Introduction
En rekke modell dyr brukes i utviklingsbiologi å undersøke utviklingsmessige mekanismer ved de molekylære og cellulære nivåer. For eksempel har amfibier og fuglearter blitt mye brukt som klassiske modell dyr som er egnet for direkte manipulasjon av befruktede egg fordi disse embryoene utvikler utenfor moren. I motsetning til disse dyrene, pattedyrembryoer vokse i uterus hos moren, og vekst på senere stadier er i avgjørende grad avhengig av hvilken funksjon av livmoren. Derfor er det vanligvis vanskelig å manipulere direkte pattedyrembryoer slik som de fra mus og rotte ved tidlige stadier. I 1960, Denis Ny etablert et pattedyr hele embryo kultur (WEC) teknikken bruker WEC apparater med en kontinuerlig oksygentilførsel og varme kontroll en. I WEC, kan mus-og rotte-embryoer vokser ex vivo (det vil si utsiden av livmor). Selv om WEC teknikken ble ofte brukt i teratologistudie ved å legge ulike chemical forbindelser i kulturmediet, denne teknikken har også blitt brukt i forskjellige utviklingsbiologiske studier for å undersøke unike utviklingsmessige mekanismer i pattedyr 2-4. For eksempel er WEC kombinert med andre teknikker, slik som cellemerking, i vill-type og mutante embryoer ved hjelp av fluorescerende fargestoff 5, celletransplantasjon 6, og genet innføring via lipofection 7 og elektroporering 8-13.
Nylig, i utero manipulering har blitt brukt til å analysere utviklingsprosesser i gnager embryoer på senere stadier, og har vært kombinert med electroporation teknikker 14-16. Imidlertid er disse teknikker er ikke egnet for manipulering av fostertap og midgestation embryoer på grunn av vanskeligheter med å oppnå nøyaktig lokal injeksjon av DNA-løsningen i embryoer i tidlig stadium. Selv om ultralydveiledet celletransplantasjon og injeksjon av virale vektorer i tidlige embryoer (dvs., E8.5-E-9.5 i mus) i utero har blitt rapportert tidligere 17,18, blir gode ferdigheter som kreves for å utføre disse eksperimentene med en høy suksessrate. Derfor WEC med høy tilgjengelighet ex vivo har fordeler med hensyn til manipulering av muse-og rotte-embryoer.
Umiddelbart sentrifugert (IC) rotte serum forberedt fra hannrotter er ofte brukt for WEC medium. Når embryo dyrkes på fostertap scenen (dvs. tidligere enn E8.0 i musen eller E10.0 i rotte), er en blanding av syntetisk medium og IC rotte serum ofte brukt som et medium for WEC 19. Men til kultur embryoer ved midten av svangerskapet (ie., E8.0-12.5 i muse embryoer eller E10.0-E14.5 i rotte embryoer), 100% serum bør brukes som et medium fordi ingen for tiden tilgjengelig alternativ media lar embryoer å vokse normalt in vitro for mer enn to dager.
Fremstilling av høykvalitets rotteserum eret avgjørende skritt for å oppnå reproduserbarhet i WEC eksperimenter. Sammenlignet med forsinket sentrifugering, har IC fordelen av å redusere hemolyse når serumet oppsamles ved å klemme på fibrinkoagel fordi de fleste av de røde blodlegemene allerede er skilt fra fibrinkoagel. Som hemolytisk rotteserum unnlater å støtte normal vekst av rotter og mus embryo, i fremstillingen av serum ved hjelp av umiddelbar sentrifuge å foretrekke fremfor fremstilling ved bruk av forsinket sentrifugering. Vår protokoll inneholder ytterligere to trinn i forhold til andre protokoller 18 til 20 (dvs.., Lagring av den oppsamlede blod på is før den første sentrifugering og vedlikehold av de innsamlede blodprøver i 2 timer ved 4 ° C etter den første sentrifugering). Den tidligere trinn kan forsinke dannelsen av blodpropp, og sistnevnte trinn fremmer størkning av fibrinkoagel for enkel klemme. Derfor kan vår protokoll brukes av nybegynnere. Men reprodusere blodprøvetaking og serumekstraksjon nøyaktig ved ganske enkelt å henvise til protokoll bøker er ekstremt vanskelig 19-21. I denne video artikkelen, viser vi vår standard protokoll for fremstilling av optimal IC rat serum, som omfatter blodsamling fra abdominal-aorta hos hannrotter og utvinning av serumet ved sentrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Komiteen for forsøk med dyr av Tohoku University School of Medicine godkjent forsøksprosedyrer som er beskrevet her.
