Summary
La ghiandola lacrimale (LG) è un organo di ramificazione che produce i componenti acquose di lacrime necessarie per il mantenimento della visione e la salute oculare. Qui si descrive murino LG dissezione ed ex vivo le tecniche di coltura di decifrare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di LG.
Abstract
La ghiandola lacrimale (LG) secerne lacrime acquose necessari a mantenere la struttura e la funzione della cornea, un tessuto trasparente essenziale per la visione. Nell'essere umano un'unica LG risiede nella orbita sopra l'estremità laterale di ciascun occhio fornire lacrime alla superficie oculare attraverso 3 - 5 condotti. Il mouse ha tre paia di ghiandole oculari, il più studiato dei quali è la ghiandola lacrimale exorbital (LG) anterior posizionato e ventrale all'orecchio. Simile ad altri organi ghiandolari, LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione in cui un singolo gemma epiteliale all'interno di un mesenchima condensato sottoposto a vari cicli di gemme e di formazione condotto da formare una rete interconnessa intricata di acini secretori e condotti. Questo processo elaborato è stato ben documentato in molti altri organi epiteliali come il pancreas e ghiandole salivari. Tuttavia, la LG è stata molto meno esplorati e meccanismi che controllano la morfogenesi sono poco sottoc'era. Abbiamo il sospetto che questo sotto-rappresentazione come sistema modello è una conseguenza delle difficoltà connesse con l'individuazione, la dissezione e la coltura della LG. Così, qui descriviamo tecniche di dissezione per la raccolta embrionale e post-natale LG e metodi di coltura ex vivo del tessuto.
Introduction
La ghiandola lacrimale (LG) è responsabile della secrezione lacrimale acquoso critico per l'acuità visiva e la salute, la manutenzione e la protezione delle cellule della superficie oculare. LG risultati disfunzione in uno dei disturbi oculari più comuni e debilitanti: acquosa carente malattia dell'occhio secco, che è caratterizzata da irritazione oculare, sensibilità alla luce e riduzione della visione 1. Nell'essere umano LG risiede nell'orbita sopra dell'estremità laterale dell'occhio dove che 3 - 5 escrezione lacrime deposito condotti sulla superficie oculare. Il mouse ha tre paia di ghiandole oculari, il più studiato dei quali è la ghiandola lacrimale (LG) anterior trova e ventrale per l'orecchio (exorbital) con le lacrime agli occhi che viaggiano attraverso un unico condotto escretore. Simile ad altri organi ghiandolari, LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione in cui un singolo gemma epiteliale all'interno di un mesenchima condensato sottoposto a vari cicli di gemme e la formazione del condotto di perm una rete interconnessa intricata di acini secretoria e condotti (Figura 1) 2. Durante lo sviluppo l'epitelio viene vascolarizzato e fortemente innervato dai nervi parasimpatici del ganglio pterigopalatino e, in misura minore, da nervi simpatici del ganglio cervicale superiore 3. Interazioni tra ciascuno di questi tipi di cellule cioè cellule neuronali, epiteliali, endoteliali e mesenchimali, sono essenziali per la funzione e la manutenzione del tessuto adulto. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di coordinamento sviluppo LG e la rigenerazione e come tipo di comunicazione inter-cellulare guida questi processi rimane poco chiaro.
L'avvento della embrionali ex vivo le tecniche di coltura ha consentito l'individuazione di percorsi di sviluppo e di rigenerazione in più organi di derivazione 4. Coltura ex vivo dà al ricercatore la possibilità di manipolare l'organo (memeccanico, genetica o chimica) in condizioni definite, nonché per caratterizzare le interazioni sviluppo organo e cellula-cellula in tempo reale. La exorbital LG del mouse è altamente suscettibile di questa tecnica e studi recenti hanno definito i sistemi che regolano il suo sviluppo 2,5 segnalazione. Tuttavia, nonostante la necessità di comprendere segnali molecolari alla base dello sviluppo LG e la rigenerazione, attualmente rimane poco studiato, probabilmente a causa delle difficoltà tecniche di isolare l'organo. In questo articolo, si descrive come isolare ed eseguire ex vivo cultura del embrionale murino LG per definire programmi di sviluppo.
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Protocol
Tutto il lavoro degli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della University of California, San Francisco.
