Summary
Den tårekjertelen (LG) er en forgrening organ som produserer de vandige komponenter av tårer er nødvendige for å opprettholde visjon og okulær helse. Her beskriver vi murine LG disseksjon og ex vivo kultur teknikker for å dechiffrere signalveier er involvert i LG utvikling.
Abstract
Den tårekjertel (LG) utskiller vandige tårer som er nødvendige for å opprettholde strukturen og funksjonen av hornhinnen, en transparent vev avgjørende for synet. I menneske en enkelt LG befinner seg i bane over den laterale ende av hvert øye å levere tårer til den okulære overflaten gjennom 3-5 kanalene. Musen har tre par store okulære kjertler, det mest studerte av disse er exorbital tårekjertel (LG) plassert i fremre og ventral til øret. I likhet med andre kjertel organer, utvikler LG gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese i hvilket en enkelt epitel knopp innenfor en kondensert mesenchyme gjennomgår multiple runder med knopp, og kanaldannelse for å danne en intrikat innbyrdes forbundet nettverk av sekretorisk acini og kanaler. Denne detaljert prosess har blitt godt dokumentert i mange andre epiteliale organer som bukspyttkjertelen og spyttkjertel. Imidlertid har LG vært mye mindre utforsket, og mekanismene som kontrollerer morphogenesis er dårlig ettersto. Vi mistenker at dette underrepresentasjon som modellsystem er en konsekvens av de vanskelighetene forbundet med å finne, dissekere og dyrking LG. Derfor, her vi beskriver disseksjon teknikker for høsting embryonale og post-natal LG og metoder for ex vivo kultur av vevet.
Introduction
Den tårekjertel (LG) er ansvarlig for vandig tåresekresjon kritisk for synsskarphet og helse-, vedlikehold og beskyttelse av celler av den okulære overflaten. LG dysfunksjon resulterer i en av de mest vanlige og ødeleggende øyelidelser: vandig mangel Dry Eye Disease, som er preget av okulær irritasjon, lysfølsomhet og redusert syn en. I menneske LG befinner seg i bane over sidekanten av øyet der 3-5 excretory kanaler innskudds tårer bort på okulær overflate. Musen har tre par store okulær kjertler, den mest studerte av desse er tårekjertelen (LG) plassert anterior og ventral til øret (exorbital) med tårer som reiser til øyet via en enkelt utførselskanal. I likhet med andre kjertel organer, utvikler LG gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese i hvilket en enkelt epitel knopp innenfor en kondensert mesenchyme gjennomgår multiple runder med knopp og kanaldannelse for åm en intrikat sammenvevd nett av sekretorisk acini og kanaler (Figur 1) 2. Under utviklingen Epitel blir vaskulariserte samt tungt innervated av de parasympatiske nerver av pterygopalatine ganglion og i mindre grad av sympatiske nerver fra den overlegne cervical ganglion tre. Interaksjoner mellom hver av disse celler neuronale typer dvs., epitelceller, endotelceller og mesenchymale celler, er viktige for funksjonen og vedlikeholdet av voksent vev. Men de underliggende molekylære mekanismene koordinere LG utvikling og fornyelse samt hvordan inter-celle type kommunikasjon guider disse prosessene er fortsatt uklart.
Ankomsten av embryonale ex vivo kultur teknikker har tillatt identifisering av utviklingsmessige og regenererende trasé i flere forgreninger organer fire. Dyrking ex vivo gir forskeren mulighet til å manipulere organ (megmekaniske, genetisk eller kjemisk) under definerte betingelser, så vel som å karakterisere organutvikling og celle-celle-vekselvirkninger i sanntid. Den exorbital LG av musen er svært mottagelig for denne teknikken og nyere studier har definert signalsystemer som regulerer dens utvikling 2,5. Men til tross for behovet for å forstå molekylære signaler som ligger til grunn LG utvikling og fornyelse, er det fortsatt for tiden studerte, sannsynligvis på grunn av tekniske problemer i å isolere organ. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du isolerer og utføre ex vivo kulturen i den embryonale murine LG å definere utviklingsprogrammene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbeidet ble utført under strengt samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco.
