Summary
涙腺（LG）は、ビジョンと眼の健康を維持するために必要な涙の水性成分を生成し、分岐器官である。ここでは、LG電子の開発に関与するシグナル伝達経路を解読するネズミLG郭清およびex vivo培養技術を説明しています。
Abstract
涙腺（LG）は、角膜の構造と機能、視力に不可欠な透明な組織を維持するために必要な水性涙を分泌する。 5ダクト - 人間では、単一のLGは3を通して眼表面に涙を配信するそれぞれの目の横端上記の軌道上に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、耳に眼窩外涙腺（LG）に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が分泌腺房とダクトの複雑な相互接続ネットワークを形成するために、つぼみとダクト形成の複数のラウンドを受けるものでは上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。この精巧なプロセスは、よくそのような膵臓および唾液腺などの多くの他の上皮の器官で文書化されています。しかし、LGはあまり検討されていると形態形成を制御するメカニズムは不完全に下です立っていた。我々は、このアンダー表現モデル系としては、見つけ解剖とLGを培養することに関連する困難の結果であることを疑う。したがって、ここでは解剖収穫胚および出生後のLGのための技術や組織のex vivo培養のための方法が記載されている。
Introduction
涙腺（LG）は、視力や健康、保守、および眼表面の細胞の保護のために重要なの水性涙液分泌を担当しています。眼の刺激、光感受性によって特徴づけられるとビジョン1を減少させ、水性欠乏ドライアイ病、：最も一般的な衰弱性眼疾患の一つでLGの機能不全をもたらす。眼表面上に5排泄ダクト預金涙 - 人間ではLGが3目の側端より上の軌道に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、単一の排泄ダクトを経由して、目に涙を浮かべて旅行する耳（眼窩）へ涙腺（LG）に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が複数の芽のラウンドとするために、ダクトの形成を受けている上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発分泌腺房とダクトの複雑な相互接続されたネットワーク（ 図1）2メートル。開発中は上皮は血管新生になるだけでなく、頻繁に翼口蓋神経節の副交感神経によって上頸神経節3から交感神経によってより少ない程度に神経支配。これらの細胞の種類すなわち神経細胞、上皮細胞、内皮細胞および間葉細胞のそれぞれとの間の相互作用は、成体組織の機能と維持に不可欠である。しかし、セル間タイプの通信は、これらのプロセスをガイドする方法と同様にLGの発達と再生を調整する基礎となる分子機構は依然として不明である。
胚のエクスビボで培養技術の出現は、複数の分岐臓器4の発達と再生経路の同定を可能にした。 ex vivoで培養する研究者を（私に臓器を操作する機能を提供しますリアルタイムでの臓器の発達および細胞 - 細胞相互作用を特徴付けるために、遺伝的または化学的）規定された条件下で同様に機械的、。マウスの眼窩LGがこの技術に非常に適していると最近の研究では、その開発2,5を規制するシグナル伝達系を定義しました。しかし、LG電子の開発と再生を支える分子手がかりを理解する必要にもかかわらず、それは現在、原因臓器を単離する技術的困難に思わ代役のまま。本稿では、分離して発生プログラムを定義するために、胚ネズミLG のex vivo文化を実行する方法について説明します。
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Protocol
全ての動物の作品は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨事項に厳密に従って下で行った。プロトコルは、カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）、サンフランシスコで承認された。
1.マウス胚性涙腺（LG）：収穫と顕微解剖
- 、科学研究倫理委員会のための制度の動物によって承認された手順に従うことで、適切な胚の日に収穫の胚に頸椎脱臼による確認に続いて、上昇したCO 2吸入を妊娠CD-1（またはトランスジェニック）メスを安楽死させる時限。膣栓発見E0の日を指定します。
注：涙腺（地方自治体）は以降のE14シングル蕾の段階から収穫することができる。しかし、E16（5から10つぼみ）の胚は、ex vivo培養のための最も一貫性のある結果を与える。 - Vを殺菌70％エタノールを用いてマウスの側entral。皮膚をつまんで、滅菌外科用ハサミで正中線で切開する。腹腔を露出させ、皮膚および腹膜を通って切断。冷PBS中の各子宮角と場所の上部にある子宮間膜に沿って切断することにより2子宮角を取り外し（リン酸緩衝生理食塩水）または100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを添加したDMEM F12培地。
- 鉗子を使用すると（＃5）、羊膜嚢から胚を削除し、冷PBSを含む第二の滅菌ペトリ皿に置く。目や頭部領域に手を触れないように注意してください。
