Summary
La glande lacrymale (LG) est un organe de branchement qui produit les composants aqueux de larmes nécessaires pour le maintien de la vision et la santé oculaire. Nous décrivons ici murin LG dissection et ex vivo des techniques de culture de déchiffrer les voies impliquées dans le développement LG signalisation.
Abstract
La glande lacrymale (LG) sécrète des larmes aqueuses nécessaires pour maintenir la structure et la fonction de la cornée, un tissu transparent essentielle pour la vision. Chez l'être humain d'une seule LG réside dans l'orbite au-dessus de l'extrémité latérale de chaque oeil délivrer larmes à la surface oculaire par l'intermédiaire de 3 à 5 canaux. La souris possède trois paires de glandes majeures oculaires, le plus étudié de qui est la glande lacrymale exorbital (LG) situé antérieure et ventrale à l'oreille. Semblable à d'autres organes glandulaires, le LG développe à travers le processus de morphogenèse épithéliale ramification dans laquelle un seul bourgeon épithélial dans un mésenchyme condensé subit de multiples tours de bourgeon et la formation de conduite pour former un réseau interconnecté complexe de acini et canaux de sécrétion. Ce processus complexe a été bien documentée dans de nombreux autres organes épithéliaux tels que le pancréas et les glandes salivaires. Toutefois, le LG a été beaucoup moins explorée et les mécanismes de contrôle de la morphogenèse sont mal sousrésisté. Nous pensons que cette sous-représentation comme un système de modèle est une conséquence des difficultés liées à la recherche, la dissection et la culture de la LG. Ainsi, ici, nous décrivons les techniques de dissection pour la récolte embryonnaire et post-natal LG et les méthodes de culture ex vivo des tissus.
Introduction
La glande lacrymale (LG) est responsable de la sécrétion aqueuse déchirure critique pour l'acuité visuelle et de la santé, la maintenance et la protection des cellules de la surface oculaire. Résultats de la dysfonction LG dans l'un des troubles oculaires les plus fréquentes et invalidantes: Eye Disease aqueuse déficient à sec, qui se caractérise par une irritation oculaire, sensibilité à la lumière et diminution de la vision 1. Chez l'homme le LG réside dans l'orbite au-dessus de l'extrémité latérale de l'œil, où 3-5 excréteurs larmes de dépôt de conduits sur la surface oculaire. La souris possède trois paires de glandes majeures oculaires, le plus étudié de qui est la glande lacrymale (LG) situé antérieure et ventrale de l'oreille (exorbital) avec des larmes qui voyagent à l'œil par un seul canal excréteur. Semblable à d'autres organes glandulaires, le LG développe à travers le processus de morphogenèse épithéliale ramification dans laquelle un seul bourgeon épithélial dans un mésenchyme condensé subit de multiples tours de bourgeon et la formation de conduit à desm un réseau interconnecté complexe d'acini et canaux de sécrétion (Figure 1) 2. Au cours du développement de l'épithélium se vascularise ainsi que fortement innervée par les nerfs parasympathique du ganglion ptérygo et dans une moindre mesure par les nerfs sympathiques du ganglion cervical supérieur 3. Les interactions entre les cellules de chacun de ces types à-dire les cellules neuronales, cellules épithéliales, endothéliales et mésenchymateuses, sont essentiels pour la fonction et la maintenance du tissu adulte. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents de coordination du développement et de la régénération LG ainsi que la façon de type inter-cellule communication guide ces processus reste incertaine.
L'avènement de la embryonnaires ex vivo des techniques de culture a permis l'identification de voies de développement et de régénération dans plusieurs organes de branchement 4. La mise en culture ex vivo permet au chercheur la possibilité de manipuler l'organe (moiméca-, génétique ou chimique) dans des conditions définies, ainsi que pour la caractérisation des interactions de développement d'organes et cellule-cellule en temps réel. Le LG exorbital de la souris est prête très bien à cette technique et des études récentes ont défini les systèmes qui régissent son développement 2,5 signalisation. Cependant, en dépit de la nécessité de comprendre les signaux moléculaires qui sous-tendent le développement et la régénération LG, il reste actuellement étudié, probablement en raison des difficultés techniques pour isoler l'organe. Dans cet article, nous décrivons comment isoler et effectuer culture ex vivo de l'embryon murin LG pour définir des programmes de développement.
