Manipulere Murine tårekirtlen

Summary

Tårekirtlen (LG) er en forgrening organ, der frembringer de vandige komponenter af tårer nødvendige for at bevare vision og øjensundhedstilstand. Her beskriver vi murine LG dissektion og ex vivo kultur teknikker til at dechifrere signalveje, der er involveret i LG udvikling.

Abstract

Tårekirtlen (LG) udskiller vandige tårer nødvendige for at bevare strukturen og funktionen af ​​hornhinden, en gennemsigtig væv afgørende for syn. I den menneskelige en enkelt LG bor i kredsløb over den laterale ende af hvert øje levere tårer øjenoverfladen gennem 3-5 kanaler. Musen har tre par store okulære kirtler, den mest undersøgte af som er exorbital tårekirtlen (LG) beliggende forreste og ventral til øret. I lighed med andre kirtel organer, LG udvikler gennem processen med epitelial forgrening morfogenese hvor en enkelt epitelial knop i en kondenseret mesenchyme gennemgår flere runder af opløbet og kanal formation for at danne et indviklet sammenhængende net af sekretorisk acini og kanaler. Denne omfattende fremgangsmåde er blevet godt dokumenteret i mange andre epitelorganer såsom bugspytkirtel og spytkirtel. Imidlertid har LG været langt mindre udforskede og de mekanismer, der styrer morphogenese er dårligt understod. Vi formoder, at denne underrepræsentation som en model-system er en konsekvens af de vanskeligheder, der er forbundet med at finde, dissekere og dyrkning af LG. Således her beskriver vi dissektion teknikker til høst embryonale og postnatale LG og metoder til ex vivo dyrkning af vævet.

Introduction

Tårekirtlen (LG) er ansvarlig for vandig tåresekretion kritisk for synsskarphed og sundhed, vedligeholdelse og beskyttelse af cellerne i den okulære overflade. LG dysfunktion resulterer i en af de mest almindelige og svækkende øjensygdomme: vandig mangelfuld Dry Eye Disease, som er karakteriseret ved øjenirritation, lysfølsomhed og nedsat syn ^1. I den menneskelige LG bor i kredsløb over den laterale ende af øjet, hvor 3-5 udskillelsesvej kanaler deposit tårer onto øjenoverfladen. Musen har tre par store okulære kirtler, det mest studerede som er tårekirtlen (LG) beliggende forreste og ventral for øret (exorbital) med tårer rejser til øjet via en enkelt udskillelseskanal. I lighed med andre kirtel organer, LG udvikler gennem processen med epitelial forgrening morfogenese hvor en enkelt epitelial knop i en kondenseret mesenchyme gennemgår flere runder af opløbet og kanal dannelse til form et indviklet forbundne net af sekretorisk acini og kanaler (figur 1) ^2. Under udviklingen epitelet bliver vaskulariseret samt kraftigt innerveret af parasympatiske nerver i pterygopalatine ganglion og i mindre grad af sympatiske nerver fra superior cervikal ganglion ^3. Interaktioner mellem hver af disse celletyper dvs. neuronale, epitelceller, endotelceller og mesenchymale celler, er afgørende for funktion og vedligeholdelse af voksent væv. Men de underliggende molekylære mekanismer samordning LG udvikling og regeneration samt hvordan inter-celletype kommunikation guider disse processer stadig uklar.

Fremkomsten af embryonale ex vivo dyrkningsteknikker har muliggjort identifikation af udviklingsmæssige og regenerative veje i flere branching organer ^4. Dyrkning ex vivo giver forskeren mulighed for at manipulere organet (migniske, genetisk eller kemisk) under definerede betingelser samt at karakterisere udvikling organ og celle-celle-vekselvirkninger i realtid. Den exorbital LG af musen er meget modtagelig for denne teknik og de ​​seneste undersøgelser har defineret signalsystemer, der regulerer dets udvikling ^2,5. Men på trods af behovet for at forstå molekylære signaler understøtter LG udvikling og fornyelse, det i øjeblikket stadig dublerede, sandsynligvis på grund af de tekniske vanskeligheder med at isolere orgel. I dette papir, beskriver vi, hvordan du isolerer og udfører ex vivo kultur embryonale murine LG til at definere udviklingsmæssige programmer.

