Introduction
En mängd olika modelldjur används i utvecklingsbiologi för att undersöka utvecklings mekanismer på molekylär och cellulär nivå. Till exempel har amfibie-och fågelarter stor utsträckning använts som klassiska modelldjur som är lämpliga för direkt manipulation av embryon, därför att dessa embryon utvecklas utanför modern. Till skillnad från dessa djur, embryon från däggdjur växer i livmodern hos modern, och tillväxt i senare skeden är synnerligen beroende på funktionen av livmodern. Därför är det ofta svårt att direkt manipulera embryon från däggdjur som de från mus och råtta i tidiga skeden. På 1960-talet, Denis Ny etablerat ett däggdjur hel embryo kultur (WEC) teknik med hjälp av WEC apparater med en kontinuerlig syrgastillförsel och värmekontroll 1. I WEC kan mus-och råttembryon växer ex vivo (dvs. utanför livmodern). Även WEC teknik användes ofta i teratologi genom att lägga till olika kemikalier och kemiskaAl-föreningar i odlingsmediet, denna teknik har också använts i olika utvecklingsbiologiska studier för att undersöka unika utvecklingsmekanismer i däggdjur 2-4. Till exempel är WEC kombineras med andra tekniker, såsom cell-märkningen, i vild typ och mutanta embryon genom att använda fluorescerande färgämnet 5, celltransplantation 6 och genintroduktion via lipofektion 7 och elektroporering 8-13.
Nyligen, i livmodern manipulation har använts för att analysera utvecklingsprocesser i gnagare embryon i senare skeden och har kombinerats med elektroporation tekniker 14-16. Men dessa tekniker är inte lämpliga för manipulering av implantationen och midgestation embryon på grund av svårigheter att uppnå korrekt lokal injektion av DNA-lösningen i embryon i ett tidigt skede. Även ultraljud-styrda celltransplantation och injektion av virala vektorer i tidiga embryon (dvs., E8.5-E-9.5 i musen) i livmodern har rapporterats tidigare 17,18, är utmärkta kunskaper som krävs för att utföra dessa experiment med ett bra resultat. Därför WEC med hög tillgänglighet ex vivo har fördelar med avseende på hantering av mus-och råttembryon.
Omedelbart centrifuger (IC) råttserum bereddes från hanråttor används ofta för WEC medium. När embryon odlas vid implantationen skede (dvs tidigare än E8.0 i mus eller E10.0 i råtta), är en blandning av syntetiskt medium och IC råttserum ofta används som ett medium för WEC 19. Men att odla embryon vid mitten av dräktigheten (dvs.., E8.0-12.5 i musembryon eller E10.0-E14.5 i råttembryon), 100% serum bör användas som ett medium för att ingen för närvarande tillgänglig alternativa medier tillåter embryon att växa normalt in vitro under mer än 2 dagar.
Beredningen av högkvalitativa råttserum ärett avgörande steg för att uppnå reproducerbarhet i WEC experiment. Jämfört med fördröjd centrifugering, har IC den fördelen att minska hemolys när serumet uppsamlas genom att klämma fibrinkoagel eftersom de flesta av de röda blodkropparna har redan separerats från fibrinkoagel. Som hemolytisk råttserum inte stödja den normala tillväxten av råtta och mus embryon, är framställningen av serum med hjälp av omedelbar centrifugering att föredra framför beredning med hjälp av försenad centrifugering. Vår protokoll innehåller två ytterligare steg jämfört med andra protokoll 18-20 (dvs.., Lagra det uppsamlade blodet på is före den första centrifugeringen och upprätthålla de uppsamlade blodproven för 2 timmar vid 4 ° C efter den första centrifugeringen). Den förra steget kan fördröja bildningen av blodproppen, och den senare steg främjar stelnande av fibrinkoagel för enkel klämma. Därför kan våra protokoll kan användas av nybörjare. Men återge blodinsamling och serumutvinning noggrant genom att helt enkelt hänvisa till protokoll böcker är oerhört svårt 19-21. I denna video artikeln visar vi vårt standardprotokoll för beredning av optimal IC råttserum, vilket inkluderar insamling blod från bukaorta hos hanråttor och utvinning av serumet genom centrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Djurexperiment utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Kommittén för djurförsöks i Tohoku University School of Medicine godkände de experimentella procedurer som beskrivs häri.
