Manipulando o Murino lacrimais Gland

Summary

A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.

Abstract

A glândula lacrimal (LG) segrega lágrimas aquosas necessárias para a manutenção da estrutura e função da córnea, um tecido transparente essencial para a visão. No ser humano uma única LG reside na órbita acima da extremidade lateral de cada olho entregar lágrimas para a superfície ocular através de 3-5 condutas. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal exorbital (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido. Semelhante a outros órgãos glandulares, o LG desenvolve através do processo de epitelial morfogénese de ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensada é submetido a vários ciclos de gema e formação adesiva para formar uma intrincada rede interligada de ácinos secretora e condutas. Este processo elaborado tem sido bem documentado em muitos outros órgãos epiteliais, tais como o pâncreas e glândulas salivares. No entanto, a LG tem sido muito menos explorado e os mecanismos que controlam a morfogênese são mal sobse levantou. Suspeitamos que essa sub-representação como um sistema modelo é uma conseqüência das dificuldades associadas com a descoberta, dissecando e cultivando a LG. Assim, aqui descrevemos técnicas de dissecação para a colheita embrionário e pós-natal LG e métodos para a ex vivo da cultura do tecido.

Introduction

A glândula lacrimal (LG) é responsável pela secreção de lágrima aquosa crítica para a acuidade visual e a saúde, a manutenção e a protecção das células da superfície ocular. LG resultados disfunção em um dos distúrbios oculares mais comuns e debilitantes: doença de olho seco deficiente aquosa, o qual é caracterizado por irritação ocular, sensibilidade à luz e ^uma visão diminuída. No ser humano o LG reside na órbita acima da extremidade lateral do olho onde 3-5 excretores lágrimas condutas de depósito sobre a superfície ocular. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido (exorbital) com lágrimas que viajam para o olho através de um único canal excretor. Semelhante a outros órgãos glandulares, a LG desenvolve através do processo de morfogênese epitelial ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensado passa por várias rodadas de broto e formação de duto para asou uma intrincada rede interligada de ácinos e ductos de secreção (Figura 1) ^2. Durante o desenvolvimento do epitélio torna-se vascularizado, bem como fortemente inervados por nervos parassimpáticos do gânglio pterigopalatina e, em menor grau pelos nervos simpáticos do gânglio cervical superior ^3. As interacções entre as células de cada um destes tipos de células neuronais ou seja, epiteliais, endoteliais e mesenquimais, são essenciais para a função e manutenção do tecido adulto. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes coordenação LG desenvolvimento e regeneração, bem como a forma como tipo de comunicação inter-celular orienta esses processos ainda não está claro.

O advento das embrionárias ex vivo técnicas de cultura permitiu a identificação de vias de desenvolvimento e regeneração em vários órgãos de ramificação ^4. A cultura ex vivo dá o pesquisador a capacidade de manipular o órgão (memecânica, química ou genética) sob condições definidas, bem como para caracterizar o desenvolvimento de órgãos e as interacções célula-célula em tempo real. A LG exorbital do mouse é altamente favorável a esta técnica e estudos recentes têm definido sistemas que regulam seu desenvolvimento ^2,5 sinalização. No entanto, apesar da necessidade de entender sinais moleculares subjacentes LG desenvolvimento e regeneração, que atualmente permanece pouco estudado, provavelmente devido às dificuldades técnicas de isolamento do órgão. Neste artigo, descrevemos como isolar e executar ex vivo da cultura do embrionário murino LG para definir programas de desenvolvimento.

Protocol

Todo o trabalho animal foi realizada sob estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Califórnia, em San Francisco.

