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Biology

स्तनधारी पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए उपयुक्त चूहा सीरम की तैयारी

Published: August 3, 2014 doi: 10.3791/51969
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3
1Graduate School of Medicine, Jichi Medical University, 2Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Developmental Neuroscience, United Center for Advanced Research and Translational Medicine (ART), Tohoku University School of Medicine

Introduction

मॉडल कई प्रकार के जानवर आणविक और सेलुलर स्तर पर विकास तंत्र की जांच करने के लिए विकासात्मक जीव विज्ञान में किया जाता है. उदाहरण के लिए, उभयचर और एवियन प्रजातियों व्यापक रूप से इन भ्रूण मां के बाहर विकसित क्योंकि भ्रूण की प्रत्यक्ष हेरफेर के लिए उपयुक्त हैं कि शास्त्रीय मॉडल जानवरों के रूप में इस्तेमाल किया गया है. इन जानवरों के विपरीत, स्तनधारी भ्रूण मां के गर्भाशय में बढ़ती है, और बाद के चरणों में वृद्धि गर्भाशय के समारोह पर महत्वपूर्ण निर्भर है. इसलिए, यह सीधे ऐसे प्रारंभिक दौर में माउस और चूहा से उन जैसे स्तनधारी भ्रूण हेरफेर करने के लिए आम तौर पर मुश्किल है. 1960 के दशक में, डेनिस न्यू एक निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति और गर्मी नियंत्रण के साथ 1 WEC apparatuses का उपयोग कर एक स्तनधारी पूरे भ्रूण संस्कृति (WEC) तकनीक की स्थापना की. WEC में, माउस और चूहा भ्रूण पूर्व vivo, (यानी, गर्भाशय के बाहर) विकसित कर सकते हैं. WEC तकनीक अक्सर विभिन्न chemic जोड़कर टेरटालजी में इस्तेमाल किया गया था हालांकिअल, संस्कृति के माध्यम में यौगिकों इस तकनीक को भी स्तनधारियों 2-4 में अद्वितीय विकास तंत्र की जांच करने के लिए विभिन्न विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, WEC फ्लोरोसेंट डाई 5, कोशिका प्रत्यारोपण 6, और lipofection 7 और electroporation 8-13 के माध्यम से जीन परिचय का उपयोग करके जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती भ्रूण में इस तरह के सेल लेबलिंग जैसे अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त है.

हाल ही में, गर्भाशय हेरफेर में बाद के चरणों में कृंतक भ्रूण में विकास की प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और electroporation तकनीक 14-16 के साथ संयुक्त कर दिया गया है. हालांकि, इन तकनीकों के प्रारंभिक दौर में भ्रूण में डीएनए समाधान के सटीक स्थानीय इंजेक्शन प्राप्त करने की कठिनाइयों के कारण postimplantation और midgestation भ्रूण के हेरफेर के लिए उपयुक्त नहीं हैं. हालांकि जल्दी भ्रूण (में अल्ट्रासाउंड निर्देशित कोशिका प्रत्यारोपण और वायरल वैक्टर इंजेक्शन यानी, E8.5-E-9.5 माउस में) utero में पहले से 17,18, उत्कृष्ट कौशल के लिए एक उच्च सफलता दर के साथ इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं सूचित किया गया है. इसलिए, उच्च पहुँच पूर्व vivo साथ WEC माउस और चूहा भ्रूण के हेरफेर के लिए सम्मान के साथ फायदे हैं.

नर चूहों से तैयार तुरंत centrifuged (आईसी) चूहा सीरम अक्सर WEC माध्यम के लिए प्रयोग किया जाता है. भ्रूण (चूहे में माउस या E10.0 में E8.0 से पहले यानी,) postimplantation स्तर पर संवर्धित कर रहे हैं, सिंथेटिक मध्यम और आईसी चूहा सीरम का एक मिश्रण अक्सर WEC 19 के लिए एक माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है. कोई वर्तमान में उपलब्ध वैकल्पिक मीडिया की अनुमति देता है, क्योंकि हालांकि, मध्य गर्भ में संस्कृति भ्रूण को (यानी., E8.0-12.5 माउस भ्रूण या चूहा भ्रूण में E10.0-E14.5 में), 100% सीरम एक माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए इन विट्रो में सामान्य रूप से विकसित करने के लिए भ्रूण.