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Protocol
Tous les travaux des animaux a été effectuée sous stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Californie, San Francisco.
1. souris embryonnaires glandes lacrymales (LG): récolte et microdissection
- Conformément aux procédures approuvées par les animaux institutionnels pour comité éthique de la recherche scientifique, euthanasier chronométré enceintes CD-1 (ou transgéniques) femelles avec la hausse inhalation de CO 2, suivie d'une confirmation par dislocation cervicale aux embryons de récolte le jour embryonnaire approprié. Désigner le jour de prise vaginale découverte e0.
Note: les glandes lacrymales (LGS) peut être récolté à partir de la E14 en une seule étape de bourgeon partir. Cependant, e16 (5 - 10 bourgeons) des embryons donnent les résultats les plus cohérents pour culture ex vivo. - Stériliser la ventral côté de la souris en utilisant 70% d'éthanol. Pincer la peau et faire une incision sur la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux stériles; couper à travers la peau et du péritoine pour exposer la cavité abdominale. Retirer les deux cornes utérines en coupant le long de la mésomètre au sommet de chaque corne utérine et dans du PBS froid (Phosphate Buffered Saline) ou du milieu DMEM F12 supplémenté avec 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
- En utilisant des pinces (n ° 5), supprimer les embryons des sacs amniotiques et placer dans un deuxième boîte de Pétri stérile contenant du PBS froid. Attention à ne pas toucher les yeux ou la zone de la tête.
- Passer embryon sur un microscope à dissection avec une base de transillumination. Si l'embryon est <e17, effectuez les étapes 1.5 à 1.7. Si les embryons sont> e17, ces étapes peuvent être utiles mais ne sont pas indispensables, donc passez à l'étape 1.8.
- De trancher la tête du torse juste en dessous de la mandibule inférieure (étape 1, figure 2) usinga scalpel stérile (lame # 10). Tournez la tête de sorte que la mandibule est maintenant sur la plaque de dissection. Utilisez une pince à stabiliser la tête et un scalpel pour enlever environ ¼ de la face dorsale du cerveau (étape 2, 1 er coupe, Figure 2) - ce qui est particulièrement important une fois que le cartilage se raidit autour e15.
- Orientez la tête pour que le scalpel peut percer le nez entre les yeux. Faire une coupe à travers le centre de la tête, de sorte que les yeux sont maintenant sur moitiés séparées (étape 2, 2 e coupe, Figure 2).
- L'utilisation de deux # 5 forceps, prendre la moitié de la tête et enlever l'excès de tissu (voir l'étape 3, Figure 2). Veillez à orienter la tête de sorte que le LG (situé dans le coin inférieur arrière de l'œil) ne soit pas perdu dans ce processus de retrait. Enlever l'excès cérébrale, le cartilage et le tissu environnant nasale et sous l'œil. Depuis la glande est à peine visible à ce stade, d'assurer l'oeil est bien orienté après l'excès de tissu retrait to éviter de perdre l'emplacement de la LG.
- Prendre soin de la peau de la partie postérieure, coin inférieur de l'oeil avec deux pinces. Retirer la peau en tirant avec précaution ouvert avec la pince pour exposer le LG. Utilisez un éclairage supplémentaire au-dessus et en dessous du tissu pour aider à visualiser le LG.
Remarque: Le LG, distingue par son aspect comme un bourgeon sur un conduit dans un mésenchyme condensé sombre, doit être visible à ce stade. - Soigneusement commencent à disséquer le LG et le mésenchyme associé (voir illustration et images) à l'écart du tissu environnant en utilisant une pince, en faisant attention de ne pas attraper le LG ou sa conduite associée. Une fois que la glande est libre du tissu environnant, retirez délicatement la totalité de la glande en saisissant l'épithélium entourant l'œil à la base du conduit LG. Prenez soin de préserver le mésenchyme entourant l'épithélium, qui peut être observé comme un mésenchyme condensé dans lequel les invagine de l'épithélium.
NOTE: Certains élimination supplémentaire de tissue (des petits fragments d'os, des muscles et du tissu conjonctif) peuvent être nécessaires pour éviter les facteurs / croissance signalisation de tissus voisins. - Pour la culture, la récolte 4 - 5 glandes et mésenchyme associé par plaque (GL sont déposées immédiatement sur dissection); recueillir un minimum de 14 glandes par 100 pi de tampon de lyse ARN pour RT-PCR 6.