1. embrionárias de camundongos lacrimais Glândulas (LG): Colheita e Microdissection

1. Seguindo os procedimentos aprovados pelos Animais institucionais para a comissão de Ética de Pesquisa Científica, eutanásia cronometrado CD-1 (ou transgênicos) fêmeas grávidas com o aumento da inalação de CO _2, seguido de confirmação por deslocamento cervical para colheita de embriões no dia embrionário adequado. Designar o dia da vaginal e0 ficha descoberta.
   Nota: glândulas lacrimais (LGS) podem ser colhidas a partir da e14 único broto fase em diante. No entanto, e16 (5-10 gomos) embriões dar os resultados mais consistentes para ex vivo da cultura.
2. Esterilizar a vlado entral do mouse usando etanol 70%. Aperte a pele e fazer uma incisão na linha média com tesouras cirúrgicas estéreis; cortar através da pele e do peritoneu para expor a cavidade abdominal. Retirar as duas trompas uterinas por corte ao longo da mesométrio no topo de cada trompa uterina e em lugar frio PBS (Tampão fosfato salino) ou meio DMEM F12 suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
3. Utilizando uma pinça (# 5), remova os embriões dos sacos amniótico e coloque em uma segunda placa de Petri estéril contendo PBS frio. Tenha cuidado para não tocar os olhos ou a área da cabeça.
4. Coloque embrião em um microscópio de dissecação com uma base de transiluminação. Se o embrião é <e17, execute os passos 1,5-1,7. Se os embriões são> e17, estes passos podem ser úteis, mas não são essenciais, portanto, siga para o passo 1.8.
5. Cortar a cabeça do tronco imediatamente abaixo da mandíbula inferior (passo 1, Figura 2) usinga bisturi estéril (# 10 lâmina). Gire a cabeça para que a mandíbula está agora na placa de dissecação. Use uma pinça para estabilizar a cabeça e um bisturi para remover cerca de ¼ do lado dorsal do cérebro (passo 2, ^1º corte, Figura 2) - isto é especialmente importante uma vez que a cartilagem endurece em torno e15.
6. Orientar a cabeça para que o bisturi pode furar o nariz entre os olhos. Fazer um corte através do centro da cabeça, de modo que os olhos estão agora em metades separadas (etapa 2, 2 ^nd corte, Figura 2).
7. Usando dois # 5 fórceps, tomar a metade da cabeça e retire o excesso de tecido (veja o passo 3, Figura 2). Certifique-se de orientar a cabeça para que a LG (localizado no canto inferior posterior do olho) não está perdido neste processo de remoção. Remover o excesso cerebral, cartilagem e tecido circundante nasal e abaixo do olho. Uma vez que a glândula é pouco visível neste momento, garantir o olho está devidamente orientado após o excesso de tecido remoção to evitar perder a localização da LG.
8. Cuidadosamente agarrar a pele do posterior, canto inferior do olho com as duas pinças. Retire a pele puxando cuidadosamente aberta com a pinça para expor a LG. Use iluminação adicional acima e abaixo do tecido para ajudar a visualizar o LG.
   Nota: A LG, distinguível por sua aparência como um botão em um duto dentro, um mesênquima condensado mais escuro, deve ser visível neste momento.
9. Cuidadosamente começam a dissecar a LG e mesênquima associado (veja o esquema e imagens) de distância do tecido circundante usando uma pinça, tomando cuidado para não pegar a LG ou a sua conduta de associado. Uma vez que a glândula está livre a partir do tecido circundante, remover cuidadosamente toda a glândula agarrando o epitélio circundante do olho na base da conduta de LG. Ter o cuidado de preservar a mesênquima em torno do epitélio, o que pode ser observado como um mesênquima condensada em que os invagina epitélio.
   NOTA: Algumas remoção adicional de tissue (quaisquer pequenos fragmentos de osso, músculo e tecido conjuntivo) pode ser necessário para evitar factores de sinalização / crescimento do tecido vizinho.
10. Para a cultura, a colheita 4-5 glândulas e mesênquima associado por placa (GL são banhados imediatamente após a dissecção); recolher um mínimo de 14 glândulas por 100 ul de tampão de lise de ARN para RT-PCR ^6.

2. preparar as placas para Ex Cultura vivo

Este procedimento é baseado no sistema utilizado para o desenvolvimento da glândula salivar ^7,8.

