Introduction
Eine Vielzahl von Modelltiere sind in der Entwicklungsbiologie zur Entwicklungsmechanismen auf molekularer und zellulärer Ebene zu untersuchen. Zum Beispiel Amphibien-und Vogelspezies wurden weithin als klassische Modell Tiere, die für die direkte Behandlung der Embryonen sind, weil diese Embryonen entwickeln sich außerhalb der Mutter eingesetzt. Im Gegensatz zu diesen Tieren wachsen Säugetier-Embryonen in die Gebärmutter der Mutter, und das Wachstum in späteren Phasen hängt entscheidend von der Funktion der Gebärmutter. Daher ist es in der Regel schwierig, Säugetierembryos, wie sie aus der Maus und Ratte in einem frühen Stadium direkt zu manipulieren. In den 1960er Jahren wurde eine neue Denis ganze Säugetierembryokultur (WEC)-Technik mit WEC Geräte mit einer kontinuierlichen Sauerstoffzufuhr und Wärme ein. WEC können Maus-und Rattenembryos zu wachsen ex vivo (dh außerhalb des Uterus). Obwohl die WEC-Technik wurde oft in Teratologie durch Zugabe verschiedener chemic verwendetAl-Verbindungen in dem Kulturmedium wurde diese Technik auch in verschiedenen Entwicklungsbiologie Studien verwendet worden, um einzigartige Entwicklungsmechanismen in Säugetieren 2-4 zu prüfen. Zum Beispiel wird WEC mit anderen Techniken, wie z. B. Zellmarkierung, in Wildtyp-und Mutanten-Embryos unter Verwendung fluoreszierender Farbstoff 5, Zelltransplantation 6 und Gen-Einführung über 7 Lipofektion und Elektroporation 8-13 kombiniert.
Kürzlich wurde in utero Manipulation verwendet wurde, um Entwicklungsprozesse in Nagetierembryonen in späteren Stadien zu analysieren und mit Elektroporationsverfahren 14-16 zusammengefasst. Jedoch sind diese Techniken nicht für die Handhabung von Postimplantationsembryonen und midgestation aufgrund von Schwierigkeiten Erzielung einer genauen lokalen Injektion der DNA-Lösung in Embryonen im Frühstadium. Obwohl Ultraschall-geführte Zelltransplantation und Injektion von viralen Vektoren in frühen Embryonen (dh, E8.5-E-9.5 in der Maus) in utero wurde berichtet, zuvor 17,18, sind sehr gute Kenntnisse erforderlich, um diese Experimente mit einer hohen Erfolgsquote durchzuführen. Daher WEC mit hoher Zugänglichkeit ex vivo hat Vorteile in Bezug auf die Manipulation der Maus-und Rattenembryos.
Sofort zentrifugiert (IC) Rattenserum von männlichen Ratten vorbereitet wird oft für WEC Medium verwendet. Wenn Embryonen sind in der Postimplantationsstufe (dh früher als E8.0 im E10.0 Maus oder der Ratte) kultiviert wird eine Mischung aus synthetischen Mediums und IC Rattenserum häufig als Medium für WEC 19 verwendet. Doch die Kultur Embryonen in der Mitte der Schwangerschaft (dh., E8.0-12.5 in Maus-Embryonen oder E10.0-E14.5 in Rattenembryonen), 100% Serum sollte als Medium verwendet werden, da es derzeit keine alternative Medien ermöglicht Embryonen in vitro normalerweise länger als 2 Tage wachsen.