1. Mouse Embryonic Lacrimal Kjertler (LG): Høsting og mikrodisseksjon
- Etter prosedyrer godkjent av de institusjonelle Dyr for Scientific forskningsetiske komité, avlive timet gravide CD-en (eller transgene) hunner med økende CO 2 innånding, etterfulgt av bekreftelse ved halshugging for å høste embryoer på den aktuelle embryonale dag. Utpeke den dagen vaginal plug oppdagelse E0.
Merk: Lacrimal kjertler (LGS) kan høstes fra e14 singel knopp scenen utover. Men e16 (5 - 10 knopper) embryoer gi de mest konsistente resultater for ex vivo kultur. - Sterilisere ventral side av mus ved bruk av 70% etanol. Knip huden og gjør et snitt på midtlinjen med sterile kirurgiske saks; skjære gjennom huden og bukhinnen å eksponere bukhulen. Fjern de to uterine horn ved å skjære langs mesometrium på toppen av hvert livmorhorn og plasser i kald PBS (fosfatbuffret saltvann) eller DMEM-F12 medium supplert med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
- Bruk pinsett (# 5), fjern embryoer fra fosterblærer og legg inn en ny steril petriskål som inneholder kald PBS. Vær forsiktig med å ikke ta på øyne eller hoderegionen.
- Plasser embryo på et disseksjonsmikroskop med en transilluminasjon base. Hvis fosteret er <E17, utfør trinn 01.05 til 01.07. Hvis embryoer er> E17, disse trinnene kan være nyttig, men er ikke avgjørende, derfor videre til trinn 1.8.
- Sever hodet fra torsoen like under den nedre kjeven (trinn 1, figur 2) øga steril skalpell (# 10 blad). Rotere hodet slik at kjeven er nå på dissekere plate. Bruk pinsett til å stabilisere hode og en skalpell for å fjerne ca ¼ av dorsal side av hjernen (trinn 2, 1 st kuttet, figur 2) - dette er spesielt viktig når brusken stivner rundt e15.
- Orientere hodet slik at skalpell kan pierce nesen mellom øynene. Gjør et kutt gjennom midten av hodet, slik at øynene er nå på separate halvdeler (trinn 2, 2. cut, figur 2).
- Ved hjelp av to # 5 pinsett, ta den ene halvdelen av hodet og fjerne overflødig vev (se trinn 3, figur 2). Pass på å orientere hodet slik LG (ligger i nedre bakre hjørnet av øyet) ikke går tapt i denne fjerningen. Fjern overflødig cerebral, brusk, og nasal vevet rundt og under øyet. Siden kjertelen er knapt synlig på dette punktet, sørge for øyet er riktig orientert etter overflødig vev fjerning to unngå å miste plasseringen av LG.
- Grip nøye huden mot bakre, nedre hjørnet av øyet med begge tang. Fjern skinnet ved å trekke åpen med pinsett å avsløre LG. Bruk ytterligere belysning over og under vevet for å visualisere LG.
Merk: LG, lett gjenkjennelig med sitt utseende som en knopp på en kanal i en mørkere, kondensert mesenchyme, skal være synlig på dette punktet. - Nøye begynne å dissekere LG og tilhørende mesenchyme (se diagram og bilder) fra omkringliggende vev ved hjelp av tang, være forsiktig med å ta tak i LG eller tilhørende kanal. Når pakkboksen er fri fra det omgivende vev, fjern forsiktig hele gjennomføringen ved griping av epitel som omgir øyet på bunnen av LG kanalen. Vær nøye med å bevare mesenchyme rundt epitel, som kan observeres som en kondensert mesenchyme i hvilke epitel invaginates.
MERK: Noen ekstra fjerning av tissue (noen små beinfragmenter, muskel og bindevev) kan være nødvendig for å unngå signale / vekstfaktorer fra nabo vev. - For kultur, høste 4-5 kjertler og tilhørende mesenchyme per plate (LGS er belagt umiddelbart ved disseksjon); samle minst 14 kjertler per 100 mL av RNA lysisbuffer for RT-PCR 6.