1. embrionali di topo lacrimale Ghiandole (LG): Raccolta e Microdissection
- A seguito di procedure approvate dalle Animali istituzionali per comitato della ricerca scientifica etica, eutanasia cronometrato in gravidanza CD-1 (o transgenici) femmine con l'aumento della CO 2 inalazione, seguita da una conferma per dislocazione cervicale di embrioni consecutivi nella appropriata giorno embrionale. Designare il giorno della scoperta vaginale spina e0.
Nota: ghiandole lacrimali (LGS) può essere raccolto dalla fase singola gemma E14 in poi. Tuttavia, E16 (5-10 gemme) embrioni danno i risultati più coerenti per ex vivo della cultura. - Sterilizzare il vlato entral del mouse utilizzando etanolo al 70%. Pizzicare la pelle e fare un'incisione sulla linea mediana con le forbici chirurgiche sterili; tagliare attraverso la pelle e del peritoneo per esporre la cavità addominale. Rimuovere le 2 corna uterine tagliando lungo il mesometrio nella parte superiore di ogni corno uterino e posto in PBS freddo (Phosphate Buffered Saline) o DMEM F12 supporto integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina.
- Utilizzando pinze (# 5), rimuovere gli embrioni dalle cavità amniotiche e mettere in una seconda piastra di Petri sterile contenente PBS freddo. Fare attenzione a non toccare gli occhi o la zona della testa.
- Inserire embrione su un microscopio da dissezione con una base transilluminazione. Se l'embrione è <E17, eseguire i passaggi 1,5-1,7. Se gli embrioni sono> E17, questa procedura può essere utile, ma non sono essenziali, quindi procedere al passaggio 1.8.
- Sever testa dal tronco appena sotto la mandibola inferiore (fase 1, Figura 2) Struga bisturi sterile (# 10 lama). Ruotare testa in modo che la mandibola è ora su piastra dissezione. Utilizzare pinze per stabilizzare la testa e un bisturi per rimuovere circa ¼ del lato dorsale del cervello (fase 2, 1 ° taglio, Figura 2) - questo è particolarmente importante una volta che la cartilagine si irrigidisce intorno e15.
- Orientare la testa in modo che il bisturi può perforare il naso tra gli occhi. Effettuare un taglio attraverso il centro della testa, in modo che gli occhi sono ora a metà separate (step 2, 2 ° taglio, Figura 2).
- Utilizzando due # 5 pinze, prendere una metà della testa e rimuovere il tessuto in eccesso (vedere il punto 3, figura 2). Accertarsi di orientare la testa in modo che il LG (che si trova nell'angolo posteriore inferiore dell'occhio) non si perde in questo processo di rimozione. Rimuovere cerebrale in eccesso, cartilagine e tessuto nasale circostante e sotto l'occhio. Dal momento che la ghiandola è appena visibile, a questo punto, assicurare l'occhio sia correttamente orientata tessuto in eccesso dopo la rimozione to evitare di perdere la posizione del LG.
- Afferrare con cura la pelle dalla parte posteriore, in basso dell'occhio con entrambe le pinze. Togliere la pelle tirando delicatamente aperto con le pinze per esporre la LG. Utilizzare l'illuminazione supplementare sopra e sotto il tessuto per aiutare a visualizzare la LG.
Nota: L'LG, distinguibile dal suo aspetto come gemma su un condotto all'interno di una più scura, mesenchima condensato, deve essere visibile in questo punto. - Cominciare con cura per sezionare la LG e mesenchima associati (vedere lo schema e immagini) dal tessuto circostante usando pinze, facendo attenzione a non afferrare il LG o il suo canale associato. Una volta che la ghiandola è libero dal tessuto circostante, rimuovere delicatamente l'intera ghiandola afferrando la epiteli circonda l'occhio alla base del condotto LG. Fare attenzione a preservare il mesenchima che circonda l'epitelio, che può essere osservata come un mesenchima condensata in cui le invaginates epitelio.
NOTA: Alcuni eliminata anche la tissue (eventuali piccoli frammenti di ossa, muscoli e tessuto connettivo) può essere necessario per evitare la segnalazione fattori / crescita dal tessuto adiacente. - Per la cultura, il raccolto 4 - 5 ghiandole e mesenchima associati per piastra (enti locali sono placcati immediatamente dopo la dissezione); raccogliere un minimo di 14 ghiandole per 100 ml di RNA tampone di lisi per RT-PCR 6.