Die Herstellung von hochwertigen RattenserumEin entscheidender Schritt zur Erreichung Reproduzierbarkeit WEC Experimenten. Verglichen mit verzögerter Zentrifugation hat den IC Vorteil der Reduzierung der Hämolyse, wenn das Serum wird durch Zusammendrücken des Fibringerinnsels gesammelt, da die meisten der roten Blutzellen bereits aus der Fibrin-Gerinnsel getrennt. Als hämolytischer Rattenserum nicht auf das normale Wachstum der Ratten-und Maus-Embryonen zu unterstützen, ist die Herstellung von Serum mit sofortiger Zentrifugation bevorzugt Zubereitung mit verzögerter Zentrifugation. Unser Protokoll enthält zwei zusätzliche Schritte im Vergleich zu anderen Protokollen 18-20 (dh., Speichern des gesammelten Bluts auf Eis vor der ersten Zentrifugation und Halten der gesammelten Blutproben 2 h bei 4 º C nach der ersten Zentrifugation). Die ersteren Stufe die Bildung des Blutgerinnsels zu verzögern, und der letztere Schritt fördert die Verfestigung des Fibringerinnsels für einfache Quetschen. Daher kann unser Protokoll von Anfängern verwendet werden. Allerdings reproduzieren Blutentnahme und SerumExtraktion genau durch einfaches Protokoll Bücher bezieht, ist extrem schwierig, 19-21. In diesem Video-Beitrag zeigen wir, unsere Standard-Protokoll für die Herstellung der optimalen IC Rattenserum, die Blutentnahme aus der Bauchaorta von männlichen Ratten und Gewinnung von Serum durch Zentrifugation enthält.
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Protocol
HINWEIS: Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Der Ausschuss für Tierversuche der Tohoku University School of Medicine hat den hier beschriebenen experimentellen Verfahren.
1. Anästhesie und Laparotomie
- Für die Blutentnahme, verwenden Sie spezifischen Pathogen-freien männlichen Sprague-Dawley Ratten. Schnell die Ratten für mindestens 18 Stunden, während die Bereitstellung von Wasser. Verwenden Sie im Ruhestand männlichen Ratten Züchter bei 6-8 Monaten (550-650 g) zum Sammeln von Blut.
- Durchfluss von 2,5 bis 4,0% Isofluran, die ein Inhalationsnarkosemittel ist, in eine Box zu einem Narkosegerät angeschlossen, um Anästhesie bei 2,0 bis 3,5 l / min für 10 Minuten vorstellen. Übertragen Ratten in der Box auf die Anästhesie einzuführen.
- Betäubung zu bestätigen, indem der Verlust der Reaktion auf die Stimulation an den Pfoten mit einer Pinzette. Decken Sie die Nase des Ratten with eine Maske auf ein Narkosegerät, um während der Blutabnahme tief betäuben die Ratten verbunden. Die Konzentration und Strömungs werden bei 2,5-4,0% gehalten und 2,0-3,5 L / min.
HINWEIS: Halothan sollte nicht zur Inhalationsanästhesie verwendet, weil Embryonen im Serum, die von Ratten, die mit diesem Reagens weisen eine Verzögerung in der embryonalen Entwicklung im Vergleich zu Embryonen in der von Ratten mit Isofluran betäubt 22 erhaltene Serum kultiviert betäubt gesammelt, kultiviert werden.
- Betäubung zu bestätigen, indem der Verlust der Reaktion auf die Stimulation an den Pfoten mit einer Pinzette. Decken Sie die Nase des Ratten with eine Maske auf ein Narkosegerät, um während der Blutabnahme tief betäuben die Ratten verbunden. Die Konzentration und Strömungs werden bei 2,5-4,0% gehalten und 2,0-3,5 L / min.
- Um eine Kontamination des Fells zu vermeiden, die Haut desinfiziert durch Eingießen 70% Ethanol auf den Bauch der narkotisierten Ratte. Pick-up die Haut desinfiziert und Bauchwand am unteren Bereich mit einer Pinzette und gleichzeitig geschnitten, diese Schichten in Richtung der Thorax-Bereich mit einem Paar große Schere, um die inneren Organe aus. Reflect den Darm außerhalb der Bauchhöhle mit einer Pinzette.
- Schneiden Sie die Haut und Bauchwand in Richtung der Hinterbeine mit einerPaar große Schere, um die hinteren Bauchbereich weiter aus. Reflektieren Sie das Extra-Fett außerhalb der Bauchhöhle mit einer Pinzette.
