Summary
Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt.
Abstract
Die Tränendrüse (LG) sezerniert wäßrigen Tränen zur Aufrechterhaltung von Struktur und Funktion der Hornhaut, ein transparentes Gewebe wichtig für das Sehvermögen erforderlich. Im menschlichen einen einzigen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende eines jeden Auges liefern Tränen auf die Augenoberfläche über 3 - 5 Werkkanäle. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die exorbital Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen an das Ohr. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung, um eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Kanäle bilden. Diese aufwendigen Verfahren wurde auch in vielen anderen epithelialen Organen wie der Bauchspeicheldrüse und der Speicheldrüse dokumentiert. Allerdings hat das LG viel weniger erforscht und die Mechanismen, die Morphogenese sind schlecht unterstand. Wir vermuten, dass diese Unterrepräsentanz als Modellsystem ist eine Folge der Schwierigkeiten bei der Suche, Präparieren und Kultivieren der LG verbunden. So beschreiben wir Dissektion Techniken für die Ernte embryonalen und postnatalen LG und Methoden für die ex vivo Kultur des Gewebes.
Introduction
Die Tränendrüse (LG) ist für wässrige Tränensekretion kritisch für die Sehschärfe und die Gesundheit, Pflege und zum Schutz der Zellen der Augenoberfläche verantwortlich. LG Dysfunktion führt zu einer der häufigsten und schwächenden Augenerkrankungen: wässrige mangel Trockenen Auges, die durch Augenreizung, Lichtempfindlichkeit auszeichnet und verminderte Sicht ein. Im menschlichen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende des Auges in dem 3 - 5 Werkausführungsgänge Ablagerung Tränen auf der Augenoberfläche. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen zum Ohr (exorbital) mit Tränen über einen einzigen Ausführungsgang Reisen in das Auge. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung fürm eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Leitungen (1) 2. Während der Entwicklung des Epithels vaskularisiert sowie stark von den parasympathischen Nerven des Ganglion pterygopalatinum und in geringerem Maße von der überlegenen zervikalen Ganglion 3 innerviert durch sympathische Nerven. Wechselwirkungen zwischen jedem dieser Zelltypen, dh neuronale, Epithelzellen, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen, sind für die Funktion und Wartung der adulten Geweben. Allerdings bleibt die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen koordiniere LG Entwicklung und Regeneration und wie Inter-Zellen-Typ-Kommunikation führt diese Prozesse unklar.
Das Aufkommen von embryonalen ex vivo Kulturtechniken hat die Identifizierung von Entwicklungs- und Regenerationswege in mehreren verzweigenden Organe 4 erlaubt. Züchten ex vivo gibt dem Forscher die Möglichkeit, die Orgel mich zu manipulieren (mechanisch, genetische oder chemische) unter definierten Bedingungen sowie die Organentwicklung und Zell-Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit zu charakterisieren. Die exorbital LG der Maus ist sehr gut für diese Technik und neuere Studien haben festgelegt, Signalsysteme, die ihre Entwicklung 2,5 regulieren. Doch trotz der Notwendigkeit, Signalstoffe zugrunde LG Entwicklung und Regeneration zu verstehen, momentan bleibt wenig erforschten, wahrscheinlich aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung des Organs. In diesem Beitrag beschreiben wir, wie zu isolieren und zu führen ex vivo Kultur von embryonalen Maus-LG zu Entwicklungsprogramme definieren.
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Protocol
Alle Tier Arbeit wurde unter strenger Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of California, San Francisco genehmigt.
1. embryonalen Maus-Tränendrüsen (LG): Ernten und Mikrodissektion
- Folgenden Verfahren durch die Institutional Tiere für wissenschaftliche Forschung Ethik-Kommission genehmigt, einschläfern timed schwanger CD-1 (oder transgene) Weibchen mit steigenden CO 2 Inhalation, gefolgt von der Bestätigung durch Genickbruch zu ernten Embryonen auf den entsprechenden embryonalen Tag. Bestimmen Sie den Tag der Vaginalpfropf Entdeckung e0.
Hinweis: Tränendrüsen (LGs) aus dem e14 einzelnen Knospenstadium ab geerntet werden. Allerdings e16 - geben (5 10 Knospen) Embryonen die konsequentesten Ergebnisse für die ex vivo Kultur. - Sterilisieren Sie die ventral Seite der Maus unter Verwendung von 70% Ethanol. Pinch die Haut und machen einen Einschnitt an der Mittellinie mit sterilen chirurgischen Schere; schneiden durch die Haut und Bauchfell, die Bauchhöhle aus. Die 2 Uterushörner durch Schneiden entlang der Mesometrium an der Oberseite jedes Uterushorn und in kaltem PBS (Phosphate Buffered Saline) oder DMEM F12-Medium mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt.