- 透視ベースと解剖顕微鏡上に胚を置きます。 1.7 -胚が<E17の場合は、 手順1.5を実行します。胚は> E17であれば、これらの手順を参考に、必須ではないが、そのため1.8のステップに進むことができる。
- ちょうど下顎骨下の胴体（ステップ1、 図2）を使うから頭を断つGA滅菌メス（＃10ブレード）。下顎骨は解剖板に今あるように頭を回転させます。 （ステップ2、1 番目のカット、 図2）の約1/4の脳の背側のを除去するために頭とメスを安定させるために鉗子を使用する-軟骨がE15の周りに硬く、一度これは特に重要です。
- メスでは両目の間の鼻を突き刺すことができるように頭を向けます。目が別々の半分（ステップ2、2 番目のカット、 図2）に今あるように、頭の中心を通ってカットを行います。
- 2＃5鉗子を使用して、頭の半分を取り、余分な組織を除去する（ステップ3、 図2参照）。 （目の低い後部の角にあります）、LGがこの除去過程で失われないように頭を向けるようにしてください。過剰脳、軟骨、および周囲や目の下、鼻組織を除去する。腺は、この時点でほとんど見えているので、眼が適切に過剰な組織除去tの後に配向されていることを確認O LGの場所を失うことを避ける。
- 両方の鉗子で眼の後、底の隅から肌を注意深くをつかむ。慎重にLG電子が露出するようにピンセットで開いて引っ張って皮膚を取り除きます。 LG電子を可視化を支援する組織の上下に追加の照明を使用してください。
注：LGは、暗く、凝縮された間葉内のダクト上の芽としてその外観により区別、この時点で表示されるはずです。 - 慎重に、LGまたはそれに関連するダクトをつかむないように注意しながら、離れて鉗子を用いて周囲の組織から（図と画像を参照）、LGおよび関連間充織を解剖し始める。腺は、周囲の組織から自由になったら、そっとLGダクトの基部に眼の周囲の上皮を把持することによって全体の腺を取り除く。凝縮された間葉への上皮陥入として観察することができる上皮を、周囲の間充織を維持するために注意してください。
注：TISSUのいくつかの追加の除去電子メール（任意の小さな骨片、筋肉、および結合組織）は、隣接する組織からのシグナリング/成長因子を回避する必要があるかもしれない。 - 培養のため、収穫4から5腺およびプレート当たりに関連する間葉（自治体が解剖直後にめっきされる）; RT-PCR 6 RNA溶解緩衝液100μl当たり14腺の最小値を収集する。
2. エクスビボ培養プレートを準備します
この手順は、発展途上唾液腺7,8のために使用されるものに基づいています。
- ガラス底の直径50mmのマイクロウェル皿7に50μg/ mlのアスコルビン酸および50μg/ mlのホロトランスフェリンとの培養培地（100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充）したDMEM F12200μlのを追加します。
注：我々は、以前にそれが胚性唾液腺に形態形成を最大化するために見られるような、DMEM F12を選択した。 - 13mmのPOLYCARBフロートメディアの上に0.1μmの細孔を有するonateメンブレンフィルター。
- オプションのステップ：（穏やかに混合するために、200μlのピペットを使用して、泡が現れた場合、1分間遠心分離）を3mg / mlの最終濃度となるようにDMEM / F12で1：3-Dラミニン1を希釈する。この15μlのを追加しフィルタリングする3次元ラミニンを希釈した。
注：この希釈は、上皮分岐を損なうことなく、その三次元状態でLGを維持するために最適であることが見出された。しかし、LGの培養に必須ではない。 - フィルター上またはラミニンに5 LG - 4を配置します。文化自治体ex vivoで 24 - 48時間（ 図3）、または定量PCRまたは免疫染色（ 図4）によるさらなる分析のために20分間、4％PFAで固定します。胚腺組織のqPCR分析のために、Rebustini らをご参照ください。2011年。ホフマンら、（2002）、スタインバーグE：胚腺組織の免疫蛍光分析のために、以下の引用を参照してください。Tら、（2005）。
3.マウス生後および成体涙腺（LG）：解剖
- 適切な動物倫理委員会の基準に従って出生後、マウスを安楽死させる。生後8日目の仔歳以下の場合は、滅菌したハサミで頭部を切断することによって安楽死させる。生後8日以上の場合は、70％エタノールで毛皮をスプレー。
- LG電子の位置を確認するには、マウスを上から照明で解剖顕微鏡の下に左右横横たわっていた。注：産後と大人のLGは、頸動脈、咬筋と真皮（ 図5を参照）に隣接している。
- 小さな解剖ハサミを使用して、LGが配置されるべき場所から横方向に表皮に小さな切開を行います。
- 鉗子を使用して、LGを露出するために、耳に向かって表皮を開く引っ張る。
- 優しく周囲の組織からのLGを緩め鉗子を使用してください。
- LGは、周囲の組織から解放されると、慎重に、ダクトによってLGを削除どこダクトと眼の周囲の上皮（ 図1）を接続することによりグリップ。
- RT-PCRのためのRNA溶解緩衝液中で自治体を置き、または免疫染色のために20分間、4％PFAで固定します。
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Representative Results
LG電子は、上皮分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。 E14、E15、E16、E17、およびP2で解剖胚自治体の明視野画像は、このイベントを説明する。