- Nehmen Sie das viszerale Fett an der Mittellinie mit zwei Pinzetten und teilen das Fett vorsichtig in einer Richtung parallel zu der Bauchschlagader freizulegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um das viszerale Fett in Längsrichtung geteilt, um leicht die Gabelung der Bauchaorta. Zusätzlich ist die Aorta pulsatilen und kann von der benachbarten Hohlvene mit diesen charakteristischen unterscheiden.
- Nehmen Sie das Fett um die Bauchaorta und die Bifurkation vorsichtig mit zwei Pinzetten und trennen Sie das Fett auf der Bauchaorta.
2. Blutentnahme
- Vorsichtig die Spitze einer 21 G Nadel in eine 20 ml Spritze unmittelbar kranial der Bifurkation der Aorta, mit dem Kegel nach unten verbunden. Halten Sie die Spritze mit einemHand, und ziehen Sie die Spritze langsam zu 15 ml Blut aus einer männlichen Ratte zu sammeln.
- Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze, und gießen Sie das Blut in zwei eiskalte 10-ml sterilen Röhrchen (Abbildung 1A). Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis Zentrifugation, um die Bildung der Blutgerinnsel verzögern. Reduzieren Sie die Zeit Zentrifugation durch Zentrifugieren mehrere Rohre auf einmal.
- Euthanize die narkotisierten Ratten durch Thorakotomie und Schneiden des Herzens oder Enthauptung.
3. Rat Serum Vorbereitung
- Zentrifugieren des gesammelten Blutes für 5 min bei 1.200 × g und Raumtemperatur (RT), um das Blut in einen oberen und unteren Lagen (1C) zu trennen.
- Halten Sie die Röhrchen bei 4 ° C für 1,5-2 Stunden, um die Fibringerinnsel beheben.
- Holen das Fibringerinnsel in der oberen Schicht unter Verwendung eines Paars von gebogenen Pinzette und quetschen das Fibringerinnsel, das Serum zu trennen. Drücken Sie dann die Fibringerinnsel mit den gebogenen Pinzette gegen downwards nahe der Grenzfläche zwischen den beiden Schichten (Fig. 1D).
- Wiederholen Sie Schritt 3.3 weiter lösen das Fibringerinnsel.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.200 xg und RT (1E).
- Das Serum vorsichtig in einem 15 ml sterilen Röhrchen übertragen mit einer sterilen Pipette in einer Laminar-Air-Flow-Gehäuse.
- Zentrifugieren des gesammelten Rattenserum für 5 min bei 1.200 × g und Raumtemperatur, um jegliche verbleibenden roten Blutkörperchen zu entfernen.
- Pool Serum vorsichtig in ein neues 15 ml sterilisierten Röhrchen unter Verwendung einer sterilen Pipette, um eine Kontamination durch restliche Erythrozyten am Boden des Rohres (1F) zu vermeiden.
- Inkubieren des Serums in einem Wasserbad bei 56 ° C für 30 min, um das Komplementsystem zu inaktivieren.
- Kühlen Sie die Rohre aus Rattenserum auf RT im laminaren Luftstrom Schrank. Das Serum sollte auf 10 ml, einzeln steril Röhrchen aliquotiert werden. Die Röhrchen bei -20 ° C bis zur Verwendung (1H).