उच्च गुणवत्ता वाले चूहे सीरम की तैयारी हैWEC प्रयोगों में reproducibility को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. देरी centrifugation की तुलना में, आईसी लाल रक्त कोशिकाओं के अधिकांश पहले से ही आतंच थक्का से अलग हो गया है क्योंकि सीरम आतंच थक्का फैलाएंगे द्वारा एकत्र की है जब रक्तापघटन को कम करने का लाभ दिया है. रक्तलायी चूहा सीरम चूहा और माउस भ्रूण की सामान्य वृद्धि का समर्थन करने में विफल रहता है, के रूप में तत्काल centrifugation का उपयोग सीरम की तैयारी में देरी centrifugation का उपयोग तैयारी के लिए बेहतर है. हमारे प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में दो अतिरिक्त चरणों में हैं 18-20 (यानी., पूर्व पहले centrifugation के लिए बर्फ पर एकत्र रक्त भंडारण और पहले centrifugation के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एकत्र रक्त के नमूनों को बनाए रखने). पूर्व कदम खून का थक्का के गठन में देरी कर सकते हैं, और बाद के कदम आसान फैलाएंगे के लिए आतंच थक्का के solidification को बढ़ावा देता है. इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल शुरुआती द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, reproducing रक्त संग्रह और सीरमबस प्रोटोकॉल पुस्तकों का हवाला देते हुए सही निकासी 19-21 बेहद मुश्किल है. इस वीडियो लेख में, हम नर चूहों और centrifugation द्वारा सीरम की निकासी के उदर महाधमनी से रक्त संग्रह में शामिल हैं जो इष्टतम आईसी चूहा सीरम, की तैयारी के लिए हमारे मानक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है.

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Protocol

नोट: पशु प्रयोगों प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार आयोजित किया गया. मेडिसिन के Tohoku विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ पशु प्रयोग के लिए समिति के साथ साथ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी.

