Murine अश्रु ग्रंथि जोड़ तोड़

Summary

अश्रु ग्रंथि (एलजी) दृष्टि और नेत्र स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए आवश्यक आँसू की जलीय घटकों का उत्पादन एक शाखाओं में बंटी अंग है. यहाँ हम एलजी विकास में शामिल रास्ते संकेत समझने के लिए murine एलजी विच्छेदन और पूर्व vivo संस्कृति तकनीकों का वर्णन है.

Abstract

अश्रु ग्रंथि (एलजी) कॉर्निया की संरचना और समारोह, दृष्टि के लिए आवश्यक एक पारदर्शी ऊतक बनाए रखने के लिए आवश्यक जलीय आँसू स्रावित करता है. 5 नलिकाओं - मानव में एक भी एलजी 3 के माध्यम से नेत्र सतह पर आँसू पहुंचाने प्रत्येक आंख के पार्श्व अंत से ऊपर की कक्षा में रहता है. माउस प्रमुख नेत्र ग्रंथियों के तीन जोड़े की है, जिनमें से अधिकांश का अध्ययन कान को exorbital अश्रु ग्रंथि (एलजी) स्थित पूर्वकाल और उदर है. अन्य ग्रंथियों के अंगों के लिए इसी प्रकार, एलजी एक गाढ़ा mesenchyme के भीतर एक भी उपकला कली स्रावी acini और नलिकाओं की एक जटिल परस्पर नेटवर्क के रूप में कली और वाहिनी के गठन के कई दौर आए जिसमें उपकला शाखाओं में बंटी morphogenesis की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करता है. इस व्यापक प्रक्रिया को अच्छी तरह से अग्न्याशय और लार ग्रंथि के रूप में कई अन्य उपकला अंगों में दर्ज़ किया गया है. हालांकि, एलजी बहुत कम पता लगाया गया है और morphogenesis नियंत्रित तंत्र खराब तहत कर रहे हैंखड़ा था. हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में यह कम प्रतिनिधित्व, ढूँढने विदारक और एलजी संवर्धन के साथ जुड़े कठिनाइयों का परिणाम है कि संदेह है. इस प्रकार, यहाँ हम विच्छेदन कटाई भ्रूण और प्रसवोत्तर एलजी के लिए तकनीक और ऊतक के पूर्व vivo संस्कृति के लिए विधियों का वर्णन.

Introduction

अश्रु ग्रंथि (एलजी) दृश्य तीक्ष्णता और स्वास्थ्य, रखरखाव, और नेत्र सतह की कोशिकाओं के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण जलीय आंसू स्राव के लिए जिम्मेदार है. आंख में जलन, प्रकाश संवेदनशीलता की विशेषता है और दृष्टि ¹ की कमी हुई है जो जलीय कमी सूखी नेत्र रोग,: सबसे आम और कमजोर कर देने वाली नेत्र विकारों में से एक में एलजी शिथिलता का परिणाम है. मानव में एलजी आँख के पार्श्व अंत से ऊपर की कक्षा में रहता है जहां 3 - नेत्र सतह पर 5 निकालनेवाला नलिकाओं जमा आँसू. माउस प्रमुख नेत्र ग्रंथियों के तीन जोड़े की है, जिनमें से अधिकांश का अध्ययन एक ही मल त्यागने वाहिनी के माध्यम से आँख के लिए यात्रा आँसू के साथ कान (exorbital) को अश्रु ग्रंथि (एलजी) स्थित पूर्वकाल और उदर है. अन्य ग्रंथियों के अंगों के लिए इसी प्रकार, एलजी एक गाढ़ा mesenchyme के भीतर एक भी उपकला कली कई कली का दौर और के लिए करने के लिए वाहिनी के गठन की प्रक्रिया में जो उपकला शाखाओं में बंटी morphogenesis की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करता है(चित्रा 1) स्रावी acini और नलिकाओं की एक जटिल परस्पर नेटवर्क मी ^2. विकास के दौरान उपकला vascularized हो जाता है साथ ही भारी के रूप में बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि ³ से सहानुभूति नसों से pterygopalatine नाड़ीग्रन्थि की परानुकंपी नसों से और एक हद तक कम करने के लिए innervated. प्रकार न्यूरोनल, उपकला, endothelial और mesenchymal कोशिकाओं यानी इन कोशिकाओं में से प्रत्येक के बीच बातचीत, समारोह और वयस्क ऊतक के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, अंतर-सेल प्रकार संचार इन प्रक्रियाओं गाइड कैसे और साथ ही एलजी विकास और उत्थान समन्वय अंतर्निहित आणविक तंत्र अस्पष्ट बनी हुई है.