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von den beschriebenen Verfahren zur Abtrennung von Blutzellen und Serum. Wir erhalten in der Regel 15 ml Blut aus einem pensionierten männlichen Ratte (Abbildung 1A). Durch Zentrifugieren, kann das gesammelte Blut in eine obere Schicht, die das Serum und das Fibringerinnsel, die mit einem Pfeil angedeutet ist, und eine untere Schicht, die die Blutzellen (Fig. 1C) getrennt werden. Wichtiger ist, hämolytische Blutproben nicht in Serum und Blutschichten (1B) getrennt werden. Nach dem Verlassen der Röhrchen bei 4 ° C für 2 Stunden wird das Fibringerinnsel Feststoff. Diese Verfestigung ist bequem für die Trennung des Serums von dem Fibringerinnsel mit einem Paar von gebogenen Pinzette (Fig. 1D). Das Teströhrchen wurde anschließend zentrifugiert. Das Fibringerinnsel ist an der Schnittstelle zwischen dem Serum und Blutzellschichten (1E) sichtbar. Das Serum aus den beiden Teströhrchen gesammelt wurde inein neues Rohr mit einem Einweg-Pipette. Wir können etwa 6 ml Serum eines männlichen Ratte zu erhalten, wenn der gesamte Vorgang erfolgreich war. Zur weiteren Entfernung roter Zellen wurde das Serum gesammelt, erneut zentrifugiert. Alle verbleibenden roten Zellen ausgefällt an der Unterseite des Rohres (Fig. 1F). Wir über den Überstand in ein neues Röhrchen überprüft und die Farbe des gereinigten Serum den Grad der Hämolyse zu beurteilen, auch wenn wir in der Lage sind, das Serum von der oberen Schicht nach dem Zentrifugieren gesammelt. Die ideale Rattenserum für WEC zeigt typischerweise eine hellgelbe Farbe (links Rohr in 1G), während Rattenserum mit milder Hämolyse weist eine rosa Farbe (rechts Rohr in 1G). IC Rattenserum für mindestens 6-12 Monate bei -20 ° C (nach links in Fig. 1H) gespeichert werden. Das Serum mit milder Hämolyse zeigten eine tiefere Farbe als das Ideal, wenn Serum eingefroren (in Abbildung 1H links).
1. Verfahren zur Blut Zentrifugation und Herstellung von Serum von männlichen Ratten. A) Die Blutproben aus einer männlichen Ratte gesammelt werden gleichmäßig in zwei Teströhrchen zur Zentrifugation unterteilt. B, C) Nicht getrennte Probe (B) und idealen Trennung in der oberen Schicht, die das Serum und das Fibringerinnsel (Pfeil C) und die untere Schicht nach der ersten Zentrifugation. D), die die Blutzellen Das Fibringerinnsel wird unter Verwendung einer Pinzette Serum und Blutzellschichten nach der zweiten Zentrifugation gequetscht. E). Das Fibringerinnsel wird an der Schnittstelle (Pfeilspitzen) beobachtet. F) Niederschlag von Blutzellen nach der dritten Zentrifugation (Pfeil). G) Die linke Rohr zeigt ideale Rattenserum mit einem leichten gelblichen Farbe. Die rechte Röhre zeigt Rattenserum mit milder Hämolyse.
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Discussion
Reproduzierbare Ergebnisse in WEC Experimente sind abhängig von der Verwendung von hochwertigen IC Rattenserum und genaue Embryo Dissektionstechnik 3. Den Zeitraum des Fastens vor Blutentnahme nicht kürzen, weil das Fasten ist notwendig, um Glucose-Konzentrationen im Blut zu standardisieren. Weibliche Ratten, nicht zur Herstellung von Serum verwendet werden, da Hormonspiegel ändern bei weiblichen Tieren nach dem Östrus-Zyklus, und diese Änderungen in Hormone Östradiol für Embryokulturen geeignet sind. Darüber hinaus sollte extrem Fett männlichen Ratten nicht für Serumpräparat verwendet werden, um eine große Menge an Lipid-Verunreinigung in dem Blut zu vermeiden.
Beim Sammeln des Blutes, zunächst sicherstellen, dass die Farbe des arteriellen Blutes ist eine leuchtend rote Farbe, was normale Atmung unter Narkose. Verringerte Atem führt zu einer Verringerung der Menge des gesammelten Bluts. In solchen Fällen zu erholen, vorübergehend die Geschwindigkeit mit der die Spritze pu reduzierenullt. Das kritischste Problem im Serum Zubereitung Hämolyse. Wenn die gesammelten Blutproben zeigen starke Hämolyse nicht das Blut durch Zentrifugieren in zwei Schichten getrennt werden. Da milde hämolytische Serum zu suboptimalen Entwicklung zu unterstützen, sollten solche Serum verworfen werden. Als Hämolyse neigt dazu, durch Zwangsdruck induziert werden, sollte die Spritze langsam bei der Erfassung des Blut gezogen werden. Es ist wichtig zu vermeiden, Einblasen des Blutes, wenn die gesammelten Blutproben werden in Teströhrchen gegossen, die Hämolyse erhöht.