Protocol

Alt animalsk arbejde blev udført under nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen til pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of California, San Francisco.

1. mus embryonale tåreglandler (LG): Høst og mikrodissektion

1. Følge procedurer er godkendt af den institutionelle dyr til videnskabelige videnskabsetisk komité, aflive timet gravide CD-1 (eller transgene) hundyr med stigende CO ₂ inhalation efterfulgt af bekræftelse ved cervikal dislokation til høst embryoner om en passende embryonale dag. Udpeg den dag vaginalprop opdagelse e0.
   Bemærk: tåreglandler (LGS) kan høstes fra E14 enkelt knopstadiet fremefter. Men E16 (5 - 10 knopper) embryonerne giver de mest konsistente resultater for ex vivo kultur.
2. Sterilisere ventral side af musen ved hjælp af 70% ethanol. Klem huden og lave et snit på midterlinjen med sterile kirurgiske saks; skære gennem huden og peritoneum for at eksponere den abdominale kavitet. Fjern de 2 livmoderhornene ved at skære langs den mesometrium på toppen af ​​hver uterine horn og sted i kold PBS (phosphatpufret saltvand) eller DMEM F12-medium suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
3. Brug pincet (# 5), fjern embryoner fra fosterhinde sække og anbringes i en anden steril petriskål indeholdende kold PBS. Vær omhyggelig med ikke at røre ved øjnene eller hoved område.
4. Placer embryo på et dissektionsmikroskop med en gennemlysning base. Hvis fosteret er <E17 udføre trin 1,5-1,7. Hvis embryoner er> E17, disse trin kan være nyttige, men er ikke afgørende, derfor gå til trin 1.8.
5. Adskille hovedet fra torso lige under undernæb (trin 1, figur 2) Bruga steril skalpel (# 10 klinge). Dreje hovedet, således at underkæben er nu på dissekere plade. Pincet til at stabilisere hoved og en skalpel for at fjerne ca. ¼ af den dorsale side af hjernen (trin 2, 1 ^st snit, figur 2) - dette er især vigtigt, når brusk stivner omkring e15.
6. Orientere hovedet, således at skalpellen kan gennembore næsen mellem øjnene. Lave et snit gennem midten af hovedet, så at øjnene er nu adskilte halvdele (trin 2, 2 ^nd efterfølgende figur 2).
7. Ved anvendelse af to # 5 pincet, tage den ene halvdel af hovedet og fjerne overskydende væv (se trin 3, figur 2). Vær sikker på at orientere hovedet, så LG (placeret i nederste bageste hjørne af øjet) ikke går tabt i denne fjernelse proces. Fjern overskydende cerebral, brusk og nasal væv omkring og under øjet. Da kirtel knapt er synligt på dette tidspunkt, skal du sørge for øjet er korrekt orienteret efter overskydende væv fjernelse to undgå at miste placeringen af ​​LG.
8. Fat forsigtigt huden fra den bageste, nederste hjørne af øjet med begge pincet. Fjern skindet ved forsigtigt at trække åbne med pincet for at blotlægge LG. Anvende yderligere belysning over og under vævet at hjælpe med at visualisere LG.
   Bemærk: LG, adskiller sig ved sit udseende som en knop på en kanal i en mørkere, kondenseret mesenchyme, skal være synlig på dette punkt.
9. Begynder forsigtigt at dissekere LG og tilhørende mesenchyme (se diagram og billeder) fra det omgivende væv med pincet, være omhyggelig med ikke at få fat i LG eller dens tilhørende kanal. Når kirtel er fri fra det omgivende væv, forsigtigt fjerne hele kirtel ved at tage fat i epitel omkring øjet i bunden af ​​LG kanalen. Sørge for at bevare mesenkymet omkring epitel, som kan observeres som en kondenseret mesenkym i hvilke epitel invaginates.
   BEMÆRK: Nogle ekstra fjernelse af tissue (alle små knoglefragmenter, muskler og bindevæv) kan være nødvendige for at undgå signalering / vækstfaktorer fra nabolandet væv.
10. For kultur, høst 4 - 5 kirtler og tilhørende mesenchyme pr plade (LGS er belagt umiddelbart efter dissektion); indsamle mindst 14 kirtler per 100 pi RNA lysis buffer til RT-PCR ^6.