भ्रूण पूर्व vivo संस्कृति तकनीक के आगमन के कई शाखाओं में बंटी अंगों ⁴ में विकास और पुनर्योजी रास्ते की पहचान की अनुमति दी है. पूर्व vivo संवर्धन शोधकर्ता (मेरे अंग में हेरफेर करने की क्षमता देता हैchanical, आनुवंशिक या रासायनिक) परिभाषित शर्तों के तहत के साथ ही वास्तविक समय में अंग विकास और सेल सेल बातचीत विशेषताएँ. माउस के exorbital एलजी इस तकनीक को अत्यधिक उत्तरदायी है और हाल के अध्ययनों से इसके विकास ^2,5 विनियमित प्रणाली है कि संकेत को परिभाषित किया है. हालांकि, एलजी विकास और उत्थान underpinning आणविक संकेतों को समझने की जरूरत के बावजूद, यह वर्तमान की संभावना की वजह से अंग अलग में तकनीकी कठिनाइयों को, understudied बनी हुई है. इस पत्र में, हम अलग और विकास कार्यक्रमों को परिभाषित करने के लिए भ्रूण murine एलजी के पूर्व vivo संस्कृति को करने के लिए क्या करते हैं.

Protocol

सभी जानवर काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार तहत किया गया था. प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), सैन फ्रांसिस्को द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. माउस भ्रूणीय अश्रु ग्रंथियों (एलजी): फसल काटने वाले और Microdissection

1. वैज्ञानिक अनुसंधान आचार समिति के लिए संस्थागत पशु द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के बाद उचित भ्रूण दिन पर फसल भ्रूण को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से पुष्टि द्वारा पीछा किया, बढ़ती सीओ ₂ साँस लेना के साथ गर्भवती सीडी-1 (या ट्रांसजेनिक) महिलाओं का समय समाप्त हो euthanize. योनि प्लग खोज E0 का दिन निर्धारित करें.
   नोट: अश्रु ग्रंथियों (LGS) के बाद E14 एक कली मंच से काटा जा सकता है. हालांकि, E16 (5 - 10 कलियों) भ्रूण पूर्व vivo संस्कृति के लिए सबसे अनुरूप परिणाम दे.
2. वी जीवाणुरहित70% इथेनॉल का उपयोग माउस की entral ओर. त्वचा चुटकी और बाँझ सर्जिकल कैंची से midline पर एक चीरा बनाने; त्वचा के माध्यम से कट और उदर गुहा का पर्दाफाश करने पेरिटोनियम. 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक प्रत्येक गर्भाशय सींग और जगह ठंड पीबीएस में (फॉस्फेट बफर खारा) या DMEM F12 के मीडिया के शीर्ष पर mesometrium के साथ काटने से 2 गर्भाशय सींग निकालें.
3. संदंश का प्रयोग (# 5), एमनियोटिक थैलियों से भ्रूण को हटा दें और ठंडा पीबीएस युक्त एक दूसरे बाँझ पेट्री डिश में जगह है. आंखों या सिर क्षेत्र स्पर्श नहीं करने के लिए सावधान रहें.
4. एक transillumination आधार के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप पर भ्रूण रखें. 1.7 - भ्रूण <E17 है, तो कदम 1.5 प्रदर्शन करते हैं. भ्रूण रहे हैं> E17, इन चरणों इसलिए 1.8 कदम आगे बढ़ना, सहायक हो लेकिन आवश्यक नहीं कर रहे हैं हो सकता है.
5. सिर्फ कम जबड़ा नीचे धड़ (चरण 1, चित्रा 2) usin से सिर तोड़गा बाँझ स्केलपेल (# 10 ब्लेड). जबड़ा विदारक थाली पर अब इतना है कि सिर घुमाएँ. सिर और के बारे में एक चौथाई मस्तिष्क (चरण 2, 1 ^सेंट कटौती, चित्रा 2) के पृष्ठीय पक्ष के दूर करने के लिए एक स्केलपेल को स्थिर करने के लिए संदंश का प्रयोग करें - यह उपास्थि E15 आसपास stiffens एक बार विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
6. स्केलपेल आंखों के बीच नाक में छेद कर सकते हैं ताकि सिर पूरबी. आंखों अलग हिस्सों (चरण 2, 2 ^{एन डी} कटौती, चित्रा 2) पर अब कर रहे हैं ताकि, सिर के केंद्र के माध्यम से एक कटौती करें.
7. दो # 5 संदंश का प्रयोग, सिर के एक आधा ले और अतिरिक्त ऊतक (चित्रा 2 चरण 3 देखें) को हटा दें. (आंख के निचले पीछे कोने में स्थित) एलजी इस हटाने की प्रक्रिया में खो नहीं है तो सिर उन्मुख करने के लिए सुनिश्चित करें. अतिरिक्त मस्तिष्क, उपास्थि, और नाक ऊतक आसपास और आंख के नीचे निकालें. ग्रंथि इस बात पर मुश्किल से दिखाई है, ठीक से अतिरिक्त ऊतक को हटाने टी के बाद उन्मुख है आंख सुनिश्चितओ एलजी का स्थान खोने से बचने.
8. ध्यान से पीछे, दोनों संदंश के साथ आंख के नीचे कोने से त्वचा हड़पने. ध्यान से एलजी का पर्दाफाश करने संदंश के साथ खुला खींच कर त्वचा निकालें. एलजी कल्पना में मदद करने के लिए ऊतक के ऊपर और नीचे अतिरिक्त रोशनी का उपयोग करें.
   नोट: एलजी, एक गहरे, गाढ़ा mesenchyme के भीतर एक वाहिनी पर एक कली के रूप में अपनी उपस्थिति से अलग पहचाना, इस बिंदु पर दिखाई जानी चाहिए.
9. ध्यान एलजी और जुड़े mesenchyme एलजी या उसके संबंधित वाहिनी हड़पने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, संदंश का उपयोग दूर आसपास के ऊतकों से (चित्र और छवियों को देखें) काटना शुरू करते हैं. ग्रंथि आसपास के ऊतकों से मुक्त होने के बाद धीरे एलजी वाहिनी के आधार पर आंख आसपास के epithelia उत्साहित द्वारा पूरे ग्रंथि को हटा दें. एक संक्षिप्त mesenchyme में जो उपकला invaginates के रूप में देखा जा सकता है जो उपकला, आसपास mesenchyme संरक्षित करने के लिए ध्यान रखना.
   नोट: Tissu से कुछ अतिरिक्त हटानेई (किसी भी छोटे हड्डी के टुकड़े, मांसपेशियों, और संयोजी ऊतक) ऊतक पड़ोसी से / वृद्धि कारकों संकेत से बचने के लिए आवश्यक हो सकता है.
10. संस्कृति, फसल 4 - 5 ग्रंथियों और प्लेट प्रति जुड़े mesenchyme (LGS तुरंत विच्छेदन पर चढ़ाया जाता है); आरटी-पीसीआर ⁶ के लिए शाही सेना lysis बफर के 100 μl प्रति 14 ग्रंथियों की एक न्यूनतम जमा.