図1. LGは分枝形態形成上皮のプロセスを経て開発しています。新鮮にE14、E15、E16、E17およびP2で解剖胚自治体の明視野像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サイズが上皮間葉が増加するにつれて減少する量のことに注意してください。胚自治体の顕微解剖のための実験の手順は、図2に示されている。
マウス胚からのLGの顕微解剖に関連するステップの図2の回路図。解剖とマウス胎児からLGの除去の模式図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
LGの文化のために我々は日常的にex vivoでの成長の一貫性に起因するE16の胚を利用する。 図3に示すように、LGでex vivoでの培養条件は、 インビボ腺（ 図1を比較されたい）と同様に発症する。
図3. 例E16地方自治体の vivo 培養は、 インビボ形態形成に再現する。E16の自治体は、GFPは、上皮で表されるPax6の-Creを、GFPの胚から誘導した。連続した蛍光像はで、この単一腺の撮影された0、3、6、12、24、および48時間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ここでは、私たちは48時間の培養期間にわたって分岐上皮の連続的な蛍光画像を撮影することができ、上皮細胞を強調するために（また、LE-Creを5と呼ばれる）Pax6の-Creを、GFPの胚を採用。 Pax6の-Creを、GFP導入遺伝子を保有するマウスは、JAXから入手できます。Tgは（Pax6の-Creを、GFP）1Pgrが、腺解剖と文化のために必要ではありません。
新たに培養物またはLGを解剖し、その後、免疫蛍光分析のために固定することができる。4の図野生型（CD1）胚からE16 LGに、4細胞区画、間葉、上皮（EpCAMの）、神経（Tubb3）および血管（PECAM）の可視化をノウハウ。
図4. LG電子は、上皮、神経細胞および内皮細胞を含む複数の細胞型で構成されている。E16 LGは上皮細胞（EpCAMは、緑）、ニューロン（Tubb3、赤色）および内皮細胞（PECAM、シアン）のために免疫染色した。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
新鮮に解剖した組織にとっては、培養のために行われているような固定およびその後の取り扱いのための腺を固定するように第1、ラミニンでLG電子を埋め込 むことが容易である。 図5は、回路図を示します生後/大人のLGの解剖のために。
産後および成体マウスからLGのマイクロダイセクションに含まれる手順の概略図5.。どちらか、出生後または成体マウスから解剖とLGの除去の模式図。 Pax6の-Creを、GFP産後30日目のマウスは、LGおよび関連ダクトの位置を可視化するために使用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生後/成人LGの位置は、Pax6の-Creを、GFPマウスを用いて可視化されている。
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Discussion
文化への汎用性とex vivoで 、LGを操作は、その開発を研究するための重要な利点を提供します。これは、研究者の仮説と、神経、内皮およびmesencyhmal細胞は器官を形成するように相互作用する方法を、上皮評価することができる多数の摂動をテストすることができる速度を含む。このモデルを利用する場合しかし、警告の数が存在する。まず、その分離によって腺は、それらが神経や血管9,10によって送出信号と連動して動作している場合、試験されるシグナル伝達経路に影響を与える可能性が、もはや末梢血管系または神経系に接続されていない。第二に、周囲の非LG組織はLG開発4を調節する因子を提供することができる。この他の非間葉組織成分は、培養の前に除去しなければならない回避する。第三に、現時点では、我々は完全なcytodifferentのために必要な条件を提供することができません完全に機能する組織内にiation。これはex vivoで培養されたすべての臓器の場合ですと原因、機能血管と神経および/ または周囲の組織からの機械的な力の欠如など、複数の理由による可能性が高い。これらの警告にもかかわらず、ex vivoで培養中に発見されたメカニズムは、新たな仮説8,11を試験するための堅牢なシステムこれを行う、 生体内実験において後続に要約されることが示されている。
これは、ex vivoでの培養系はまた、臓器再生12を研究するために用いることができることを示す、発達および再生経路が大幅にオーバーラップすることが示されている。我々は、その他は、以前に示されている、ここでこの局面を実証していないが、胚性唾液腺、臓器損傷および再生13に対する治療放射線の影響をモデル化するために使用することができる。今後の研究では次のようにLG のex vivoシステムの使用を探求するために必要とされる組織再生のためのモデル。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
著者は、UCSFリソース割当プログラムにより提供される資金調達を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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