2. Forbered Plader til Ex vivo Kultur

Denne procedure er baseret på den, der anvendes til udvikling af spytkirtel ^7,8.

1. Tilsæt 200 pi DMEM F12 (suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) dyrkningsmedier med 50 ug / ml ascorbinsyre og 50 ug / ml holo-transferrin til glasbund 50 mm diameter mikrobrønd skål ^7.
   Bemærk: DMEM F12 blev valgt som vi tidligere fandt det for at maksimere morfogenese i embryonale spytkirtel.
2. Float en 13 mm Polycarbfilter onat membran med 0,1 um porer på toppen af ​​medierne.
3. Valgfri Trin: Fortynd 3-D laminin 1: 1 med DMEM / F12 til at foretage en endelig koncentration på 3 mg / ml (brug 200 pi pipette til forsigtigt at blande, centrifuge i 1 min, hvis bobler vises). Der tilsættes 15 pi af denne fortyndede 3-D laminin at filtrere.
   Bemærk: Denne fortynding blev fundet at være optimal for at opretholde LG i 3D tilstand uden at kompromittere epithelial forgrening. Det er dog ikke afgørende for kulturen i LG.
4. Placer 4. - 5. LG på filter eller i laminin. Kultur kommuner ex vivo til 24-48 timer (figur 3) eller fastgøres med 4% PFA for 20 min til yderligere analyse af qPCR eller immunfarvning (figur 4). For qPCR analyse af embryonale kirtelvæv, henvises til Rebustini et al., 2011. For immunofluorescent analyse af embryonale kirtel væv henvises til følgende referencer: Hoffman et al (2002) og Steinberg e.t al., (2005).

3. Mouse Fødselsdepression og Adult tåreglandler (LG): Dissektion

1. Aflive den postnatale mus ifølge passende dyreetik udvalgets standarder. For postnatale unger dag 8 eller yngre, aflive ved at bryde hovedet med steril saks. For postnatal dag 8 eller ældre, spray pels med 70% ethanol.
2. For at finde LG, lå mus lateral side op under et dissektionsmikroskop med belysning fra oven. Bemærk: Den postnatale og voksen LG er omkranset af halspulsåren tyggemusklen og dermis (se figur 5).
3. Ved hjælp af små dissektion saks, lave små snit i overhuden sideværts fra hvor LG skal placeres.
4. Brug pincet, træk åbne epidermis mod øret for at eksponere LG.
5. Brug pincet til forsigtigt at løsne LG fra omgivende væv.
6. Når LG frigøres fra omgivende væv, forsigtigt fjerne LG ved kanalen,ved at gribe hvor kanalen og epitel omkring øjet forbinde (figur 1).
7. Placer LGs i RNA lysisbuffer for RT-PCR, eller fastsætte med 4% PFA i 20 min for immunfarvning.

Representative Results

Den LG udvikler gennem processen med epitelial forgrening morfogenese. Brightfield billeder af embryonale kommuner dissekeret på E14, E15, E16, E17, og P2 illustrerer denne begivenhed.

Figur 1. Den LG udvikler gennem processen med epitelial forgrening morfogenese. Brightfield billeder af embryonale kommuner frisk dissekeret på E14, E15, E16, E17 og P2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Bemærk, at epitelet stigninger i størrelse, mængden af ​​mesenkym falder. De eksperimentelle trin til mikrodissektion af embryonale kommuner er afbildet i figur 2.

Figur 2. Skematisk af trin involveret i LG mikrodissektion fra museembryoer. Skematisk diagram af dissektion og fjernelse af LG fra den embryonale mus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

For LG kultur, vi rutinemæssigt anvender E16 embryoer på grund af sammenhæng i ex vivo vækst. Som vist i figur 3, LG i ex vivo dyrkningsbetingelser udvikle en måde svarende til in vivo-kirtel (sammenlign figur 1).