- Mit einer Pinzette (# 5), zu entfernen Embryonen aus den Fruchtblasen und in einen zweiten sterilen Petrischale mit kaltem PBS. Seien Sie vorsichtig, um die Augen oder Kopfbereich nicht berühren.
- Zeigen Embryo auf einem Binokular mit einer Durchleuchtung Basis. Wenn der Embryo <e17, führen Sie die Schritte 1,5-1,7. Wenn Embryonen> e17, diese Schritte können hilfreich sein, sind aber nicht unbedingt erforderlich, daher gehen Sie zu Schritt 1.8.
- Sever den Kopf vom Rumpf knapp unter dem Unterkiefer (Schritt 1, Abbildung 2) Usinga sterilen Skalpell (# 10 Klinge). Drehen Sie den Kopf, so dass der Unterkiefer ist jetzt auf dem Seziertisch Platte. Verwenden einer Pinzette, um den Kopf und ein Skalpell, um etwa ¼ der dorsalen Seite des Gehirns (Schritt 2, 1. Schnitt, Abbildung 2) zu entfernen stabilisieren - dies ist besonders wichtig, wenn Knorpel versteift rund e15.
- Richten Sie den Kopf, so dass das Skalpell kann die Nase zwischen den Augen durchbohren. Machen Sie einen Schnitt durch die Mitte des Kopfes, so dass die Augen sind jetzt auf getrennten Hälften (Schritt 2, 2. Schnitt, Abbildung 2).
- Mit Hilfe von zwei # 5 Zangen, nehmen Sie eine Hälfte des Kopfes und entfernen überschüssiges Gewebe (siehe Schritt 3, Abbildung 2). Achten Sie darauf, den Kopf so zu orientieren, das LG (in der unteren hinteren Ecke des Auges befindet) wird in diesem Entfernungsprozess verloren. Entfernen überschüssigen zerebralen, Knorpel und Nasengewebe umgibt und unter dem Auge. Da die Verschraubung an dieser Stelle kaum sichtbar, sicherzustellen, ist das Auge nach dem überschüssigen Gewebeentfernung t richtig orientierto nicht zu verlieren die Lage des LG.
- Vorsichtig greifen die Haut von der hinteren, unteren Ecke des Auges mit beiden Zangen. Entfernen Sie die Haut vorsichtig abziehen offen mit der Pinzette, um die LG aussetzen. Verwenden Sie zusätzliche Beleuchtung oberhalb und unterhalb des Gewebes zu helfen visualisieren die LG.
Hinweis: Das LG, unterscheidbar durch sein Aussehen als Knospe auf einem Kanal in einen dunkleren, Kondensmilch Mesenchym, sichtbar an dieser Stelle. - Vorsichtig beginnen zu LG und zugehörige Mesenchym (siehe Diagramm und Bilder) aus dem umgebenden Gewebe mit einer Pinzette, wobei Sie darauf achten das LG oder den angeschlossenen Kanal nicht zu greifen sezieren. Sobald die Drüse ist frei von dem umgebenden Gewebe, entfernen Sie vorsichtig die gesamte Drüse durch Ergreifen des Epithelien um die Augen an der Basis des LG Kanal. Achten Sie auf die umgebende Mesenchym das Epithel, das als kondensiertes Mesenchym in welche die Epithel stülpt beobachtet werden kann erhalten.
HINWEIS: Einige zusätzliche Entfernung von tissue (jedoch kleine Knochenfragmente, Muskeln und Bindegewebe) kann notwendig sein, um zu vermeiden, Signalisierung / Wachstumsfaktoren aus dem benachbarten Gewebe. - Für Kultur, Ernte 4-5 Drüsen und die damit verbundenen Mesenchym pro Platte (LGs sind sofort nach Dissektion plattiert); Sammeln mindestens 14 Drüsen pro 100 & mgr; l RNA-Lysepuffer für RT-PCR 6.
2. Bereiten Teller für Ex-vivo-Kultur
Dieses Verfahren wird auf die für die Entwicklung von Speicheldrüsen 7,8, bezogen.