2. पूर्व vivo संस्कृति के लिए प्लेटें तैयार

इस प्रक्रिया को विकसित लार ग्रंथि ^7,8 के लिए कार्यरत उस पर आधारित है.

1. एक गिलास तली 50 मिमी व्यास microwell पकवान ⁷ से 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एस्कॉर्बिक एसिड और 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Holo-transferrin साथ संस्कृति मीडिया (100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) DMEM F12 के 200 μl जोड़ें.
   नोट: हम पहले से भ्रूण लार ग्रंथि में morphogenesis को अधिकतम करने के लिए यह पाया DMEM F12 के लिए चुना गया था.
2. एक 13 मिमी polycarb फ्लोटमीडिया के शीर्ष पर 0.1 माइक्रोन pores के साथ Onate झिल्ली फिल्टर.
3. वैकल्पिक कदम: 3 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए DMEM / F12 के साथ 1 (धीरे ​​मिश्रण करने के लिए 200 μl विंदुक का उपयोग करें, अपकेंद्रित्र 1 मिनट के लिए बुलबुले दिखाई देते हो): 3-डी laminin 1 पतला. जोड़ें इस के 15 μl फिल्टर करने के लिए 3 डी laminin पतला.
   नोट: यह कमजोर पड़ने उपकला शाखाओं में कोई समझौता किए बिना अपने 3 डी राज्य में एलजी को बनाए रखने के लिए इष्टतम हो पाया था. हालांकि, यह एलजी की संस्कृति के लिए आवश्यक नहीं है.
4. फिल्टर पर या laminin में 5 एलजी - 4 जगह. संस्कृति LGs पूर्व vivo 24 के लिए - 48 घंटे (चित्रा 3) या 20 qPCR से आगे के विश्लेषण के लिए न्यूनतम या immunostaining (चित्रा 4) के लिए 4% पीएफए ​​के साथ तय कर लो. भ्रूण ग्रंथियों के ऊतकों की qPCR विश्लेषण के लिए, Rebustini एट अल देखें. 2011. भ्रूण ग्रंथियों के ऊतकों की Immunofluorescent विश्लेषण के लिए निम्नलिखित प्रशंसा पत्र का संदर्भ लें: हॉफमैन एट अल (2002) और स्टाइनबर्ग ई.टी अल., (2005).