1. संज्ञाहरण और Laparotomy

  1. रक्त संग्रह के लिए, विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त पुरुष Sprague-Dawley चूहों का उपयोग करें. पानी उपलब्ध कराने, जबकि कम से कम 18 घंटे के लिए चूहों के लिए तेजी. रक्त एकत्र करने के लिए उम्र (550-650 ग्राम) के 6-8 महीनों में सेवानिवृत्त पुरुष ब्रीडर चूहों का प्रयोग करें.
  2. 10 मिनट के लिए 2.0-3.5 एल / मिनट पर संज्ञाहरण पेश करने का संज्ञाहरण तंत्र से जुड़े एक बॉक्स में, एक inhalational संवेदनाहारी है जो 2.5-4.0 isoflurane%, प्रवाह. संज्ञाहरण लागू करने के लिए बॉक्स में चूहों स्थानांतरण.
    1. संदंश के साथ पंजे पर उत्तेजना के जवाब के नुकसान के लिए जाँच करके anesthetization की पुष्टि करें. चूहों वाई की नाक को कवरगहराई से रक्त संग्रह के दौरान चूहों anesthetize को एक संज्ञाहरण तंत्र से जुड़े एक मुखौटा वें. एकाग्रता और प्रवाह क्रमश: 2.5-4.0% पर बनाए रखा और 2.0-3.5 एल / मिनट कर रहे हैं.
      नोट: भ्रूण इस अभिकर्मक प्रदर्शनी isoflurane 22 के साथ anesthetized चूहों से प्राप्त सीरम में सुसंस्कृत भ्रूण की तुलना में भ्रूण के विकास में देरी के साथ anesthetized चूहों से इकट्ठा किया जाता है कि सीरम में सुसंस्कृत क्योंकि Halothane साँस लेना संज्ञाहरण के लिए नहीं किया जाना चाहिए.
  3. फर के संक्रमण से बचने के लिए, anesthetized चूहे के पेट पर 70% इथेनॉल के गिरने से त्वचा कीटाणुरहित. संदंश की एक जोड़ी के साथ निचले क्षेत्र में कीटाणुरहित त्वचा और पेट की दीवार उठाओ और आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए बड़ी कैंची की एक जोड़ी के साथ छाती क्षेत्र की ओर एक साथ इन परतों में कटौती. संदंश की एक जोड़ी के साथ उदर गुहा के बाहर आंत को दर्शाते हैं.
  4. एक साथ हिंद अंग की ओर त्वचा और पेट की दीवार में कटौतीबड़ी कैंची की जोड़ी आगे पीछे पेट क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए. संदंश की एक जोड़ी के साथ उदर गुहा के बाहर अतिरिक्त वसा को दर्शाते हैं.
  5. संदंश के दो जोड़े का उपयोग midline पर आंत वसा उठाओ और उदर महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए एक समानांतर दिशा में ध्यान से वसा विभाजित. आसानी से उदर महाधमनी के बंटवारे की पहचान करने के लिए एक अनुदैर्ध्य दिशा में आंत वसा विभाजित करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. इसके अलावा, महाधमनी काँपने के गुणवाला है और इस विशेषता का उपयोग आसन्न रग से प्रतिष्ठित किया जा सकता.
  6. संदंश के दो जोड़े के साथ सावधानी से उदर महाधमनी के आसपास चर्बी और विभाजन उठाओ और उदर महाधमनी पर वसा अलग.

2. रक्त संग्रह

  1. ध्यान से नीचे की दिशा में उठाव साथ महाधमनी के विभाजन, को तुरंत कपाल एक 20 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़े एक 21 जी सुई की नोक डालें. एक साथ सिरिंज पकड़ोहाथ, और एक नर चूहे से रक्त की 15 मिलीलीटर एकत्र करने के लिए धीरे धीरे सिरिंज खींच.
  2. सिरिंज से सुई निकालें, और दो ​​ठंडा 10 मिलीलीटर बाँझ टेस्ट ट्यूब (चित्रा 1 ए) में खून बहना. Centrifugation के खून का थक्का के गठन में देरी करने के लिए जब तक बर्फ पर ट्यूबों रखें. एक समय में कई ट्यूब centrifuging द्वारा centrifugation समय कम करें.
  3. Thoracotomy और दिल या कत्ल काटने से anesthetized चूहा euthanize.

3. चूहा सीरम तैयारी

  1. ऊपरी और निचले स्तर (चित्रा 1C) में रक्त अलग करने के लिए 1,200 XG और कमरे के तापमान (आर टी) में 5 मिनट के लिए एकत्र रक्त अपकेंद्रित्र.
  2. आतंच थक्का ठीक करने के लिए 1.5-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों रखें.
  3. घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग ऊपरी परत में आतंच थक्का उठाओ, और सीरम अलग करने के लिए आतंच थक्का निचोड़. फिर, मत का सामना करना पड़ घुमावदार संदंश के साथ आतंच थक्का प्रेसदो परतों (चित्रा -1) के बीच इंटरफेस के पास wnwards.
  4. आगे आतंच थक्का अलग करने के लिए कदम 3.3 दोहराएँ.
  5. 1,200 XG और आर टी (चित्रा 1E) में 5 मिनट के लिए टेस्ट ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  6. ध्यान से एक लामिना हवा का प्रवाह कैबिनेट में एक बाँझ पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में सीरम हस्तांतरण.
  7. किसी भी शेष लाल कोशिकाओं को निकालने के लिए 1,200 XG और आरटी पर 5 मिनट के लिए एकत्र चूहा सीरम अपकेंद्रित्र.
  8. ट्यूब (चित्रा 1F) के तल पर अवशिष्ट लाल कोशिकाओं द्वारा संक्रमण से बचने के लिए एक बाँझ पिपेट का उपयोग ट्यूब निष्फल एक नया 15 एमएल में ध्यान से सीरम पूल.
  9. पूरक प्रणाली को निष्क्रिय करने के लिए 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में सीरम सेते हैं.
  10. लामिना हवा का प्रवाह कैबिनेट में आर टी के लिए चूहा सीरम की नलियों कूल. सीरम व्यक्ति बाँझ ट्यूब में 10 मिलीलीटर aliquoted किया जाना चाहिए. उपयोग (चित्रा 1H) तक -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब की दुकान.