- Mit 200 & mgr; l DMEM F12 Kulturmedium mit 50 & mgr; g / ml Ascorbinsäure und 50 & mgr; g / ml holo-Transferrin mit einem Glasboden-Mikrotiterplatten mit 50 mm Durchmesser Teller 7 (mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin).
Hinweis: DMEM F12 wurde gewählt, da wir zuvor fand es Morphogenese in der embryonalen Speicheldrüse zu maximieren. - Float eine 13 mm PolycarbOnate Membranfilter mit 0,1 um Poren auf der Oberseite der Medien.
- Optionaler Schritt: Verdünnen 3-D Laminin 1: 1 mit DMEM / F12, um eine Endkonzentration von 3 mg / ml zu (verwenden Sie 200 ul Pipette vorsichtig mischen; Zentrifuge für 1 min, wenn Blasenbildung). Werden 15 & mgr; l dieser verdünnten 3-D Laminin zu filtern.
Hinweis: Diese Verdünnung wurde als optimal für die Aufrechterhaltung der LG in seiner 3D-Zustand ohne Kompromisse epithelialen Verzweigung zu sein. Es ist jedoch nicht wesentlich für die Kultur von LG. - Zeigen 4-5 LG auf Filter oder in Laminin. Kultur LGs ex vivo für 24 - 48 h (Figur 3) oder fix mit 4% PFA für 20 min für eine weitere Analyse durch qPCR oder Immunfärbung (Abbildung 4). Für qPCR Analyse der embryonalen Drüsengewebe entnehmen Sie bitte Rebustini et al beziehen. 2011. Für Immunfluoreszenz-Analyse der embryonalen Drüsengewebe entnehmen Sie bitte den folgenden Zitaten: Hoffman et al, (2002) und Steinberg e.t al., (2005).
3. Maus Postnatale und Erwachsenentränendrüsen (LG): Dissection
- Euthanize der postnatalen Maus nach Normen geeigneten Tierethikausschuss. Für die postnatale Welpen Tag 8 oder jünger, einschläfern durch Abtrennen des Kopfes mit einer sterilen Schere. Für postnatalen Tag 8 oder älter, Spray Fell mit 70% Ethanol.
- Um die LG zu finden, lag der Maus seitlich von oben Seite nach oben unter einem Binokular mit Beleuchtung. Hinweis: Die postnatale und Erwachsenen LG werden durch die Halsschlagader, M. masseter und der Dermis (siehe Abbildung 5) begrenzt.
- Mit kleinen Dissektion Schere, machen kleinen Einschnitt in der Epidermis seitlich von dem die LG befinden soll.
- Mit einer Pinzette, öffnen Sie die Epidermis in Richtung Ohr, um den LG aussetzen.
- Verwenden einer Pinzette vorsichtig lockern LG vom umgebenden Gewebe.
- Sobald das LG wird vom umgebenden Gewebe freigesetzt wird, entfernen Sie vorsichtig das LG durch den Kanal,durch Ergreifen wobei der Kanal und die Epithelien Umgebung des Auges zu verbinden (Figur 1).
- Platzieren LGS RNA Lysepuffer für RT-PCR, oder fix mit 4% PFA für 20 min zur Immunfärbung.
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Representative Results
Das LG entwickelt sich durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese. Hell Bilder embryonaler LGs bei e14, e15, e16, e17 und P2 seziert illustrieren diese Veranstaltung.
Abbildung 1. Das LG entwickelt sich durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese. Hell Bilder embryonaler LGs frisch bei e14, e15, e16, e17 und P2 seziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Beachten Sie, dass die Epithel in der Größe zunimmt, die Menge des Mesenchym abnimmt. Die experimentellen Schritte zur Mikrodissektion der embryonalen LGS sind in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Schritte in LG Mikrodissektion von Maus-Embryonen beteiligt. Schematische Darstellung der Präparation und Entfernung des LG aus dem embryonalen Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Für LG Kultur, die wir routinemäßig nutzen e16 Embryonen aufgrund der Konsistenz in ex vivo Wachstum. Wie in 3 gezeigt, LG in ex vivo-Kultur Bedingungen zu entwickeln in einer ähnlichen Weise zu der in vivo Drüse (vergleiche Abbildung 1).