1. Anestesi och Laparotomy
- För blodinsamling, använda specifika patogenfria Sprague-Dawley. Snabb råttorna i minst 18 timmar samtidigt som vatten. Använd pensionerade manliga uppfödare råttor vid 6-8 månaders ålder (550-650 g) för insamling av blod.
- Flöde 2,5 till 4,0% isofluran, som är ett inhalationsanestetikum, i en låda som är ansluten till en anestesiapparat införa anestesi vid 2,0 till 3,5 l / min under 10 min. Överför råttor in i rutan för att införa anestesi.
- Bekräfta anesthetization genom att kontrollera för förlusten av svaret på stimulering på tassarna med pincett. Täck näsan av råttor with en mask kopplad till en anestesiapparat för djupt söva råttorna under provtagningen. Koncentrationen och flödet bibehålls vid 2,5 till 4,0% och från 2,0 till 3,5 l / min, respektive.
OBS: Halotan bör inte användas för inhalationsanestesi eftersom embryon odlas i serum som samlas in från råttor sövda med detta reagens uppvisar en försening i foster-utveckling jämfört med embryon odlade i serum som erhållits från råttor sövda med isofluran 22.
- Bekräfta anesthetization genom att kontrollera för förlusten av svaret på stimulering på tassarna med pincett. Täck näsan av råttor with en mask kopplad till en anestesiapparat för djupt söva råttorna under provtagningen. Koncentrationen och flödet bibehålls vid 2,5 till 4,0% och från 2,0 till 3,5 l / min, respektive.
- För att undvika kontaminering av päls, desinficera huden genom att hälla 70% etanol på buken hos sövd råtta. Plocka upp den desinficeras huden och bukväggen i den nedre regionen med en pincett och skär dessa lager samtidigt mot thorax-regionen med ett par stora saxar för att avslöja de inre organen. Reflektera tarmen utanför bukhålan med en pincett.
- Skär huden och bukväggen mot bakbenen med enpar stora saxar för att ytterligare exponera den bakre bukhålan. Reflektera extra fett utanför bukhålan med en pincett.
- Plocka upp visceralt fett vid mittlinjen genom att använda två par av pincett och dela upp fett noggrant i en parallell riktning för att exponera den abdominala aortan. Upprepa denna procedur för att dela upp visceralt fett i en längdriktning för att lätt identifiera bifurkation av den abdominala aortan. Dessutom är aortan pulserande och kan skiljas från den intilliggande vena cava med användning av denna egenskap.
- Plocka upp fettet runt bukaorta och bifurkationen försiktigt med två par pincett och separera fettet på bukaortan.
2. Blodsamling
- Försiktigt in spetsen på en 21 G nål ansluten till en 20 ml spruta omedelbart kraniell till bifurkation av stora kroppspulsådern, med fasning i en nedåtgående riktning. Håll sprutan med enhanden, och dra sprutan långsamt för att samla in 15 ml blod från en hanråtta.
- Ta bort nålen från sprutan och hälla blodet i två iskalla 10-ml sterila provrör (Figur 1A). Håll rören på is tills centrifugering för att fördröja bildandet av blodpropp. Minska centrifugeringstiden genom att centrifugera flera rör på samma gång.
- Euthanize sövd råtta genom torakotomi och skära hjärtat eller halshuggning.
3. Råttserum Framställning
- Centrifugera det uppsamlade blodet i 5 min vid 1200 x g och rumstemperatur (RT) för att separera blodet i övre och undre lager (figur 1C).
- Förvara rören vid 4 ° C under 1,5 till 2 h för att fixera fibrinkoagel.
- Plocka upp fibrinkoagel i det övre skiktet med hjälp av ett par krökta pincett, och pressa fibrinkoagel att separera serumet. Tryck sedan på fibrinkoagel med böjda pincett inför downwards nära gränsytan mellan de två skikten (figur 1D).
- Upprepa steg 3.3 för att ytterligare lossa fibrinkoagel.