En. Anestesi og Laparotomi
- For blodprøvetaking, bruke spesifikke patogen-fri mannlige Sprague-Dawley rotter. Fast rottene i minst 18 timer samtidig som vann. Bruk pensjonerte mannlige oppdretter rotter ved 6-8 måneders alder (550-650 g) for innsamling av blod.
- Strømnings 2,5 til 4,0% isofluran, som er en inhalasjonsanestetikumet, inn i en boks som er koblet til et anestesiapparat for å innføre anestesi på 2,0 til 3,5 L / min i 10 min. Overfør rotter inn i boksen for å innføre anestesi.
- Bekreft anesthetization ved å sjekke for tap av respons på stimulering på potene med tang. Dekk til nese av rotter with en maske som er koblet til et anestesiapparat for å dypt anesthetize rottene under fyllingen. Konsentrasjonen og strømnings blir opprettholdt ved 2,5 til 4,0%, og 2,0 til 3,5 L / min, henholdsvis.
MERK: Halotan skal ikke benyttes til inhalasjonsanastesi fordi embryoer dyrket i serum som er samlet fra rotter bedøvet med dette reagenset utviser en forsinkelse i embryoutvikling, sammenlignet med embryoer dyrket i serum oppnådd fra rotter bedøvet med isofluran 22..
- Bekreft anesthetization ved å sjekke for tap av respons på stimulering på potene med tang. Dekk til nese av rotter with en maske som er koblet til et anestesiapparat for å dypt anesthetize rottene under fyllingen. Konsentrasjonen og strømnings blir opprettholdt ved 2,5 til 4,0%, og 2,0 til 3,5 L / min, henholdsvis.
- For å unngå forurensning av pelsen, desinfisere huden ved å helle 70% etanol på magen av bedøvet rotte. Ta opp den desinfiserte hud og bukveggen ved den nedre region med en pinsett og kutte disse lagene samtidig mot thorax region med et par store saks for å eksponere de indre organer. Reflekter gut utenfor bukhulen med en pinsett.
- Kutt i huden og bukveggen mot baklemmene med enpar store saks om å avsløre den bakre mageregionen. Reflekter ekstra fett utenfor bukhulen med en pinsett.
- Løft av visceralt fett på midtlinjen ved hjelp av to par av pinsetter og splitte fettet omhyggelig i en parallell retning til å eksponere den abdominale aorta. Gjenta denne prosedyren for å splitte visceralt fett i lengderetningen for enkelt å identifisere den todeling av abdominal aorta. I tillegg er aorta pulsatile og kan skilles fra den tilstøtende vena cava ved hjelp av denne egenskap.
- Plukk opp fettet rundt magepulsåren og bifurcation nøye med to par pinsett og skille fett på mage aorta.
2. Blodprøvetaking
- Forsiktig sett spissen av en 21 G nål koblet til en 20 ml sprøyte umiddelbart cranial til forgreningen av aorta, med skråkant i en nedadgående retning. Hold sprøyten med etthånd, og trekk sprøyten sakte å samle inn 15 ml blod fra en hannrotte.
- Fjern kanylen fra sprøyten, og helle blod i to iskalde 10-ml sterile reagensrør (Figur 1a). Hold rørene på is inntil sentrifugering for å forsinke dannelsen av blodpropp. Reduser sentrifuge gang ved sentrifugering flere rør samtidig.
- Avlive bedøvet rotte ved Thoracotomi og kutte hjertet eller halshogging.
Tre. Rat Serum Forberedelse
- Sentrifuger oppsamlet blod i 5 min ved 1200 x g og romtemperatur (RT) for å separere blod i øvre og nedre lag (figur 1C).
- Hold rørene ved 4 ° C i 1,5-2 timer for å løse fibrinkoagel.
- Ta opp fibrinkoagel i det øvre lag ved hjelp av et par av buede tang, og klem fibrinkoagel for å separere serumet. Deretter trykker du på fibrinkoagel med de buede tang overfor downwards i nærheten av grenseflaten mellom de to lag (Fig. 1D).