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Representative Results

चित्रा 1 रक्त कोशिकाओं और सीरम के विभाजन के लिए वर्णित प्रक्रियाओं के प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. हम आम तौर पर एक सेवानिवृत्त पुरुष चूहा (चित्रा 1 ए) से रक्त का 15 मिलीलीटर प्राप्त करते हैं. Centrifugation द्वारा एकत्र रक्त सीरम और एक तीर के साथ संकेत दिया है जो आतंच थक्का,, और रक्त कोशिकाओं (चित्रा 1C) युक्त एक निचली परत युक्त एक ऊपरी परत में विभाजित किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, रक्तलायी रक्त के नमूने सीरम और रक्त परतों (चित्रा 1 बी) में विभाजित नहीं किया जा सकता. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब छोड़ने के बाद, आतंच थक्का ठोस हो जाता है. इस solidification घुमावदार संदंश की एक जोड़ी (चित्रा -1) का उपयोग आतंच थक्का से सीरम की जुदाई के लिए सुविधाजनक है. टेस्ट ट्यूब बाद में centrifuged था. आतंच थक्का सीरम और रक्त कोशिका परतों (चित्रा 1E) के बीच इंटरफेस में दिख रहा है. दो टेस्ट ट्यूब से सीरम में इकट्ठा किया गया थाएक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग कर एक नया ट्यूब. इस पूरी प्रक्रिया में सफल रहता है तो हम एक नर चूहे से सीरम के लगभग 6 मिलीग्राम प्राप्त कर सकते हैं. आगे लाल कोशिकाओं को निकालने के लिए एकत्र सीरम फिर centrifuged था. किसी भी शेष लाल कोशिकाओं ट्यूब (चित्रा 1F) के तल पर उपजी. हम एक नया ट्यूब पर तैरनेवाला तबादला और हम Centrifugation के बाद ऊपरी स्तर से सीरम एकत्र करने में सक्षम हैं, भले ही रक्तापघटन की डिग्री न्याय करने के लिए शुद्ध सीरम का रंग की जाँच की. हल्के रक्तापघटन साथ चूहा सीरम एक गुलाबी रंग (चित्रा 1G में सही ट्यूब) दर्शाती है, जबकि WEC के लिए आदर्श चूहा सीरम आम तौर पर, (चित्रा 1G में ट्यूब बाएं) एक हल्के पीले रंग दर्शाती है. आईसी चूहा सीरम (चित्रा 1H में छोड़ दिया) -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 6-12 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. जमे हुए जब हल्के रक्तापघटन साथ सीरम (चित्रा 1H में छोड़ दिया) आदर्श सीरम से एक गहरे रंग का प्रदर्शन किया.