Figur 3. Exvivo kultur af e16 kommuner rekapitulerer in vivo morfogenese. E16 kommuner blev afledt fra Pax6-Cre, GFP embryoner, hvor GFP udtrykkes af epitel. Konsekutive fluorescerende billeder blev taget af denne enkelt kirtel på 0, 3, 6, 12, 24 og 48 timer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Her beskæftigede vi Pax6-Cre, GFP (også kaldet Le-Cre ⁵⁾ embryoner fremhæve epitelceller, tillader os at tage efterfølgende fluorescerende billeder af forgrening epitel over 48 timers kultur periode. Mus huser Pax6--Cre, GFP transgen kan fås fra JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr men er ikke nødvendige for kirtel dissektion og kultur.

Kulturer eller frisk dissekeret LG kan derefter fastsættes for immunofluorescent analyse. Figur 4 shows visualisering af 4 cellulære rum, mesenchyme, slimhinder (EpCAM), nerver (Tubb3) og blodkar (PECAM) i en E16 LG fra en vildtype (cd1) foster.

Figur 4. LG består af flere celletyper, herunder epitel, neuronal og endotelceller. E16 LG blev immunofarvet for epithelceller (EpCAM, grøn), neuroner (Tubb3, rød) og endotelceller (PECAM, cyan). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

For frisk dissekeret væv er det lettere at først indlejre LG i laminin, som gjorde for kulturen, således at immobilisere kirtel for fiksering og efterfølgende håndtering. Figur 5 viser en skematiskfor dissektion af postnatal / voksen LG.

Figur 5. Skematisk af trin involveret i LG mikrodissektion fra post-natal og voksen mus. Skematisk diagram af dissektion og fjernelse af LG fra enten post-natal eller voksen mus. En Pax6-Cre, GFP post-natal dag 30 mus blev anvendt til at visualisere placeringen af LG og tilhørende kanal. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Positionen af ​​den postnatale / voksen LG er visualiseret ved hjælp af Pax6-Cre, GFP mus.

Discussion

Alsidigheden til kultur og manipulere LG ex vivo giver betydelige fordele for at studere dens udvikling. Dette omfatter den hastighed, hvor forskeren er i stand til at teste hypoteser og de mange perturbationer, som kan udføres for at vurdere, hvor epitel, neuronal, endotel- og mesencyhmal celler interagerer til dannelse af organet. Der er imidlertid en række forbehold, når man bruger denne model. Først, i kraft af sin isolation kirtel er ikke længere forbundet med den perifere kar eller nervesystemet, hvilket kan påvirke de signalveje, der testes, hvis de arbejder sammen med signaler, der leveres af nerver eller blodkar ^9,10. For det andet kan de omgivende ikke-LG væv tilvejebringe faktorer, der regulerer LG udvikling ^4. At undgå denne andre ikke-mesenkymvæv komponenter skal fjernes før kulturen. For det tredje, vi på nuværende tidspunkt ikke er i stand til at levere de nødvendige betingelser for fuldstændig cytodifferentiation i en fuldt funktionel væv. Dette er tilfældet for alle organer dyrket ex vivo og skyldes sandsynligvis flere årsager, herunder fraværet af funktionelle blodkar og nerver og / eller mekaniske kræfter fra omgivende væv. Trods disse forbehold har mekanismer opdaget i ex vivo kultur vist at blive gentaget i efterfølgende in vivo forsøg, hvilket gør dette til et robust system for afprøvning af nye hypoteser ^8,11.

Det er blevet vist, at i væsentlig grad overlapper udviklingsmæssige og regenerative veje, hvilket indikerer, at ex vivo kultur systemet kan også anvendes til at studere organregenerering ^12. Selvom vi ikke har påvist dette aspekt her vi, og andre, som tidligere har vist embryonale spytkirtel kan bruges til at modellere effekten af terapeutisk stråling på organskade og regeneration ^13. Fremtidige studier er nødvendige for at undersøge brugen af LG ex vivo systemen model for vævsregenerering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x			Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.