53%) e visualizzato un modello attivo in differita (Figura 3F). Per esempio, la quantità di cellule che posseggono un tempo attivo del 60% era marcatamente aumentato al 30% in presenza di EGF rispetto alle cellule MDA-NEO non trattati (13%).

Trattamento di MDA-HER2 e cellule di carcinoma mammario MDA-NEO con il PLC-γ1 inibitore U73122 determinato una inibizione sia della migrazione spontanea e indotta EGF delle cellule (Figura 3A-D). Tuttavia, rispetto alle cellule di carcinoma mammario MDA-NEO l'effetto inibitorio della U73122 sulla migrazione spontanea di cellule MDA-HER2 era piuttosto moderato, ma comunquesignificativo (controllo: 23,0-28,9%, mediana: 26,7% vs 2 mM U73122: 17,8-21,5%, mediana: 20,0%; Figura 3C). Analisi del tempo di parametri attivo rivelato un leggero aumento del numero di cellule non-movimento in presenza di U73122 (controllo: 36% vs 2 mM U73122: 48%; Figura 3E). Allo stesso modo, il trattamento U73122 bloccato il FEG migrazione indotta delle cellule del cancro al seno MDA-HER2 (100 ng / ml EGF: 30,4-35,2%, media 33,7% vs 100 ng EGF ml / + 2 mM U73122: 19,3-24,1%, mediana 22.6 %; Figura 3C). In conformità a solo U73122 trattare cellule MDA-HER2 questo effetto inibitorio è stato piuttosto attribuita ad una maggiore quantità di cellule non-movimento, ma non un modello attivo tempo alterato (Figura 3C). In realtà, un leggero spostamento verso un aumento del tempo di movimento attivo è rilevabile nella migrazione delle cellule MDA-HER2 in trattamento con EGF e U73122 (Figura 3C).

Per contro, Il trattamento delle cellule MDA-NEO con 2 mM U73122 ha comportato una diminuzione marcata attività locomotoria del 5,6 al 10,7% (mediana: 9,3%; Figura 3F) che è stato principalmente attribuito ad una maggiore quantità di non-movimento celle (controllo: 47% vs 2 mM U73122: 79%; Figura 3F). Allo stesso modo, il FEG migrazione indotta delle cellule del cancro al seno MDA-neo era marcatamente bloccato da U73122 a 1,1-7,4% (mediana: 4,8%), che è stato attribuito ad una maggiore quantità di cellule non-movimento (100 ng / ml EGF: 34 % vs 100 ng / ml di EGF + 2 mM U73122: 70%) e di un modello attivo ridotto il tempo (Figura 3F).