चित्रा 1. रक्त centrifugation और नर चूहों से सीरम की तैयारी के लिए प्रक्रियाओं. ए) एक नर चूहे से एकत्र रक्त के नमूने). Centrifugation के लिए दो टेस्ट ट्यूब में समान रूप से विभाजित बी, सी) गैर अलग हो नमूना (बी) और सीरम और आतंच थक्का युक्त ऊपरी परत में आदर्श जुदाई (सी में तीर रहे हैं और पहले centrifugation. डी) के बाद रक्त कोशिकाओं से युक्त निचली परत आतंच थक्का संदंश की एक जोड़ी का उपयोग निचोड़ा है. ई) सीरम और रक्त कोशिका परतों दूसरा Centrifugation के बाद. रक्त कोशिकाओं की आतंच थक्का इंटरफेस (तीर) पर मनाया जाता है. एफ) वर्षा तीसरे centrifugation (तीर). जी) के बाद छोड़ दिया ट्यूब एक प्रकाश पीले रंग के साथ आदर्श चूहा सीरम से पता चलता है. सही ट्यूब हल्के रक्तापघटन साथ चूहा सीरम से पता चलता है.

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Discussion

WEC प्रयोगों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों उच्च गुणवत्ता आईसी चूहा सीरम और सही भ्रूण विच्छेदन तकनीक 3 के उपयोग पर निर्भर हैं. उपवास रक्त में ग्लूकोज सांद्रता मानकीकृत करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि रक्त एकत्रित करने से पहले उपवास की अवधि को छोटा मत करो. हार्मोन के स्तर estrous चक्र के अनुसार मादा पशुओं में बदल क्योंकि मादा चूहों सीरम की तैयारी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, और estradiol हार्मोन में इस तरह के बदलाव भ्रूण संस्कृतियों के लिए अनुपयुक्त हैं. इसके अलावा, अत्यंत फैटी नर चूहों के रक्त में लिपिड संदूषण की एक बड़ी राशि से बचने के लिए सीरम तैयारी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.

रक्त एकत्रित करते हैं, तो पहले धमनियों से रक्त का रंग संज्ञाहरण के तहत सामान्य श्वास को दर्शाती है, एक चमकदार लाल रंग है कि यह सुनिश्चित करें. कमी हुई साँस लेने में एकत्र रक्त की मात्रा की कमी आती है. ऐसे मामलों में ठीक करने, अस्थायी रूप से सिरिंज पु है जिस गति से कमlled. सीरम तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण समस्या रक्तापघटन है. एकत्र रक्त के नमूनों गंभीर रक्तापघटन प्रदर्शन करते हैं, तो रक्त centrifugation द्वारा दो परतों में विभाजित किया जा करने में विफल रहता है. हल्का hemolyzed सीरम उप इष्टतम विकास का समर्थन कर सकते हैं, क्योंकि इस तरह के सीरम खारिज किया जाना चाहिए. रक्तापघटन मजबूर दबाव से प्रेरित हो जाता है के रूप में रक्त एकत्रित करते समय, सिरिंज धीरे से निकाला जाना चाहिए. यह एकत्र रक्त के नमूनों रक्तापघटन बढ़ जाती है, जो टेस्ट ट्यूब में डाल रहे हैं जब रक्त बुदबुदाती से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.

संस्कृति माउस भ्रूण के लिए, नर चूहों से एकत्र आईसी सीरम आदर्श हो सकता है; हम एक माउस से खून का एक बड़ा पर्याप्त मात्रा प्राप्त नहीं कर सकता क्योंकि हालांकि, इस आवश्यकता को व्यावहारिक नहीं है. हम चूहे सीरम तैयार करते हैं, तो हम कम से कम 10 नर चूहों प्रजनन सेवानिवृत्त तैयार करते हैं. हमारी प्रयोगशाला में, रक्त संग्रह नियमित रूप से कम से कम दो व्यक्तियों द्वारा किया जाता है: व्यक्तिगत रक्त और व्यक्तिगत anesthetizing इकट्ठा करने और प्रदर्शनपहले centrifugation.