2. Forbered Plater for Ex vivo Culture
Denne fremgangsmåten er basert på det som benyttes for å utvikle spyttkjertel 7,8.
- Tilsett 200 ul DMEM-F12 (supplert med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) kulturmedium med 50 ug / ml askorbinsyre og 50 ug / ml holo-transferrin i en glass-bunn 50 mm diameter mikro fatet 7.
Merk: DMEM F12 ble valgt som vi tidligere har funnet det å maksimere morphogenesis i fosterspyttkjertel. - Flyte en 13 mm polycarbOnate membranfilter med 0,1 mikrometer porer på toppen av media.
- Valgfritt trinn: Fortynn 3-D laminin 1: 1 med DMEM / F12 for å lage en endelig konsentrasjon på 3 mg / ml (200 ul pipette for bruk til å blande forsiktig; sentrifuger i 1 min dersom det oppstår bobler). Tilsett 15 mL av denne fortynnede 3-D laminin å filtrere.
Merk: Denne fortynning ble funnet å være optimalt for å opprettholde LG i sin 3D tilstand uten at det går epitelial forgrening. Det er imidlertid ikke avgjørende for dyrking av LG. - Plasser 4-5 LG på filter eller inn laminin. Kultur LGS ex vivo til 24 - 48 timer (figur 3) eller fikse med 4% PFA i 20 min for videre analyse ved qPCR eller farging (figur 4). For qPCR analyse av embryoniske kjertelvev, henvises det til Rebustini et al., 2011. For immunofluorescent analyse av embryoniske glandular vev henvises det til følgende sitater: Hoffman et al, (2002) og Steinberg e.t al., (2005).
3. Mouse Postnatal og Adult Lacrimal Kjertler (LG): Dissection
- Avlive barsel musen i henhold til aktuelle dyreetikk Komiteens standarder. For postnatal unger dag 8 eller yngre, avlive ved å kutte hodet med steril saks. For postnatal dag 8 eller eldre, spray pels med 70% etanol.
- For å finne LG, lå muse lateral side opp under et disseksjonsmikroskop med belysning ovenfra. Merk: Den post-natal og voksen LG er avgrenset av halspulsåren, tyggemuskelen og dermis (se figur 5).
- Ved hjelp av små disseksjon saks, lage små snitt i overhuden lateralt fra der LG skal plasseres.
- Bruk pinsett, trekke åpne epidermis mot øret for å eksponere LG.
- Bruk pinsett til å forsiktig løsne LG fra omkringliggende vev.
- Når LG frigjøres fra omkringliggende vev, forsiktig fjerne LG ved kanalen,ved å gripe hvor kanalen og epitel som omgir øyet kobler (figur 1).
- Plasser LGS i RNA lysisbuffer for RT-PCR, eller fikse med 4% PFA i 20 min for farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LG utvikler gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese. Lysfelt bilder av embryonale LGS dissekert på e14, e15, e16, e17, og P2 illustrerer denne hendelsen.
Figur 1. LG utvikler gjennom prosessen med epitel forgrening morphogenesis. Lysfelt bilder av embryonale LGS fersk dissekert på e14, e15, e16, e17 og P2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Legg merke til at etter hvert som de epitel øker i størrelse, mengden av mesenchyme avtar. De eksperimentelle trinn for mikrodisseksjon av de embryoniske LGS er avbildet i figur 2.
Figur 2. Skjematisk av trinnene involvert i LG mikrodisseksjon fra museembryoer. Skjematisk fremstilling av disseksjon og fjerning av LG fra embryonale musen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For LG kultur vi rutinemessig benytter e16 embryoer på grunn av konsistens i ex vivo vekst. Som vist i figur 3, LG i ex vivo dyrkningsbetingelser utvikle seg på en lignende måte som den in vivo-kjertel (sammenlign figur 1).