- Centrifugera Provrör för 5 minuter vid 1200 x g och RT (figur 1E).
- Försiktigt överföra serumet i en 15 ml sterilt rör med hjälp av en steril pipett i ett laminärt luftflöde skåpet.
- Centrifugera den uppsamlade råttserum under 5 min vid 1200 x g och rumstemperatur för att avlägsna eventuella kvarvarande röda blodkroppar.
- Pool serumet försiktigt i en ny 15 ml sterilt rör med hjälp av en steril pipett för att undvika kontaminering av kvarvarande röda blodkroppar i botten av röret (figur 1F).
- Inkubera serum i ett vattenbad vid 56 ° C under 30 minuter för att inaktivera komplementsystemet.
- Kyl rören av råttserum till RT i laminärt luftflödesskåp. Serumet bör alikvoteras till 10 ml i enskilda sterila rör. Förvara rören vid -20 ° C fram till användning (fig 1 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar representativa resultat av de beskrivna förfarandena för separation av blodkroppar och serum. Vi erhåller typiskt 15 ml blod från en pensionerad hanråtta (Figur 1A). Genom centrifugering, kan det uppsamlade blodet separeras i ett övre skikt, som innehåller serum och fibrinkoaglet, vilket anges med en pil, och ett undre skikt som innehåller blodcellerna (figur 1C). Viktigt kan hemolytiska blodprov inte separeras i serum och blodlager (Figur 1B). Efter att ha lämnat röret vid 4 ° C under 2 h, blir fibrinkoagel fast substans. Denna stelning är praktiskt för separation av serum från fibrinkoagel användning av ett par böjda pincett (figur 1D). Provröret centrifugeras sedan. Fibrinkoaglet syns vid gränsytan mellan serum och blodcellskikt (figur 1E). Serum från de två provrör samlades inett nytt rör med användning av en engångspipett. Vi kan få cirka 6 ml serum från en råtta av hankön om hela proceduren är framgångsrik. För att ytterligare avlägsna röda blodkroppar, var de insamlade serum centrifugeras igen. Eventuella kvarvarande röda cellerna utfälldes på botten av röret (figur 1F). Vi överförs supernatanten till ett nytt rör och kontrolleras färgen för den renade serum för att bedöma graden av hemolys trots att vi kan samla in serum från det övre skiktet efter centrifugering. Den ideala råttserum för WEC typiskt uppvisar en ljusgul färg (vänstra röret i figur 1G) medan råttserum med lätt hemolys uppvisar en rosaaktig färg (höger röret i figur 1G). IC-råttserum kan lagras under minst 6 till 12 månader vid -20 ° C (till vänster i fig 1 H). Serumet med mild hemolys uppvisade en djupare färg än den ideala serum när frysta (vänster i figur 1H).
Figur 1. Rutiner för blodcentrifugering och beredning av serum från hanråttor. A) De blodprover som samlats in från en hanråtta delas lika i två provrör för centrifugering. B, C) icke-separerade provet (B) och perfekt separation i det övre skiktet, som innehåller serum och fibrinkoaglet (pilen i C) och det undre skiktet, som innehåller blodkroppar efter den första centrifugeringen. D) Fibrinkoaglet pressas med hjälp av en pincett. e) serum-och blodcellskikt efter den andra centrifugeringen. Fibrinkoaglet observeras vid gränssnittet (pilspetsar). F) Utfällning av blodceller efter den tredje centrifugering (pil). G) Den vänstra röret visar perfekt råttserum med en lätt gulaktig färg. Den högra röret visar råttserum med mild hemolys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reproducerbara resultat i WEC experiment är beroende av användningen av högkvalitativa IC råttserum och korrekt embryo dissektion teknik 3. Inte förkorta perioden av fasta innan samla blod eftersom fastan är nödvändigt att standardisera glukoskoncentrationer i blodet. Honråttor bör inte användas för framställning av serum eftersom hormonnivåerna förändras på hondjur enligt estrous cykeln, och sådana förändringar i estradiol hormoner är olämpliga för embryokulturer. Dessutom bör extremt fet hanråttor inte användas för serum preparatet för att undvika en stor mängd kontamine lipid i blodet.