2. Preparare Piastre per ex vivo Cultura
Questa procedura si basa su quello utilizzato per lo sviluppo delle ghiandole salivari 7,8.
- Aggiungere 200 ml di DMEM F12 (integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina) terreni di coltura con 50 mg / ml di acido ascorbico e 50 mg / ml di olo-transferrina ad un diametro di 50 millimetri piatto micropozzetti con fondo trasparente 7.
Nota: DMEM F12 è stato scelto come abbiamo precedentemente trovato per massimizzare morfogenesi nella ghiandola salivare embrionale. - Float un Polycarb 13 millimetrifiltro a membrana Onate con 0,1 micron pori sulla parte superiore del supporto.
- Passaggio opzionale: Diluire 3-D laminina 1: 1 con DMEM / F12 per effettuare una concentrazione finale di 3 mg / ml (200 ml utilizzare pipetta per mescolare delicatamente; centrifugare per 1 minuto se compaiono bolle). Aggiungere 15 ml di questo diluiti 3-D laminina per filtrare.
Nota: Questa diluizione è risultata ottimale per mantenere LG nel suo stato 3D senza compromettere ramificazione epiteliale. Tuttavia, non è essenziale per la cultura di LG. - Mettere 4-5 LG sul filtro o in laminina. Cultura LGs ex vivo per 24 - 48 ore (Figura 3) o fissare con PFA 4% per 20 min per ulteriori analisi qPCR o immunocolorazione (Figura 4). Per l'analisi qPCR di tessuto ghiandolare embrionale, si prega di fare riferimento al Rebustini et al., 2011. Per l'analisi di immunofluorescenza di tessuti ghiandolari embrionali si rimanda ai seguenti citazioni: Hoffman et al, (2002) e Steinberg e.t al., (2005).
3. mouse postnatale e adulti ghiandole lacrimale (LG): Dissection
- Euthanize il mouse postnatale secondo gli standard del caso della commissione etica animale. Per cuccioli postnatale giorno 8 o più giovani, eutanasia tagliando la testa con le forbici sterili. Per giorno postnatale 8 o più anziani, spruzzare pelliccia con il 70% di etanolo.
- Per individuare il LG, giaceva il mouse laterale all'altro sotto un microscopio da dissezione con illuminazione dall'alto. Nota: L'LG post-natale e adulti sono confina con l'arteria carotide, il muscolo massetere e il derma (vedi Figura 5).
- Utilizzando piccole forbici dissezione, fare piccola incisione nell'epidermide lateralmente da cui deve essere posizionato il LG.
- Utilizzando pinze, aprire l'epidermide verso l'orecchio per esporre la LG.
- Utilizzare pinze per allentare delicatamente LG dal tessuto circostante.
- Una volta che la LG è liberato dal tessuto circostante, rimuovere con attenzione l'LG dal condotto,afferrando dove il condotto e la epiteli circonda l'occhio collegano (Figura 1).
- Mettere enti locali in RNA tampone di lisi per RT-PCR, o fissare con 4% PFA per 20 minuti per immunocolorazione.
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Representative Results
La LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione. Immagini in campo chiaro di enti locali embrionali sezionati a E14, E15, E16, E17, e P2 illustrano questo evento.
Figura 1. L'LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione. Immagini in campo chiaro di enti locali embrionali appena sezionate a E14, E15, E16, E17 e P2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Si noti che come epitelio aumenta di dimensioni, la quantità di mesenchima diminuisce. Le fasi sperimentali per microdissezione degli enti locali embrionali sono descritte nella Figura 2.
Figura 2. Schema di passaggi necessari per LG microdissezione da embrioni di topo. Rappresentazione schematica della dissezione e rimozione del LG dal mouse embrionale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per la cultura LG che abitualmente utilizziamo embrioni E16 a causa della consistenza in ex vivo di crescita. Come mostrato in figura 3, LG in condizioni di coltura ex vivo sviluppano in modo simile alla ghiandola in vivo (confrontare la Figura 1).