Figur 3. Exvivo kultur e16 LGS rekapitulerer in vivo morphogenesis. e16 LGS ble avledet fra Pax6-Cre, GFP embryoer, der GFP er uttrykt ved epitel. Påfølgende fluorescerende bildene ble tatt av denne singelen kjertel på 0, 3, 6, 12, 24 og 48 timer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Her benyttet vi Pax6-Cre, GFP (også kalt Le-Cre 5) embryoer å markere epitelceller, tillater oss å ta påfølgende fluorescerende bilder av forgrening epitel over 48 timers kultur periode. Mus husing av Pax6-Cre, GFP transgenet kan fås fra JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr men er ikke nødvendig for kjertel disseksjon og kultur.
Kulturer eller fersk dissekert LG kan da være løst for immunofluorescent analyse. Figur 4 shows visualisering av 4 cellulære avdelinger, mesenchyme, epitel (EpCAM), nerver (Tubb3) og blodkar (PECAM), i et e16 LG fra en villtype (CD1) embryo.
Figur 4. LG er sammensatt av flere celletyper, inkludert epitel, neuronal og endotelceller. E16 LG ble immunostained for epitelceller (EpCAM, grønn), nevroner (Tubb3, rød) og endotelceller (PECAM, cyan). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For fersk dissekert vev er det enklere å først legge LG i laminin, som på kultur, slik som å immobilisere kjertelen for fiksering og videre bearbeiding. Figur 5 viser en skjematiskfor disseksjon av barsel / voksen LG.
Figur 5. Skjematisk av trinnene involvert i LG mikrodisseksjon fra post-natal og voksne mus. Skjematisk fremstilling av disseksjon og fjerning av LG fra enten post-natal eller voksen mus. En Pax6-Cre, GFP postnatal dag 30 mus ble brukt til å visualisere posisjonen til LG og tilhørende kanal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Posisjonen til den post-natal / voksen LG har blitt visualisert ved hjelp av Pax6-Cre, GFP mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allsidigheten til kultur og manipulere LG ex vivo gir betydelige fordeler for å studere dens utvikling. Dette inkluderer hastigheten som forskeren er i stand til å teste hypoteser og mangfoldet av forstyrrelser som kan utføres for å vurdere hvordan epitel, nevronale, endothelial og mesencyhmal celler samhandler for å danne organ. Det er imidlertid en rekke begrensninger når utnytte denne modellen. Først, i kraft av sin isolasjon kjertelen ikke lenger er koblet til den perifere vaskulatur eller nervesystemet, som kan påvirke de signalveier som testes om de fungerer sammen med signaler som leveres av nerver eller blodkar 9,10. For det andre kan de omkringliggende ikke-LG vev tilveie faktorer som regulerer utviklingen 4 LG. For å unngå denne andre ikke-mesenchymale vevskomponenter må fjernes før kulturen. Tredje, i dag er vi ikke i stand til å gi de nødvendige betingelsene for fullstendig cytodifferentiation til en fullt funksjonell vev. Dette er tilfellet for alle organer dyrket ex vivo og er sannsynligvis på grunn av flere grunner, inkludert fraværet av funksjonelle blodkar og nerver og / eller mekaniske krefter fra omkringliggende vev. Til tross for disse begrensningene, har mekanismer oppdaget i ex vivo kultur vist seg å være rekapitulert i senere in vivo eksperimenter, noe som gjør dette til en robust system for å teste nye hypoteser 8,11.
Det har blitt vist at utviklingsmessige og regenererende trasé vesentlig overlapper hverandre, noe som indikerer at den ex vivo-kultur-system kan også anvendes for å studere organ 12 regenerering. Selv om vi ikke har vist dette aspektet vi her, og andre, som tidligere har vist den embryoniske spyttkjertel kan brukes til å modellere effektene av terapeutisk stråling på organskade og 13 regenerering. Fremtidige studier er nødvendig for å undersøke bruk av LG ex vivo-system somen modell for vev gjenfødelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke finansiering fra UCSF Ressurs Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