- Gjenta steg 3,3 til videre løsne fibrinkoagel.
- Sentrifuger reagensglass for 5 min ved 1200 xg og RT (figur 1E).
- Overføre forsiktig serumet til et 15 ml sterilt rør ved hjelp av en steril pipette i en laminær luftstrøm skap.
- Sentrifuger samlet rotte serum for 5 min ved 1200 xg og RT for å fjerne eventuelle gjenværende røde celler.
- Pool serumet nøye inn i et nytt 15 ml sterilt rør ved hjelp av en steril pipette for å unngå forurensning av gjenværende røde celler på bunnen av røret (fig. 1F).
- Inkuber serumet i et vannbad ved 56 ° C i 30 min for å inaktivere komplement-systemet.
- Avkjøl rørene i rotteserum til RT i den laminære luftstrømmen skap. Serumet bør alikvotert i 10 ml i individuelle sterile rør. Oppbevar rørene ved -20 ° C inntil bruk (figur 1 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fig. 1 viser representative resultater fra de beskrevne fremgangsmåter for separasjon av blodlegemer og serum. Vi vanligvis få 15 ml blod fra en pensjonert mannlig rotte (figur 1A). Ved sentrifugering, kan det oppsamlede blod separeres i et øvre sjikt inneholdende serum og fibrinkoagel, som er indikert med en pil, og et nedre lag som inneholder blodceller (figur 1C). Viktigere, kan hemolytiske blodprøver ikke deles inn i serum og blod lag (Figur 1b). Etter å ha forlatt røret ved 4 ° C i 2 timer, blir fibrinkoagel faststoff. Denne størkningen er fordelaktig for separering av serum fra fibrinkoagel ved hjelp av et par av buede tang (fig. 1D). Den reagensrør ble deretter sentrifugert. Den fibrinkoagel er synlig i grensesnittet mellom serum og blodcellelagene (figur 1E). Serumet fra de to reagensglass ble samlet oppet nytt rør ved hjelp av en engangspipette. Vi kan få omtrent 6 ml serum fra en hannrotte hvis hele prosedyren er vellykket. For ytterligere å fjerne røde blodceller, ble oppsamlet serum sentrifugeres igjen. Eventuelle gjenværende røde blodlegemer utfelles på bunnen av røret (fig. 1F). Vi overføres supernatanten til et nytt rør, og merket av fargen på det rensede serum for å bedømme graden av hemolyse selv om vi er i stand til å samle serum fra det øvre sjikt etter sentrifugering. Den ideelle rotte serum for WEC vanligvis viser en lys gul farge (venstre rør i figur 1G), mens rotte serum med mild hemolyse viser en rosa farge (høyre rør i figur 1G). IC rotteserum kan lagres i minst 6 til 12 måneder ved -20 ° C (til venstre i figur 1 H). Serumet med mild hemolyse oppviste en mørkere farge enn det ideelle serum når frosset (til venstre i figur 1 H).
Figur 1. Prosedyrer for blodsentrifugering og utarbeidelse av serum fra hannrotter. A) De blodprøver samlet fra en hannrotte blir delt likt i to reagensrør for sentrifugering. B, C) Ikke-separert prøve (B) og ideelt separasjon inn i den øvre lag inneholdende serum og fibrinkoagel (pilen i C) , og det nedre lag som inneholder blodlegemer etter den første sentrifugering. D) fibrinkoagel er presset ved hjelp av en pinsett. E) serum og blodcellelagene etter den andre sentrifugering. Den fibrinkoagel er observert ved grenseflaten (pilhoder). F) Utfelling av blodlegemer etter den tredje sentrifugering (pil). G) Det venstre røret viser ideelt rotteserum med en lys gulaktig farge. Retten tube viser rotte serum med mild hemolyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reproduserbare resultater i WEC eksperimenter er avhengig av bruken av høy kvalitet IC rotteserum og nøyaktig embryo disseksjon teknikk 3.. Ikke forkorte perioden fastende før samling av blod, fordi faste er nødvendig for å standardisere glukosekonsentrasjonen i blodet. Hunnrotter bør ikke brukes for fremstilling av serum på grunn hormonnivået endres i hunndyr ifølge brunst, og slike endringer i østradiol hormoner er uegnet for embryokulturer. I tillegg bør svært fettstoffer hannrotter ikke benyttes til serum preparatet for å unngå en stor mengde lipid forurensninger i blodet.