2. Préparer les boîtes pour culture ex vivo
Cette procédure est basée sur celle utilisée pour le développement des glandes salivaires 7,8.
- Ajouter 200 ul de milieu DMEM F12 (supplémenté avec 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine), des milieux de culture avec 50 ug / ml d'acide ascorbique et de 50 pg / ml de holo-transferrine à une 50 mm plat à fond de verre de diamètre de microtitration 7.
Remarque: DMEM F12 a été choisi comme nous l'avons déjà constaté à maximiser la morphogenèse de la glande salivaire embryonnaire. - Flotter un 13 mm polycarbfiltre à membrane Onate avec 0,1 um pores sur le dessus de médias.
- Étape facultative: Diluer 3-D laminine 1: 1 avec du DMEM / F12 pour obtenir une concentration finale de 3 mg / ml (utiliser 200 pi pipette pour mélanger doucement; centrifugeuse pendant 1 min si des bulles apparaissent). Ajouter 15 ul de cette dilution 3-D laminine à filtrer.
Remarque: Cette dilution a été trouvée comme étant optimale pour le maintien à l'état LG 3D sans compromettre la ramification épithéliale. Cependant, il est pas indispensable pour la culture de LG. - Placez 4 - 5 LG sur filtre ou dans la laminine. Culture GL ex vivo pour 24 - 48 h (figure 3) ou fixer avec 4% de PFA pendant 20 minutes pour une analyse plus approfondie par qPCR ou immunomarquage (Figure 4). Pour l'analyse qPCR de tissu glandulaire embryonnaire, se il vous plaît se référer à Rebustini et al., 2011. Pour l'analyse d'immunofluorescence de tissus glandulaires embryonnaires se il vous plaît se référer aux citations suivantes: Hoffman et al, (2002) et Steinberg e.t al., (2005).
3. Souris postnatale et adultes glandes lacrymales (LG): Dissection
- Euthanasier la souris postnatale selon les normes de l'éthique animale appropriée comité. Pour les petits postnatales jour 8 ou plus jeunes, euthanasier en coupant la tête avec des ciseaux stériles. Pour le jour postnatal 8 ou plus, pulvériser fourrure avec 70% d'éthanol.
- Pour localiser le LG, gisait souris latérale du côté sous un microscope à dissection avec un éclairage par le dessus. Remarque: Le LG post-natal et adulte sont bordés par l'artère carotide, le muscle masséter et le derme (voir Figure 5).
- L'utilisation de petits ciseaux de dissection, faire petite incision dans l'épiderme latéralement d'où doit être situé le LG.
- En utilisant des pinces, ouvrez le épiderme vers l'oreille pour exposer la LG.
- Utilisez une pince pour desserrer doucement LG du tissu environnant.
- Une fois que le LG est libéré du tissu environnant, retirez délicatement le LG par le conduit,par pincement où le conduit et l'épithélium entourant l'oeil connecter (figure 1).
- Placez GL dans l'ARN tampon de lyse pour la RT-PCR, ou fixer avec 4% de PFA pendant 20 min pour immunomarquage.
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Representative Results
Le LG développe à travers le processus de morphogenèse épithéliale ramification. Images en fond clair de GL embryonnaires disséquées e14, e15, e16, e17, et P2 illustrent cet événement.
Figure 1. Le LG développe à travers le processus de morphogenèse de ramification épithéliale. Images fond clair de GL embryonnaires fraîchement disséqués à e14, e15, e16, e17 et P2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
A noter que comme l'épithélium augmentation de la taille, de la quantité de mésenchyme diminue. Les étapes expérimentales pour microdissection des CL embryonnaires sont représentés sur la Figure 2.
Figure 2. Schéma d'étapes impliquées dans LG microdissection à partir d'embryons de souris. Diagramme schématique de la dissection et l'enlèvement de la LG de la souris embryonnaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Nous utilisons pour la culture LG régulièrement embryons E16 en raison de la cohérence dans l'ex vivo la croissance. Comme le montre la Figure 3, LG ex vivo dans des conditions de culture se développent d'une manière similaire à la glande in vivo (comparer à la figure 1).