Figura 1
Figura 1 Schema di preparazione delle camere di migrazione delle cellule. (AE) Una camera di migrazione delle cellule è preparato attingendo 2-3 strati di una paraffi fusan cera / petrolio mix gelatina su un vetrino. (F, G) Un coprioggetto viene aggiunto e sigillato con mix di paraffina fusa gelatina di cera / di petrolio. (H) La camera di migrazione è messo in posizione verticale seguita aggiungendo la cella di collagene sospensione. Successivamente, la camera di migrazione è posto in un incubatore che consente la sospensione di collagene-cellulare per polimerizzare. (I, J) La camera di migrazione è riempito con i media e sigillati con cera di paraffina fusa / petrolio mix gelatina sul quarto lato. Successivamente, camere di migrazione sono posti sotto un microscopio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2 Schema di analisi dei dati di migrazione cellulare. (A) file di dati di monitoraggio cellulare. ThE le attività migratorie di 30 cellule è determinato per ogni esperimento, per cui 60 punti temporali vengono analizzati. A "," indica che una cella non è spostato tra due punti, mentre un "valore numerico" indica il movimento delle cellule. (B) Questo diagramma è una vista schematica di dati presentati in (A). Ogni diamante indica che si è mosso tra due punti di tempo; una linea indica il movimento più lungo. Le linee grigie sono stati inclusi per visualizzare che la popolazione cellulare costituita da cellule non in movimento e cellule (che, tuttavia, fare pause) mobile. (C) Tempo di movimento attivo (attiva) rappresenta la percentuale del tempo totale di una cella ha migrato in relazione al tempo totale del periodo di osservazione. Un tempo attivo del 20% e un tempo totale di 15 ore indica che questa cella è spostato in totale per 3 ore. Questo parametro viene inoltre utilizzato per determinare il numero di cellule non-movimento, che equivale ad un tempo attivo di 0%. (D) (E) In alternativa, l'attività locomotoria delle cellule analizzate può essere visualizzato come un diagramma BoxPlot. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. dati di migrazione di cellule rappresentative della MDA-HER2 e cellule di carcinoma mammario MDA-Neo. Cellule sono state trattate con 100 ng / ml di EGF, 2 mM U73122 o con un co mbination di entrambi. (A, B) indica l'attività locomotoria di MDA-HER2 (A) e le cellule in dipendenza di tempo MDA-NEO (B). (C, D) BoxPlot diagramma dell'attività locomotoria medio, che rappresenta il 2 hr a 13 hr intervallo di tempo (vedi barra in (a, b)) di MDA-HER2 (C) e MDA-NEO (D) le cellule. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando il -test Mann-Whitney- U. *** = P <0.001. (E, F) Trame Istogramma del tempo attivo di MDA-HER2 (E) e MDA-NEO (F) cellule. Un tempo attivo di 0% indica che le cellule non si sono spostati durante il periodo di osservazione. Congiuntamente, un tempo attivo del 20% indica che, considerando un periodo di osservazione di 15 ore, queste cellule sono spostati fino a 3 ore. Indicati sono la media di almeno tre esperimenti indipendenti.blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La capacità di migrare è una caratteristica delle cellule tumorali 4. Senza la possibilità di staccarsi dal tumore primario e migrare attraverso le circostanti cellule tumorali tessuto connettivo non sarà in grado di seminare lesioni secondarie, che sono la principale causa di morte di quasi tutti i pazienti affetti da cancro. A causa di questa relazione molti studi si stanno concentrando sulla migrazione delle cellule del cancro. Lo scopo di questi studi è l'identificazione di nuove molecole target e percorsi di destinazione che bloccano efficacemente la migrazione delle cellule tumorali, compromettendo o rallentare la formazione di metastasi. Un esempio di tale sforzo potrebbe essere β-bloccanti, che hanno dimostrato di inibire la diffusione metastatica delle cellule tumorali della mammella in vitro e in vivo 36 e che sono stati associati ad un miglioramento della sopravvivenza libera da recidiva in pazienti con seno triplo negativo le cellule tumorali 37. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule ibride, che derivano da spontaneeventi di fusione OU tra una linea umana epiteliale della mammella cellulare e una linea di cellule di cancro al seno umano, ma non le cellule parentali, ha risposto alla chemochina CCL21 con un aumento dell'attività migratoria 26. CCL21 è stata associata con la formazione di metastasi linfonodali di vari tipi di cancro, compresi seno 38, suggerendo che la fusione cellulare potrebbe essere un processo come tumore (ibrido), le cellule possono acquisire le proprietà metastatiche 39,40.

Il 3D test di migrazione matrice di collagene ha diversi vantaggi in confronto alla camera di Boyden / transwell dosaggio e il graffio test / guarigione della ferita dosaggio. In primo luogo, le celle sono incorporate in un ambiente fisiologico 3D. Come detto in precedenza, il comportamento migratorio delle cellule differisce notevolmente tra un ambiente bidimensionale e 3D 3,14,15. Pertanto si può concludere che il comportamento migratorio delle cellule incorporato all'interno di un reticolo di collagene 3D assomiglia più alla situazione in vivo rispetto al LOCOMattività otory delle cellule strisciare su una superficie bidimensionale. In secondo luogo, grazie alla registrazione video time-lapse è possibile analizzare la migrazione di diverse cellule per un certo periodo di tempo, che consente la determinazione di vari parametri di migrazione cellulare. Per contro, nella camera di Boyden test / transwell solo le cellule sono considerate per l'analisi che si sono spostati al vano inferiore. Quelle cellule che migrano ad esempio, sulla parte superiore della membrana non sono inclusi nelle analisi dei dati anche se sono attivi migratori.

La matrice di collagene 3D può essere combinato con dispositivi microfluidici, che oltre a mimare la matrice extracellulare non anche mimare il liquido interstiziale, che ha dimostrato di influenzare la morfologia e la migrazione di vari tipi cellulari, quali fibroblasti, cellule tumorali, cellule endoteliali , e cellule staminali mesenchimali 41. I dati di Haessler et al. Hanno rivelato che il flusso interstiziale aumenta la percentualedi cellule che diventano migratorio così come aumenta la velocità migratorio in circa il 20% delle cellule 42. Oltre a studiare il comportamento chemiotattica delle cellule, ad esempio, leucociti / linfociti o cellule tumorali, un ambiente microfluidica 3D è anche uno strumento idoneo per studiare intravasation delle cellule tumorali e la barriera endoteliale funzione 43.