Abbildung 3. Exvivo Kultur von e16 LGs rekapituliert in vivo Morphogenese. e16 LGs wurden von Pax6-Cre, GFP Embryonen, in denen GFP wird durch das Epithel exprimiert werden. Konsekutiv Fluoreszenzbilder wurden von diesem Einzeldrüse erstellt am 0, 3, 6, 12, 24 und 48 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Hier beschäftigten wir Pax6-Cre, GFP (auch Le-Cre 5) Embryonen an Epithelzellen zu markieren, so dass wir in Folge Fluoreszenzbilder des Verzweigungs Epithel über den 48 h Kulturzeit zu nehmen. Mäuse, die Pax6-Cre, GFP-Transgen aus JAX erhalten: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr aber nicht für Drüse Dissektion und Kultur erforderlich.
Kulturen oder frisch präpariert LG kann dann für Immunfluoreszenz-Analyse festgelegt werden. Abbildung 4 shows die Visualisierung von vier zellulären Kompartimenten, Mesenchym, Epithel (EpCAM), Nerven (Tubb3) und Blutgefäße (PECAM) in einem e16 LG von einem Wildtyp (CD1) Embryo.
Abbildung 4. Das LG besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, neuronalen und endothelialen Zellen. E16 LG wurde für Epithelzellen (EpCAM, grün), Neuronen (Tubb3, rot) und Endothelzellen (PECAM, cyan) immungefärbt. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Für frisch sezierten Gewebe ist es einfacher, die LG in Laminin ersten einzubetten, wie für die Kultur durchgeführt, so daß die Verschraubung zur Fixierung und anschließende Handhabung zu immobilisieren. 5 zeigt eine schemafür die Präparation der postnatalen / Erwachsener LG.
Abbildung 5. Schematische Darstellung der Schritte in LG Mikrodissektion von postnatalen und adulten Maus beteiligt. Schematische Darstellung der Präparation und Entfernung des LG entweder postnatale oder Erwachsener Maus. Ein Pax6-Cre, GFP postnatalen Tag 30 der Maus wurde verwendet, um die Position des LG und zugehörigen Kanal visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Position der postnatalen / Erwachsener LG hat mit Hilfe der Pax6-Cre, GFP Maus sichtbar gemacht worden.
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Discussion
Die Vielseitigkeit der Kultur und manipulieren das LG ex vivo bietet erhebliche Vorteile für das Studium ihrer Entwicklung. Dies schließt die Geschwindigkeit, mit der sich der Forscher in der Lage, Hypothesen und die Vielzahl von Störungen, die ausgeführt ist, um zu beurteilen, wie Epithelzellen, neuronale, Endothel- und mesencyhmal Zellen interagieren, um das Organ zu bilden, zu testen. Es gibt jedoch eine Reihe von Einschränkungen bei der Nutzung dieses Modell. Erstens durch seine Isolierung die Drüse nicht mehr an die peripheren Gefäßsystem oder das Nervensystem, die beeinflussen können die Signalwege getestet, ob sie mit den Signalen von den Nerven oder Blutgefäße 9,10 geliefert arbeiten in Verbindung angeschlossen. Zweitens können die umgebenden nicht-LG Gewebe bereitzustellen Faktoren, LG Entwicklungs 4 regulieren. Zur Vermeidung dieses andere nicht-mesenchymalen Gewebekomponenten müssen vor der Kultur entfernt werden. Drittens gegenwärtig sind wir nicht in der Lage, die Bedingungen für eine vollständige cytodifferent erforderlich sindiation in eine voll funktionsfähige Gewebe. Dies ist der Fall für alle Organe ex vivo kultiviert und ist wahrscheinlich auf mehreren Gründen, einschließlich der Abwesenheit von funktionellen Blutgefäße und Nerven und / oder mechanische Kräfte vom umgebenden Gewebe. Trotz dieser Vorbehalte Mechanismen in ex vivo Kultur entdeckt haben gezeigt, dass in den nachfolgenden in vivo Experimenten rekapituliert werden, so dass dies ein robustes System für die Erprobung neuer Hypothesen 8,11.
Es hat sich gezeigt, dass Entwicklungs und Rückwege signifikant überlappen, was anzeigt, dass die ex-vivo-Kultursystem kann auch eingesetzt werden, um Organregeneration 12 zu untersuchen. Obwohl wir diesen Aspekt nicht bewiesen wir hier, und andere, die zuvor gezeigt haben, die embryonalen Speicheldrüse kann verwendet werden, um die Effekte der therapeutischen Strahlung auf Organschäden und Regeneration 13 modellieren. Zukünftige Untersuchungen sind erforderlich, um die Verwendung der LG ex vivo System zu erforschenein Modell für die Geweberegeneration.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Förderung durch die UCSF Ressourcenzuordnung Programm vorgesehen anzuerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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