Figure 3. Exculture in vivo de e16 GL récapitule dans la morphogenèse vivo. GL E16 ont été tirées de Pax6-Cre, les embryons de la GFP, où GFP est exprimée par l'épithélium. Images fluorescentes consécutifs ont été prises de cette seule glande à 0, 3, 6, 12, 24, et 48 h. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ici nous avons utilisé des embryons Pax6-Cre, la GFP (aussi appelé Le Cre-5) pour mettre en évidence les cellules épithéliales, ce qui nous permet de prendre des images fluorescentes consécutives de l'épithélium de branchement sur la période de culture de 48 h. Souris hébergeant le Pax6-Cre, GFP transgène peuvent être obtenus à partir de JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr mais ne sont pas nécessaires pour la glande dissection et la culture.
Cultures ou fraîchement disséqués LG peut alors être fixée pour l'analyse d'immunofluorescence. Figure 4 sComment va la visualisation de 4 compartiments cellulaires, mésenchyme, l'épithélium (EpCAM), des nerfs (Tubb3) et les vaisseaux sanguins (PECAM), dans un LG E16 à partir d'un type sauvage (CD1) embryon.
Figure 4. Le LG est composé de plusieurs types de cellules, y compris épithéliales, cellules neuronales et endothéliales. E16 LG a été immunocolorée pour les cellules épithéliales (de EpCam, vert), les neurones (Tubb3, rouge) et les cellules endothéliales (PECAM, cyan). Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour les tissus fraîchement découpé, il est plus facile d'incorporer le premier LG dans la laminine, comme cela se fait pour la culture, de manière à immobiliser la glande de fixation et la manipulation ultérieure. La figure 5 représente une vue schématiquepour la dissection de la postnatal / adulte LG.
Figure 5. Schéma des étapes de LG microdissection de souris post-natal et adulte. Schéma de la dissection et l'enlèvement de la LG de la souris soit post-natal ou adulte. Un Pax6-Cre, GFP post-natal jour 30 souris a été utilisé pour visualiser la position de la LG et conduit associé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La position de la post-natal / adulte LG a été visualisée en utilisant le Pax6-Cre, GFP souris.
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Discussion
La polyvalence de la culture et de manipuler le LG ex vivo apporte des avantages significatifs pour l'étude de son développement. Cela inclut la vitesse à laquelle le chercheur est en mesure de tester les hypothèses et la multitude de perturbations qui peuvent être effectuées pour évaluer comment épithéliale, neuronale, les cellules endothéliales et mesencyhmal interagissent pour former l'organe. Cependant, il ya un certain nombre de réserves lors de l'utilisation de ce modèle. Tout d'abord, en raison de son isolement la glande est plus connecté au système vasculaire périphérique ou du système nerveux, qui peuvent affecter les voies de signalisation à l'essai si elles travaillent en collaboration avec les signaux délivrés par les nerfs ou les vaisseaux sanguins 9,10. Deuxièmement, les tissus non-LG environnantes peuvent fournir des facteurs qui régulent LG développement 4. Pour éviter cela d'autres composants de tissu non-mésenchymateuses doivent être retirés avant la culture. Troisièmement, à l'heure actuelle nous ne sommes pas en mesure de fournir les conditions nécessaires pour cytodifferent completiation dans un tissu entièrement fonctionnel. Tel est le cas pour tous les organes en culture ex vivo et est probablement due à de multiples raisons, notamment l'absence de vaisseaux sanguins fonctionnels et des nerfs et / ou de forces mécaniques à partir des tissus environnants. Malgré ces réserves, les mécanismes découverts en culture ex vivo ont montré à être récapitulé dans la suite des expériences in vivo, ce qui en fait un système robuste pour tester de nouvelles hypothèses 8,11.
Il a été démontré que les voies de développement et de régénération se chevauchent de manière significative, ce qui indique que le système de culture ex vivo peuvent également être utilisés pour étudier la régénération des organes 12. Bien que nous ayons pas démontré cet aspect ici, nous, et d'autres, avons précédemment montré la glande salivaire embryonnaire peut être utilisé pour modéliser les effets de la radiothérapie sur les dommages d'organes et régénération 13. Les études futures sont nécessaires pour explorer l'utilisation de l'ex vivo système LG commeun modèle pour la régénération tissulaire.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le financement fourni par le programme d'allocation de ressources UCSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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