तिथि करने के लिए, रासायनिक परिभाषित मध्यम संयोजन से WEC में वाणिज्यिक चूहा सीरम का उपयोग कर कई अध्ययनों 23-25 ​​सूचित किया गया है. उदाहरण के लिए, 50% व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूहा सीरम और 50% DMEM के एक मिश्रण 36 घंटा, 23 और 40 घंटे के लिए 24 E9.75 माउस भ्रूण की सामान्य वृद्धि के लिए E8.5 माउस भ्रूण की सामान्य वृद्धि का समर्थन करता है. एक और प्रोटोकॉल में, एन 2 के साथ पूरक एक और कंपनी और 50% F12 मध्यम से उपलब्ध 50% चूहा सीरम से बना मिश्रण भी 24 घंटा 25 के लिए E7.5 और E8.5 माउस भ्रूण के समुचित विकास का समर्थन करता है. हालांकि, यह इन मिश्रित मीडिया में इस तरह के चूहों में E11.5-E12.5 और चूहों में E13.5-E14.5 के रूप में बाद के चरणों, पर चूहा और माउस भ्रूण की संस्कृति के लिए उपयुक्त हैं या नहीं अस्पष्ट बनी हुई है. बजाय चूहा सीरम की विभिन्न वैकल्पिक मीडिया का उपयोग WEC पढ़ाई भी 26-28 सूचित किया गया है. उदाहरण के लिए, DMEM/F12 और 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का एक संयोजन गतिविधियों का समर्थन करता है28 घंटा 26 के लिए E11.5 से चूहा भ्रूण की opment. हालांकि, इस माध्यम से 28 घंटा 26 के लिए E10.5 से चूहा भ्रूण संस्कृति के लिए उपयुक्त नहीं है. इसलिए, हम FBS युक्त मध्यम में भ्रूण की सामान्य वृद्धि भ्रूण के भ्रूण अवस्था पर निर्भर है कि विश्वास करते हैं.

केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भ्रूण स्टेम सेल मीडिया, गोजातीय सीरम albumin, और एन 2 पूरक सहित परिभाषित अभिकर्मकों, के शामिल सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया का उपयोग WEC सूचित किया गया है. यह मध्यम 16-40 घंटा 27 के लिए E10.5 माउस भ्रूण की संस्कृति का समर्थन करता है, 28. Morre स्कॉट, एट अल. 24 घंटे के लिए सभ्य माउस भ्रूण के ताज से दुम आकार E11 की तुलना में काफी छोटा होता है कि प्रदर्शन किया utero में उगाया .5 भ्रूण. हालांकि, इस तरह के somites और पृष्ठीय रूट ganglia के रूप में प्राचार्य संरचनाएं, इन सुसंस्कृत भ्रूण में सामान्य दिखाई. दूसरी ओर, Kalaskar और लॉडरडेल इस माध्यम में परीक्षण भ्रूण के 60% के आदर्श का प्रदर्शन किया है कि सूचना दीअल विकास 18 घंटा बाद में, लेकिन एक अतिरिक्त 20-22 घंटे के लिए सुसंस्कृत भ्रूण में अच्छा विकास की दर 30-40% से गिरा दिया. इन अध्ययनों के विपरीत, हम सफलतापूर्वक दो दिनों के लिए हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन 100% आईसी चूहा सीरम में सभ्य माउस और चूहा भ्रूण के अच्छे विकास को पुन: पेश कर सकते हैं (यानी., लगभग 48 घंटे) E12.5 से चूहों 6 या E10.5 में 24 घंटा में एक बार मध्यम बदलकर चूहों 8 में. इन परिणामों के आईसी चूहा सीरम की तैयारी के लिए हमारे विधि स्तनधारी WECat अलग भ्रूण चरणों को लागू करने के प्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयोगी सुझाव है कि. इसलिए, हम अपने वीडियो प्रोटोकॉल नई शोधकर्ताओं ने अपने प्रयोगशालाओं को WEC का उपयोग कर प्रयोगों को पेश करने में मदद मिलेगी.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

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References

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स्तनधारी पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए उपयुक्त चूहा सीरम की तैयारी
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Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa,… More

Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

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