3. माउस प्रसव के बाद और वयस्क अश्रु ग्रंथियों (एलजी): विच्छेदन

1. उचित पशु आचार समिति के मानकों के अनुसार प्रसव के बाद माउस euthanize. प्रसव के बाद पिल्ले दिन 8 या छोटे के लिए, बाँझ कैंची से सिर विच्छेद द्वारा euthanize. प्रसव के बाद 8 दिन या उससे अधिक के लिए, 70% इथेनॉल के साथ फर स्प्रे.
2. एलजी का पता लगाने के लिए, माउस के ऊपर से रोशनी के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ओर पार्श्व रखना. नोट: प्रसवोत्तर और वयस्क एलजी मन्या धमनी, masseter मांसपेशियों और डर्मिस (चित्रा 5 देखें) द्वारा bordered हैं.
3. छोटे विच्छेदन कैंची का प्रयोग, पार्श्व एलजी स्थित होना चाहिए जहां से एपिडर्मिस में छोटा सा चीरा बनाते हैं.
4. संदंश का प्रयोग, एलजी बेनकाब करने के लिए कान की ओर एपिडर्मिस खोलने खींच.
5. धीरे आसपास के ऊतकों से एलजी ढीला संदंश का प्रयोग करें.
6. एलजी आसपास के ऊतकों से रिहा होने के बाद, ध्यान से, वाहिनी द्वारा एलजी हटानेवाहिनी और आंख के आसपास के epithelia (चित्रा 1) कनेक्ट जहां उत्साहित द्वारा.
7. आरटी-पीसीआर के लिए शाही सेना lysis बफर में LGs स्थान या immunostaining के लिए 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ तय कर लो.

Representative Results

एलजी उपकला शाखाओं में बंटी morphogenesis की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करता है. E14, E15, E16, E17, और p2 पर विच्छेदित भ्रूण LGs की brightfield छवियों इस घटना को वर्णन.

चित्रा 1. एलजी morphogenesis शाखाओं में उपकला की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करता है. हौसले E14, E15, E16, E17 और p2 पर विच्छेदित भ्रूण LGs की Brightfield छवियों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

आकार में उपकला वृद्धि के रूप में, mesenchyme की राशि कम हो जाती है कि ध्यान दें. भ्रूण LGs की microdissection के लिए प्रयोगात्मक चरणों चित्रा 2 में चित्रित कर रहे हैं.

माउस भ्रूण से एलजी microdissection में शामिल कदम की चित्रा 2. योजनाबद्ध. विच्छेदन और भ्रूण माउस से एलजी के हटाने के योजनाबद्ध आरेख. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एलजी संस्कृति के लिए हम नियमित तौर पर पूर्व vivo विकास में स्थिरता के कारण E16 भ्रूण का उपयोग. चित्रा 3 में दिखाया गया है संस्कृति की स्थिति में विवो ग्रंथि के लिए एक समान तरीके से विकसित विवो, एलजी में पूर्व (1 चित्रा से तुलना).

चित्रा 3. पूर्वE16 LGs की विवो संस्कृति विवो morphogenesis में स्मरण दिलाता है. E16 LGs GFP उपकला द्वारा व्यक्त की है जहां Pax6-Cre, GFP भ्रूण से प्राप्त किए गए. लगातार फ्लोरोसेंट छवियों पर इस एक ग्रंथि का लिया गया 0, 3, 6, 12, 24, और 48 घंटा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

यहाँ हम हमें 48 घंटे संस्कृति अवधि में शाखाओं उपकला की लगातार फ्लोरोसेंट छवियों लेने की इजाजत दे, उपकला कोशिकाओं को उजागर करने के लिए (भी ले-Cre ⁵ कहा जाता है) Pax6-Cre, GFP भ्रूण कार्यरत हैं. Pax6-Cre, GFP transgene शरण चूहे JAX से प्राप्त किया जा सकता है: टीजी (Pax6-Cre, GFP) के 1Pgr लेकिन ग्रंथि विच्छेदन और संस्कृति के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं.