Anche se il dosaggio 3D migrazione matrice di collagene è uno strumento adatto per analizzare la migrazione delle cellule in risposta ad uno stimolo o ad un inibitore o ad una combinazione di entrambi si deve notare che questo test non ha anche alcune limitazioni. Ad esempio, solo il collagene di tipo I è usato per mimare la matrice extracellulare, che, però, è una miscela complessa di diversi componenti, tra cui proteoglicani, non proteoglicani (ad esempio, acido ialuronico), le fibre di collagene, così come fibronectina e laminina e che composizione varia inoltre notevolmente tra i diversi tessuti connettivi in ​​diversi organi 45 concomitante con esito differenziale. Ad esempio, la stimolazione β1-integrina ha causato l'attivazione di ERK in monociti mentre β2-stimolazione non ha 46. Allo stesso modo, PI3K era necessario per β1-integrin-, ma non β2-integrin-, mediata NF-kB di attivazione 46. D'altra parte, collagene di tipo I è il collagene più abbondante nel corpo umano 47, suggerendo che la migrazione delle cellule è principalmente innescato da questo tipo di collagene.

Un altro punto critico nel decifrare le cellule l'attività migratoria è la procedura di monitoraggio delle cellule. Per ottenere dati validi e oggettiva è obbligatorio che il percorso delle singole cellule viene analizzato accuratamente. Inseguimento cellulare viene eseguita manualmente a mano, che richiede esperienza inseguimento cellaottenere dati oggettivi. Per migliorare ulteriormente i dati e per evitare un numero critico di cellule falsi positivi che stiamo usando un livello di cut-off di 25 micron, il che significa che le cellule, che sono emigrati minore di 25 micron sono stati esclusi dall'analisi dei dati. Allo stesso modo, le cellule sono scelti a caso per il monitoraggio senza sapere se sono migratori attivi o meno per evitare di dati parziali.

All'interno di questi ultimi anni sono state sviluppate diverse applicazioni software di monitoraggio cellulare automatizzati, per cui alcuni di loro sono adatti per analizzare cellulare e tracciamento di particelle in un 3D impostazione 18. Il vantaggio di queste applicazioni è che le cellule che migrano sono veramente analizzati in modo obiettivo. A causa di ciò, sarebbe interessante confrontare i dati automatizzate di monitoraggio cella con i dati di monitoraggio delle cellule manualmente-made.

Come accennato in precedenza, il gold standard per analizzare la migrazione delle cellule in un contesto fisiologico 3D è l'utilizzo di wi immagini intravitale combinatath 2-fotone laser a scansione microscopia confocale. Il vantaggio di questo saggio è che le cellule migrano sono incorporate nel loro ambiente fisiologico costituito da fattori specifici solubili, ormoni, ecc, componenti della matrice extracellulare e cellula-cellula interazioni. E 'straordinario vedere i film che mostrano come i linfociti vengono traffico all'interno di un linfonodo 17, come le cellule del sistema immunitario comunicano tra loro 48 o come i farmaci sono distribuiti in vivo a livello di singola cellula 12,49.

Tuttavia, l'imaging intravitale combinato con 2-fotone microscopia confocale a scansione laser è una tecnica piuttosto economicamente costosa a causa della necessità di un microscopio adeguato e modelli animali appropriati. Allo stesso modo, non è proprio adatto per studiare l'influenza dei singoli fattori / inibitori solubili sulla migrazione delle cellule particolari o l'analisi della migrazione delle cellule legate cascate di trasduzione del segnale. Per questi mi fini cellularisaggi grazione sono raccomandati permettendo l'analisi dei tipi cellulari distinti, che possono essere ulteriormente modificate, ad esempio iperespressione o atterramento di molecole target, in condizioni sperimentali definite. A causa della relazione fondamentale tra un ambiente 3D e il comportamento locomotorio di cellule concludiamo che la matrice di collagene 3D dosaggio migrazione è quindi un metodo versatile per studiare la migrazione delle cellule in un ambiente in vitro che è vicino alla situazione in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

Bioingegneria la migrazione delle cellule matrice di collagene 3D il monitoraggio cellulare
Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter