Introduction
Een verscheidenheid van model dieren worden gebruikt in ontwikkelingsbiologie ontwikkelingsstoornissen mechanismen te onderzoeken op moleculair en cellulair niveau. Zo hebben amfibieën en vogelsoorten wijd gebruikt als klassieke model dieren die geschikt zijn voor directe manipulatie van embryo's, omdat deze embryo's ontwikkelen buiten de moeder. In tegenstelling tot deze dieren, zoogdieren embryo groeien in de baarmoeder van de moeder en groei in latere stadia is sterk afhankelijk van de functie van de baarmoeder. Daarom is het meestal moeilijk direct manipuleren zoogdieren embryo zoals die van de muis en rat in een vroeg stadium. In de jaren 1960, Denis Nieuw vestigde een zoogdier hele embryo cultuur (WEC) techniek met behulp van WEC apparaten met een continue toevoer van zuurstof en warmte controle 1. In WEC, kunnen muizen en ratten embryo's groeien ex vivo, (dat wil zeggen, buiten de baarmoeder). Hoewel de WEC techniek werd vaak gebruikt in teratologisch door het toevoegen van verschillende chemical verbindingen in het kweekmedium is deze techniek ook gebruikt in verschillende ontwikkelingsbiologie studies unieke ontwikkeling bij zoogdieren 2-4 onderzocht. Zo wordt WEC gecombineerd met andere technieken, zoals mobiele etikettering in wild-type en mutant embryo met fluorescerende kleurstof 5, celtransplantatie 6 en genintroductie via lipofectie 7 en elektroporatie 8-13.
Recent, in utero manipulatie is gebruikt om de ontwikkeling in knaagdieren embryo's te analyseren in latere stadia en is gecombineerd met elektroporatie technieken 14-16. Echter, deze technieken zijn niet geschikt voor het manipuleren van postimplantatie en midgestation embryo door moeilijkheden bereiken nauwkeurige lokale injectie van het DNA-oplossing in embryo in een vroeg stadium. Hoewel echogeleide celtransplantatie en de injectie van virale vectoren in vroege embryo's (dat wil zeggen, E8.5-E-9.5 in de muis) in de baarmoeder zijn gemeld eerder 17,18, zijn uitstekende vaardigheden die nodig zijn om deze experimenten uit te voeren met een hoog slagingspercentage. Daarom WEC hoge toegankelijkheid ex vivo heeft voordelen met betrekking tot de manipulatie van muizen en ratten embryo.
Onmiddellijk gecentrifugeerd (IC) rat serum bereid uit mannelijke ratten wordt vaak gebruikt voor WEC medium. Wanneer embryo's gekweekt op postimplantatie stadium (eerder dan E8.0 in de muis of E10.0 in de rat), wordt een mengsel van synthetisch medium en IC rattenserum vaak gebruikt als een medium voor WEC 19. Echter, cultuur embryo tussentijdse zwangerschap (dwz., E8.0-12.5 in muisembryo's of E10.0-E14.5 embryo in ratten), 100% serum worden gebruikt als een medium omdat er geen beschikbaar alternatieve media kan embryo groeien normaal in vitro meer dan 2 dagen.
De bereiding van hoogwaardige serum rat iseen cruciale stap voor het bereiken van de reproduceerbaarheid in WEC experimenten. Vergeleken met vertraagde centrifugatie, IC heeft het voordeel van het verminderen hemolyse als het serum wordt verzameld door knijpen de fibrine klonter omdat de meeste van de rode bloedcellen reeds gescheiden van het fibrine stolsel. Zoals hemolytische rat serum niet aan de normale groei van rat en muis embryo ondersteunen, de bereiding van serum met onmiddellijke centrifugatie de voorkeur preparaat met vertraagde centrifugatie. Het protocol bevat twee extra stappen vergelijking met andere protocollen 18-20 (dwz. Vóór de eerste centrifugatie het verzamelde bloed op ijs opslaan en onderhouden van de bloedmonsters gedurende 2 uur bij 4 ° C na de eerste centrifugatie). De eerstgenoemde stap de vorming van bloedstolsel vertragen, en deze stap bevordert de stolling van het fibrine stolsel gemakkelijk knijpen. Daarom kan ons protocol worden gebruikt door beginners. Echter, het reproduceren van bloedafname en serumextractie nauwkeurig door simpelweg te verwijzen naar protocol boeken is uiterst moeilijk 19-21. In deze video artikel tonen we standaardprotocol voor de bereiding van optimale IC rat serum, die bloedinzameling omvat van de abdominale aorta van mannelijke ratten en extractie van het serum door centrifugatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Animal experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Het Comite voor Dierproeven van de Tohoku University School of Medicine keurde de hierin beschreven experimentele procedures.
1. Anesthesie en Laparotomie
- Voor bloedafname, maken gebruik van specifieke pathogenen vrije mannelijke Sprague-Dawley ratten. Snel de ratten gedurende minstens 18 uur, terwijl het verstrekken van water. Gebruik gepensioneerde mannelijke fokker ratten bij 6-8 maanden oud (550-650 g) voor het verzamelen van bloed.
- Flow 2,5-4,0% isofluraan, die een inhalatie verdoving, in een doos verbonden met een anesthesietoestel anesthesie te stellen op 2,0-3,5 L / min gedurende 10 minuten. Transfer ratten in de box om anesthesie te introduceren.
- Bevestig verdoving door te controleren op het verlies van de respons op stimulering van de poten met een tang. Bedek de neus van de ratten with een masker aangesloten op een anesthesie apparaat om diep verdoven de ratten tijdens de bloedafname. De concentratie en stroomsnelheid wordt gehandhaafd op 2,5-4,0% en 2,0-3,5 L / min, respectievelijk.
OPMERKING: Halothaan mag niet worden gebruikt voor inhalatie-anesthesie omdat embryo's gekweekt in het serum dat is verzameld van ratten verdoofd met dit reagens vertonen een vertraging in embryonale ontwikkeling vergeleken met embryo's gekweekt in serum verkregen uit ratten verdoofd met isofluraan 22.
- Bevestig verdoving door te controleren op het verlies van de respons op stimulering van de poten met een tang. Bedek de neus van de ratten with een masker aangesloten op een anesthesie apparaat om diep verdoven de ratten tijdens de bloedafname. De concentratie en stroomsnelheid wordt gehandhaafd op 2,5-4,0% en 2,0-3,5 L / min, respectievelijk.
- Om besmetting van de vacht te voorkomen, ontsmet de huid door het gieten van 70% ethanol op de buik van de verdoofde rat. Pak de huid gedesinfecteerd en abdominale wand aan het onderste gebied met een pincet en snijd deze lagen tegelijkertijd naar de thorax regio met een paar grote schaar om de interne organen bloot. Weerspiegelen de darm buiten de buikholte met een pincet.
- Snijd de huid en de buikwand naar de achterste ledematen met eenpaar grote schaar om de achterste buikstreek verder bloot te leggen. Weerspiegelen de extra vet buitenkant van de buikholte met een pincet.
- Pak de visceraal vet op de middellijn gebruik van twee paar tang en splitsen het vet voorzichtig in een parallelle richting om de abdominale aorta bloot. Herhaal deze procedure voor het visceraal vet verdeeld in de lengterichting gemakkelijk identificeren van de bifurcatie van de abdominale aorta. Bovendien, de aorta pulserend kan worden onderscheiden van de aangrenzende holle ader met deze eigenschap.
- Neem het vet rond de abdominale aorta en de bifurcatie voorzichtig met twee paar pincetten en scheiden het vet op de abdominale aorta.
2. Bloedafname
- Steek de punt van een 21 G naald verbonden met een 20 ml spuit direct craniaal van de bifurcatie van de aorta, de afschuining in een neerwaartse richting voorzichtig. Houd de spuit met eende hand, en trek de spuit langzaam tot 15 ml bloed uit een mannelijke rat verzamelen.
- Verwijder de naald van de spuit, en giet het bloed in twee ijskoude 10-ml steriele reageerbuisjes (Figuur 1A). Houd de buizen op ijs tot centrifugatie om de vorming van bloedstolsel vertragen. Verminder de centrifugeertijd door centrifugeren meerdere buizen in een keer.
- Euthanaseren de verdoofde rat door thoracotomie en snijden het hart of onthoofding.
3. Rat serumbereiding
- Centrifugeer de verzamelde bloed gedurende 5 min bij 1200 xg en kamertemperatuur (KT) om het bloed in een bovenste en onderste lagen (Figuur 1C) scheiden.
- Houd de buizen bij 4 ° C gedurende 1,5-2 uur aan de fibrinestolsel lossen.
- Pak de fibrine klonter in de bovenlaag met een paar gebogen tang en knijp het fibrine stolsel het serum te scheiden. Druk vervolgens op de fibrinestolsel met de gebogen pincet tegenover downwards nabij het grensvlak tussen de twee lagen (figuur 1D).
- Herhaal stap 3.3 verder los van de fibrinestolsel.
- Centrifugeer de buisjes gedurende 5 min bij 1200 xg en RT (figuur 1E).
- Breng zorgvuldig het serum in een 15 ml steriele buis met behulp van een steriele pipet in een laminaire luchtstroom kabinet.
- Centrifugeer de verzamelde rat serum gedurende 5 min bij 1200 xg en RT resterende rode cellen te verwijderen.
- Verzamel de serum voorzichtig in een nieuwe 15 ml gesteriliseerde buis met een steriele pipet verontreiniging naar resterende rode cellen op de bodem van de buis (figuur 1F) voorkomen.
- Incubeer het serum in een waterbad bij 56 ° C gedurende 30 minuten om het complementsysteem te inactiveren.
- Koelen de buizen van rattenserum RT in de laminaire luchtstroom kabinet. Het serum moet worden gealiquoteerd tot 10 ml in individuele steriele buizen. Bewaar de flesjes bij -20 ° C tot gebruik (Figuur 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont representatieve resultaten van de procedures voor het scheiden van bloedcellen en serum. We meestal 15 ml bloed te verkrijgen van een gepensioneerde mannelijke rat (Figuur 1A). Door centrifugatie, kan het verzamelde bloed wordt gescheiden in een bovenste laag die het serum en de fibrine klonter, die is aangegeven met een pijl, en een onderste laag die de bloedcellen (figuur 1C). Belangrijk is dat hemolytische bloedmonsters niet worden gescheiden in serum en bloed lagen (Figuur 1B). Na het verlaten van de buis bij 4 ° C gedurende 2 uur, het fibrine klonter vast wordt. Deze verharding is handig voor de scheiding van het serum van het fibrinestolsel met een paar gebogen pincet (figuur 1D). De reageerbuis werd vervolgens gecentrifugeerd. De fibrine stolsel is zichtbaar op het grensvlak tussen serum en bloedcellen lagen (figuur 1E). Het serum van de twee reageerbuizen werd verzameld ineen nieuwe buis met een wegwerpbare pipet. We kunnen ongeveer 6 ml serum te verkrijgen van een mannelijke rat als de hele procedure succesvol is. Om verder te verwijderen rode cellen, werd de verzamelde serum opnieuw gecentrifugeerd. Eventuele resterende rode cellen neergeslagen op de bodem van de buis (figuur 1F). Wij overgedragen supernatant naar een nieuwe buis en controleerde de kleur van het gezuiverde serum om de mate van hemolyse beoordelen hoewel we in staat om het serum te verzamelen van de bovenste laag na centrifugeren. De ideale rattenserum voor WEC vertoont meestal een lichtgele kleur (linker buis in figuur 1G), terwijl de rat serum met een lichte hemolyse vertoont een roze kleur (rechts buis in figuur 1G). IC rattenserum kan worden bewaard gedurende ten minste 6-12 maanden bij -20 ° C (links in figuur 1H). Het serum met een lichte hemolyse vertoonden een diepere kleur dan de ideale serum wanneer ingevroren (links in figuur 1H).
Figuur 1. Procedures voor bloed centrifugeren en voorbereiding van serum van mannelijke ratten. A) De bloedmonsters verzameld uit een mannelijk rat gelijk verdeeld in twee reageerbuizen voor centrifugeren. B, C) Niet-gescheiden monster (B) en ideale scheiding in de bovenste laag die het serum en het fibrine stolsel (pijl in C) en de onderste laag met de bloedcellen na de eerste centrifugatie. D) Het fibrine stolsel wordt na de tweede centrifugatie geperst met een paar pincetten. E) Het serum en bloed cellagen. De fibrine stolsel wordt waargenomen op het grensvlak (pijlpunten). F) Neerslag van bloedcellen na de derde centrifugeren (pijl). G) De linker buis toont ideaal serum rat met een lichtgele kleur. De rechter buis toont rattenserum met milde hemolyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reproduceerbare resultaten WEC experimenten afhankelijk van het gebruik van hoge kwaliteit IC rattenserum en nauwkeurige embryo dissectie techniek 3. Niet inkorten van de periode van vasten voor het verzamelen van bloed, want vasten is nodig om glucose concentraties te standaardiseren in het bloed. Vrouwelijke ratten niet worden gebruikt voor de bereiding van serum omdat hormoonspiegels aanpassen bij vrouwelijke dieren volgens het loopsheid en dergelijke veranderingen in estradiol hormonen ongeschikt voor embryo kweken. Bovendien moet zeer vet mannelijke ratten niet voor serum bereiding van een grote hoeveelheid lipiden verontreiniging in het bloed voorkomen.
Bij het verzamelen van het bloed, er eerst voor zorgen dat de kleur van het arteriële bloed is een heldere rode kleur, als gevolg van normale ademhaling onder narcose. Verminderde ademhaling leidt tot een vermindering van de hoeveelheid verzamelde bloed. Om te herstellen in dergelijke gevallen tijdelijk de snelheid waarmee de spuit pu verminderengelogen. De meest kritische probleem in serum voorbereiding is hemolyse. Als de bloedmonsters vertonen ernstige hemolyse, het bloed niet in twee lagen worden gescheiden door centrifugatie. Omdat licht gehemolyseerde serum sub-optimale ontwikkeling kan ondersteunen, moeten dergelijke serum worden weggegooid. Als hemolyse vaak wordt veroorzaakt door geforceerde druk moet de spuit langzaam getrokken wanneer het bloed is afgenomen. Het is belangrijk om te voorkomen borrelen het bloed wanneer het verzamelde bloedmonsters worden gegoten in reageerbuizen, die hemolyse toeneemt.
Om cultuur muizenembryo's, kan IC serum verzameld van mannelijke muizen ideaal zijn; Dit vereiste is niet praktisch omdat we een voldoende grote hoeveelheid bloed kan krijgen van een muis. Wanneer we ons voorbereiden rattenserum, bereiden we minstens 10 gepensioneerde fokken mannelijke ratten. In ons laboratorium, wordt bloedafname routinematig uitgevoerd door ten minste twee personen: het individu verzamelt het bloed en de individuele verlamming en uitvoeren van deeerst centrifugeren.
Tot op heden, hebben verschillende studies met behulp van commerciële rattenserum in WEC door het combineren van chemisch welbepaald medium gemeld 23-25. Bijvoorbeeld, een mengsel van 50% commercieel beschikbaar rat serum en 50% DMEM ondersteunt de normale groei van E8.5 muizenembryo's van 36 uur 23 en de normale groei van E9.75 muizenembryo's van 40 uur 24. In een ander protocol, een mengsel van 50% rattenserum beschikbaar ander bedrijf en 50% F12-medium aangevuld met N-2 ondersteunt ook de goede groei van E7.5 en E8.5 muis embryo voor 24 uur 25. Toch blijft het onduidelijk of deze combinatorische media zijn geschikt voor de cultuur van rat en muis embryo's in latere stadia, zoals E11.5-E12.5 bij muizen en E13.5-E14.5 bij ratten. WEC studies met verschillende alternatieve media in plaats van ratten serum zijn ook gemeld 26-28. Bijvoorbeeld, een combinatie van DMEM/F12 en 20% foetaal runderserum (FBS) ondersteunt de ontwikkelingwikkeling van rat embryo's uit E11.5 voor 28 uur 26. Echter, dit medium niet geschikt voor ratten embryocultuur uit E10.5 28 uur 26. Daarom geloven wij dat de normale groei van embryo's in medium met FBS is afhankelijk van het embryonale stadium van de embryo.
WEC met serumvrije kweekmedia bestaat alleen bepaalde reagentia, waaronder commercieel beschikbare embryonale stamcel media, runderserumalbumine en N-2 supplement gemeld. Dit medium ondersteunt de cultuur van E10.5 muis embryo voor 16-40 uur 27, 28. Morre-Scott, et al.. Aangetoond dat de kroon naar romp grootte van muizenembryo's gekweekt gedurende 24 uur aanzienlijk kleiner dan die van E11 0,5 embryo's gekweekt in utero. Echter, de belangrijkste structuren, zoals somieten en ganglia, normaal lijken in deze gekweekte embryo's. Anderzijds, Kalaskar en Lauderdale meldde dat 60% van de embryo's getest in dit medium vertoonde normal. ontwikkeling 18 uur later, maar het tempo van de goede ontwikkeling in embryo's gekweekt voor een extra 20-22 uur gedaald tot 30-40%. In tegenstelling tot deze studies, kunnen we met succes reproduceren goede ontwikkeling van muizen en ratten embryo's gekweekt in 100% IC rat serum geproduceerd met ons protocol twee dagen (dwz. Ongeveer 48 uur) van E12.5 ratten 6 of E10.5 in muizen 8 door eenmaal waarbij het medium bij 24 uur. Deze resultaten suggereren dat onze werkwijze voor het bereiden IC rattenserum is nuttig voor een verscheidenheid van experimenten toepassing zoogdieren WECat verschillende embryonale stadia. Daarom hopen wij dat onze video-protocol zal helpen nieuwe onderzoekers voeren experimenten met WEC hun laboratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. , 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