Ved innsamling av blod, først sørge for at fargen på den arterielle blod er en lys rød farge, noe som reflekterer normal pusting under narkose. Redusert pusting fører til en reduksjon av mengden av oppsamlet blod. For å komme seg i slike tilfeller, midlertidig redusere hastigheten som sprøyten er pulled. Den mest kritiske problem i serum preparat er hemolyse. Hvis de innsamlede blodprøver oppviser alvorlig hemolyse, mislykkes blod som skal separeres i to lag ved sentrifugering. Fordi mildt hemolysert serum kan støtte sub-optimal utvikling, bør et slikt serum kastes. Som hemolyse en tendens til å bli indusert av tvungen trykket, bør sprøyten trekkes sakte ved henting av blod. Det er viktig å unngå bobling blodet når de innsamlede blodprøver blir hellet i reagensglass, som øker hemolyse.
Til kultur mus embryoer, kan IC serum samles fra hannmus være ideelt; derimot, er dette kravet ikke er praktisk fordi vi ikke kan få et stort nok volum av blod fra en mus. Når vi forbereder rotte serum, forbereder vi minst 10 pensjonerte avl hannrotter. I vårt laboratorium, blir blodsamling rutinemessig utført av minst to enkelt: individet oppsamling av blod og de enkelte bedøvelse og utførerførste sentrifugering.
Hittil har flere studier med kommersiell rotte serum i WEC ved å kombinere kjemisk definert medium blitt rapportert 23-25. Støtter for eksempel en blanding av 50% kommersielt tilgjengelig rotteserum og 50% DMEM den normale vekst av E8.5 mus embryo i 36 timer 23 og den normale vekst av E9.75 mus embryo i 40 timer 24. I en annen protokoll, støtter en blanding sammensatt av 50% rotteserum tilgjengelig fra et annet firma og 50% F12 medium supplert med N-2 også den riktige vekst av E7.5 E8.5 og mus embryo i 24 timer 25. Imidlertid er det fortsatt uklart om disse kombinatoriske medier er egnet for kulturen i rotter og mus embryoer på senere stadier, for eksempel E11.5-E12.5 i mus og E13.5-E14.5 hos rotter. WEC studier med ulike alternative media i stedet for å rotte serum er også rapportert 26-28. For eksempel støtter en kombinasjon av DMEM/F12 og 20% føtalt bovint serum (FBS) utvikling av rotte embryoer fra E11.5 for 28 hr 26. Imidlertid er dette mediet ikke egnet for rotteembryokultur fra E10.5 til 28 hr 26. Derfor tror vi at den normale vekst av embryoer i et medium inneholdende FBS er avhengig av fosterstadiet av embryoene.
WEC ved hjelp av serumfritt vekstmedium som består bare av definerte reagenser, blant kommersielt tilgjengelig embryonale stamceller media, bovint serum-albumin og N-2-supplement er blitt rapportert. Dette medium støtter kulturen av E10.5 museembryoer for 16-40 timers 27, 28. Morre-Scott, et al. Viste at crown-til-rest størrelse på mus embryoer dyrket i 24 timer er betydelig mindre enn den til E11 0,5 embryoer dyrket i utero. Men de viktigste strukturer, slik som somites og ryggnerveknutene, vises normalt i disse dyrkede embryoer. På den annen side rapporterte Kalaskar og Lauderdale at 60% av embryoer som ble testet i dette medium oppviste normal utvikling 18 timer senere, men frekvensen av god utvikling i embryoer dyrket i ytterligere 20 til 22 timer falt til 30-40%. I motsetning til disse studiene, kan vi lykkes reprodusere god utvikling av mus og rotter embryoer dyrket i 100% IC rotte serum produsert ved hjelp av vår protokoll for to dager (dvs.., Ca 48 t) fra E12.5 i rotter 6 eller E10.5 i mus 8 ved å endre medium en gang på 24-timers. Disse resultatene tyder på at vår fremgangsmåte for fremstilling av IC-rat serum er nyttig for en rekke forsøk som gjelder pattedyr WECat embryonale forskjellige stadier. Derfor håper vi at vår video protokollen vil hjelpe nye forskere innføre forsøk med WEC til sine laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. , 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