संस्कृतियों या हौसले एलजी तो Immunofluorescent विश्लेषण के लिए तय किया जा सकता विच्छेदित. 4 एस चित्राएक जंगली प्रकार (CD1) भ्रूण से एक E16 एलजी में 4 सेलुलर डिब्बों, mesenchyme, उपकला (EpCAM), नसों (Tubb3) और रक्त वाहिकाओं (PECAM), के दृश्य hows.

चित्रा 4. एलजी उपकला, neuronal और endothelial कोशिकाओं सहित कई प्रकार की कोशिकाओं से बना है. E16 एलजी उपकला कोशिकाओं (EpCAM, हरा), न्यूरॉन्स (Tubb3, लाल) और endothelial कोशिकाओं (PECAM, सियान) के लिए immunostained गया था. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

हौसले से विच्छेदित ऊतक के लिए यह निर्धारण और बाद में निपटने के लिए ग्रंथि को स्थिर करने के लिए इतनी के रूप में, संस्कृति के लिए किया के रूप में पहले, laminin में एलजी एम्बेड करने के लिए आसान है. 5 एक योजनाबद्ध पता चलता हैप्रसव के बाद / वयस्क एलजी के विच्छेदन के लिए.

प्रसवोत्तर और वयस्क माउस से एलजी microdissection में शामिल कदम की चित्रा 5. योजनाबद्ध. या तो प्रसवोत्तर या वयस्क माउस से विच्छेदन और एलजी को हटाने के योजनाबद्ध आरेख. एक Pax6-Cre, GFP के प्रसवोत्तर दिन 30 माउस एलजी और जुड़े वाहिनी की स्थिति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रसवोत्तर / वयस्क एलजी की स्थिति Pax6-Cre, GFP माउस का उपयोग करके कल्पना की गई है.

Discussion

संस्कृति के लिए बहुमुखी प्रतिभा और एलजी पूर्व vivo इसके विकास के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हेरफेर. इस शोधकर्ता परिकल्पना और, न्यूरोनल, endothelial और mesencyhmal कोशिकाओं अंग के लिए फार्म बातचीत कैसे उपकला का आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि perturbations की भीड़ का परीक्षण करने में सक्षम है, जिस पर गति भी शामिल है. इस मॉडल का उपयोग हालांकि, जब निरंतर का एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, अपने अलगाव के आधार पर ग्रंथि अब वे नसों या रक्त वाहिकाओं ^9,10 ने दिया संकेत के साथ संयोजन के रूप में काम करते हैं अगर संकेत दे रास्ते परीक्षण किया जा रहा प्रभावित कर सकता है जो परिधीय वाहिका संरचना या तंत्रिका तंत्र से जुड़ा है. दूसरा, आसपास के गैर एलजी ऊतकों एलजी विकास ⁴ नियंत्रित करने वाले कारकों प्रदान कर सकता है. यह अन्य गैर mesenchymal ऊतक घटकों संस्कृति से पहले हटा दिया जाना चाहिए से बचने के लिए. तीसरा, वर्तमान में हम पूरा cytodifferent के लिए आवश्यक शर्तों प्रदान करने में सक्षम नहीं हैंएक पूरी तरह कार्यात्मक ऊतकों में iation. इस विवो पूर्व सुसंस्कृत सभी अंगों के लिए मामला है और कारण कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं और नसों और / या आसपास के ऊतकों से यांत्रिक बलों के अभाव सहित कई कारणों से होने की संभावना है. इन निरंतर बावजूद, पूर्व vivo संस्कृति में खोज तंत्र नई परिकल्पना ^8,11 के परीक्षण के लिए यह एक मजबूत प्रणाली बनाने, विवो प्रयोगों में बाद में recapitulated हो चला है.

यह पूर्व vivo संस्कृति प्रणाली भी अंग उत्थान ¹² अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता यह दर्शाता है कि विकास और पुनर्योजी रास्ते में काफी ओवरलैप है कि दिखाया गया है. हम हम, और दूसरों को, जो पहले से पता चला है यहाँ इस पहलू का प्रदर्शन नहीं किया है हालांकि भ्रूण लार ग्रंथि अंग क्षति और उत्थान ¹³ पर चिकित्सीय विकिरण का प्रभाव मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भविष्य के अध्ययन के रूप में एलजी पूर्व vivo प्रणाली के उपयोग का पता लगाने की जरूरत हैऊतक उत्थान के लिए एक मॉडल.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x			Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.