Um Kultur Maus-Embryonen kann IC Serum von männlichen Mäusen gesammelt ideal; jedoch ist diese Forderung nicht praktisch, weil wir eine genügend große Menge von Blut aus einer Maus erhalten kann. Wenn wir bereiten Rattenserum, bereiten wir mindestens 10 Rentner Zucht männlichen Ratten. In unserem Labor wird das Blut Sammlung routinemäßig von mindestens zwei Personen durchgeführt werden: die einzelnen Auffang das Blut und die individuelle betäubende und die Durchführung dererste Zentrifugation.
Bisher wurden verschiedene Studien mit kommerziellen Rattenserum in WEC indem chemisch definierte Medium wurde berichtet, 23-25. Zum Beispiel kann ein Gemisch von 50% im Handel erhältlich Rattenserum und 50% DMEM unterstützt das normale Wachstum der Maus E8.5 Embryonen für 36 h 23 und das normale Wachstum von Mausembryonen E9.75 40 Stunden 24. In einem anderen Protokoll unterstützt eine Mischung aus 50% Rattenserum, erhältlich von einem anderen Unternehmen und 50% F12-Medium mit N-2 ergänzt zusammen auch die ordnungsgemäße Wachstum E7.5 und E8.5 Mausembryonen 24 h 25. Es bleibt jedoch unklar, ob diese kombi Medien sind in späteren Stufen, zB E11.5-E12.5 und E13.5 in Mäuse-E14.5 bei Ratten für die Kultur von Ratten-und Maus-Embryonen. WEC-Studien unter Verwendung verschiedener alternativer Medien anstelle von Rattenserum wurde auch berichtet, 26-28. Beispielsweise eine Kombination aus DMEM/F12 und 20% fötalem Rinderserum (FBS) den Entwicklung von Rattenembryonen aus E11.5 für 28 h 26. Jedoch ist dieses Medium nicht von E10.5 innerhalb 28 Stunden 26 für Rattenembryokultur. Daher glauben wir, dass das normale Wachstum der Embryonen in einem Medium, FBS ist abhängig von der embryonalen Stadium der Embryonen.
WEC mit serumfreiem Kulturmedium nur von definierten Reagenzien, einschließlich im Handel erhältlicher embryonalen Stammzellmedium, Rinderserumalbumin, und N-2 Supplement enthalten sind berichtet worden. Dieses Medium unterstützt die Kultur von E10.5 Maus-Embryonen für 16-40 h 27, 28. Morre-Scott et al. Gezeigt, dass die Krone-zu-Steiß Größe Mausembryonen für 24 h kultiviert, ist deutlich kleiner als die von E11 0,5 Embryonen in der Gebärmutter entwickelt. Allerdings sind die Hauptstrukturen, wie Somiten und dorsalen Wurzelganglien, erscheinen in dieser kultivierten Embryonen normal. Auf der anderen Seite, und Kalaskar Lauderdale berichtet, dass 60% der Embryonen in diesem Medium getestet zeigte Normal Entwicklung 18 Stunden später, aber die Rate der guten Entwicklung in Embryonen für weitere 20-22 h kultiviert sank auf 30-40%. Im Gegensatz zu diesen Studien, können wir erfolgreich reproduzieren gute Entwicklung der Maus und Ratte Embryonen in 100% IC Rattenserum mit unserem Protokoll für zwei Tage kultiviert produziert (dh., Ca. 48 Std.) von E12.5 bei Ratten 6 oder E10.5 Mäuse in 8 durch Ändern des Mediums sofort nach 24 Stunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass unsere Verfahren zur Herstellung von IC-Rattenserum ist für eine Vielzahl von Experimenten Aufbringen Säuger WECat verschiedenen Embryonalstadien. Wir hoffen deshalb, dass unsere Video-Protokoll wird dazu beitragen, neue Forscher präsentieren Experimente mit WEC zu ihren Labors.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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