Figura 3. Exvivo cultura della E16 enti locali riassume nella morfogenesi vivo. LGs E16 sono stati ottenuti da Pax6-Cre, embrioni GFP, in cui GFP si esprime con l'epitelio. Immagini fluorescenti consecutive sono state prese di questo singolo ghiandola a 0, 3, 6, 12, 24, e 48 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Qui abbiamo utilizzato embrioni Pax6-Cre, GFP (chiamato anche Le Cre-5) per evidenziare le cellule epiteliali, che ci permette di prendere le immagini fluorescenti consecutive dell'epitelio ramificazione nel periodo di coltura di 48 ore. I topi che ospitano il Pax6-Cre, GFP transgene possono essere ottenuti da JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr, ma non sono necessari per la dissezione della ghiandola e la cultura.
Culture o appena sezionato LG può essere fissato per l'analisi di immunofluorescenza. Figura 4 shows la visualizzazione di 4 compartimenti cellulari, mesenchima, epiteliali (EpCAM), nervi (Tubb3) e dei vasi sanguigni (PECAM), in un E16 LG da un ceppo selvatico (CD1) embrione.
Figura 4. L'LG è composto da più tipi di cellule epiteliali, tra cui, neuroni e cellule endoteliali. E16 LG è stato immunoistochimica per le cellule epiteliali (EpCAM, verde), i neuroni (Tubb3, rosso) e le cellule endoteliali (pecam, ciano). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per il tessuto fresco sezionato è più facile incorporare primo LG in laminina, come fatto per la cultura, così da immobilizzare la ghiandola per il fissaggio e la successiva manipolazione. La Figura 5 mostra uno schemaper la dissezione del postnatale / adulto LG.
Figura 5. Schema di passaggi necessari per LG microdissezione dal post-natale e topo adulto. Rappresentazione schematica della dissezione e rimozione del LG sia da post-natale o adulto mouse. Un Pax6-Cre, GFP post-natale giorno 30 del mouse è stato utilizzato per visualizzare la posizione del LG e relativo condotto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La posizione del post-natale / adulti LG è stata visualizzata utilizzando il Pax6-Cre, mouse GFP.
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Discussion
La versatilità alla cultura e manipolare la LG ex vivo fornisce vantaggi significativi per lo studio del suo sviluppo. Ciò comprende la velocità alla quale il ricercatore è in grado di testare ipotesi e la moltitudine di perturbazioni che possono essere eseguite per valutare come epiteliale, neuronali, cellule endoteliali e mesencyhmal interagiscono per formare l'organo. Tuttavia, ci sono una serie di avvertimenti quando si utilizza questo modello. In primo luogo, in virtù del suo isolamento ghiandola non è più collegato al sistema vascolare periferico o del sistema nervoso, che possono influenzare le vie di segnalazione testati se lavorano in combinazione con i segnali forniti dai nervi o vasi sanguigni 9,10. In secondo luogo, i tessuti non-LG circostanti possono fornire fattori che regolano lo sviluppo LG 4. Per evitare questo le altre componenti del tessuto non-mesenchimali devono essere rimossi prima della cultura. In terzo luogo, al momento non siamo in grado di fornire le condizioni necessarie per la completa cytodifferentiation in un tessuto completamente funzionale. Questo è il caso per tutti gli organi coltivate ex vivo ed è probabilmente dovuto a diverse ragioni, tra cui l'assenza di vasi sanguigni e nervi funzionali e / o forze meccaniche dai tessuti circostanti. Nonostante queste riserve, i meccanismi scoperti in ex vivo della cultura hanno dimostrato di essere ricapitolato nei successivi esperimenti in vivo, rendendo questo un solido sistema per testare nuove ipotesi 8,11.
E 'stato dimostrato che i percorsi di sviluppo e rigenerative sovrappongono in modo significativo, indicando che il sistema di coltura ex vivo può anche essere impiegato per studiare la rigenerazione di organi 12. Anche se non abbiamo dimostrato questo aspetto qui, e gli altri, hanno già dimostrato la ghiandola salivare embrionale può essere utilizzato per modellare gli effetti delle radiazioni terapeutiche sul danno d'organo e della rigenerazione 13. Studi futuri sono necessari per esplorare l'uso del sistema ex vivo LG comeun modello per la rigenerazione tissutale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare finanziamenti previsti dal Programma di allocazione delle risorse UCSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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