Vid uppsamling av blod, först se till att färgen på artärblodet är en klarröd färg, vilket återspeglar normal andning under narkos. Minskad andning leder till en minskning av mängden insamlat blod. För att återhämta sig i sådana fall tillfälligt minska den hastighet med vilken sprutan är pulled. Det mest kritiska problemet i serum preparatet är hemolys. Om de insamlade blodproverna uppvisar allvarlig hemolys, misslyckas blod som skall separeras i två skikt genom centrifugering. Eftersom milt hemolyserat serum kan stödja optimal utveckling, bör sådan serum kasseras. Som hemolys tenderar att sättas igång med forcerad tryck, bör sprutan dras långsamt när du samlar blodet. Det är viktigt att undvika bubbling blodet när de uppsamlade blodproven hälldes i provrör, vilket ökar hemolys.
För embryon kultur mus, kan IC serum samlas in från hanmöss vara perfekt; emellertid är detta krav inte praktiskt eftersom vi inte kan erhålla en tillräckligt stor volym av blod från en mus. När vi förbereder råttserum, förbereder vi minst 10 pensionerade avels hanråttor. I vårt labb, är bloduppsamlingsrutinmässigt utförs av åtminstone två personer: individen uppsamling av blod och individen anesthetizing och utföraförsta centrifugering.
Hittills har flera studier som använder kommersiella råttserum i WEC genom att kombinera kemiskt definierat medium rapporterats 23-25. Till exempel kan en blandning av 50% kommersiellt tillgänglig råttserum och 50% DMEM stöder den normala tillväxten av embryon E8.5 mus för 36 tim 23 och den normala tillväxten av E9.75 musembryon efter 40 tim 24. I ett annat protokoll, en blandning bestående av 50% råttserum tillgänglig från ett annat företag och 50% F12 medium kompletterat med N-2 stöder också god tillväxt av E7.5 och E8.5 musembryon för 24 tim 25. Det är dock fortfarande oklart om dessa kombinatoriska medier är lämpliga för odling av råtta och mus embryon i senare skeden, till exempel E11.5-E12.5 i möss och E13.5-E14.5 hos råttor. WEC studier med olika alternativa medier istället för råttserum har också rapporterats 26-28. Till exempel kan en kombination av DMEM/F12 och 20% fetalt bovint serum (FBS) stöder devellingen av råttembryon från E11.5 till 28 tim 26. Emellertid är detta medium inte lämplig för råttembryoodling från E10.5 för 28 hr 26. Därför tror vi att den normala tillväxten av embryon i ett medium innehållande FBS är beroende av fosterstadiet av embryona.
WEC användning av serumfritt odlingsmedium bestående endast av definierade reagens, inklusive kommersiellt tillgängliga embryonal stamcell media, bovint serumalbumin, och N-2 supplement har rapporterats. Detta medium stödjer kulturen av E10.5 musembryon i 16-40 h. 27, 28. Morre-Scott, et al. Visade att kron-till-bakdel storleken av musembryon odlade under 24 timmar är signifikant mindre än den för E11 0,5 embryon odlas i livmodern. Men de grundläggande strukturer, såsom somites och dorsalrotsganglier verkar normala i dessa odlade embryon. Å andra sidan, Kalaskar och Lauderdale rapporterade att 60% av embryon som testades i detta medium uppvisade normal utveckling 18 timmar senare, men graden av god utveckling i embryon odlade i ytterligare 20-22 timmar sjönk till 30-40%. Till skillnad från dessa studier kan vi framgångsrikt reproducera bra utveckling av mus-och råttembryon som odlats i 100% IC-råttserum producerade genom att använda våra protokoll för två dagar (dvs. Cirka 48 h) från E12.5 hos råttor 6 eller E10.5 i möss 8 genom att ändra mediet en gång vid 24 tim. Dessa resultat antyder att vår metod för framställning av IC-råttserum är användbar för en mängd olika experiment som gäller däggdjurs WECat olika embryonala steg. Därför hoppas vi att vår video-protokollet kommer att hjälpa nya forskare introducerar experiment med WEC till sina laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. , 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