1. Adicionar 200 ul de DMEM F12 (suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina), meios de cultura com 50 ug / ml de ácido ascórbico e 50 ug / mL de holo-transferrina a um micropoço 50 milímetros de diâmetro prato de vidro de fundo ^7.
   Nota: DMEM F12 foi escolhido como nós anteriormente achei que maximizar morfogênese na glândula salivar embrionário.
2. Flutuar um polycarb 13 milímetrosfiltro de membrana onate com 0,1 mm poros no topo da mídia.
3. Passo opcional: Diluir 3-D laminina 1: 1 com DMEM / F12 para fazer uma concentração final de 3 mg / ml (200 ul usar pipeta para misturar suavemente; centrifugar durante 1 min, se aparecerem bolhas). Adicionar 15 ul desta diluída laminina 3-D para filtrar.
   Nota: Esta diluição foi encontrado para ser óptima para a manutenção da LG no seu estado 3D sem comprometer a ramificação do epitélio. No entanto, não é essencial para a cultura de LG.
4. Colocar 4-5 LG para um filtro ou em laminina. Cultura GL ex vivo para 24-48 hr (Figura 3) ou fixar com PFA a 4% durante 20 min, para posterior análise por qPCR ou imunocoloração (Figura 4). Para a análise de qPCR de tecido glandular embrionário, consulte Rebustini et al., 2011. Para a análise de imunofluorescência de tecidos glandulares embrionárias, por favor consulte as seguintes citações: Hoffman et al, (2002) e Steinberg e.t al., (2005).

3. Rato pós-natal e Adultos lacrimais Glândulas (LG): Dissection

1. Euthanize o mouse pós-natal de acordo com os padrões adequados da comissão ética animal. Para filhotes pós-natais dia 8 ou mais jovens, eutanásia, cortando a cabeça com uma tesoura esterilizada. Para o dia pós-natal 8 anos ou mais, spray de pele com etanol 70%.
2. Para localizar a LG, coloque o mouse laterais lado sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Nota: O LG pós-natal e adulto estão cercados pela artéria carótida, o músculo masseter e da derme (ver Figura 5).
3. Com uma tesoura pequena de dissecação, fazer pequena incisão na epiderme lateralmente de onde a LG deve ser localizado.
4. Utilizando uma pinça, abra a epiderme em direção à orelha para expor a LG.
5. Use uma pinça para soltar suavemente LG do tecido circundante.
6. Uma vez que a LG é liberado do tecido circundante, retire cuidadosamente a LG pelo duto,por onde agarrar a conduta e o epitélio circundante do olho conectar (Figura 1).
7. Colocar GL em tampão de lise de ARN para RT-PCR, ou fixar com PFA a 4% durante 20 min para imunocoloração.

Representative Results

O LG desenvolve através do processo de ramificação epitelial morfogénese. Imagens de campo claro de GL embrionárias dissecados em e14, e15, e16, e17, e P2 ilustrar este evento.

Figura 1. A LG desenvolve através do processo de ramificação morfogênese epitelial. Imagens de campo claro de GL embrionárias recentemente dissecados em e14, e15, e16, e17 e P2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Note-se que à medida que aumenta o tamanho do epitélio da, a quantidade de mesênquima diminui. Os passos experimentais para microdissecação dos GL embrionárias estão representados na Figura 2.

Figura 2. Esquema de etapas envolvidas na LG microdissection de embriões de camundongos. Diagrama esquemático da dissecção e remoção da LG do rato embrionário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para LG cultura que rotineiramente utilizam embriões e16, devido à consistência na ex vivo crescimento. Como mostrado na Figura 3, LG, em condições de cultura ex vivo desenvolver de uma maneira semelhante à glândula in vivo (comparar com a Figura 1).

Figura 3. Exvivo cultura de e16 GL recapitula na morfogénese in vivo. GL e16 foram derivadas de Pax6-Cre, embriões GFP, onde é expressa a GFP pelo epitélio. Imagens fluorescentes consecutivas foram tiradas deste single glândula em 0, 3, 6, 12, 24 e 48 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui nós empregada embriões Pax6-Cre, GFP (também chamado Le ^Cre-5) para destacar as células epiteliais, o que nos permite captar imagens fluorescentes consecutivas do epitélio ramificação durante o período de cultura de 48 h. Os ratinhos portadores da Pax6-Cre, transgene GFP pode ser obtido a partir de JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr mas não são necessárias para a dissecção da glândula e cultura.

Culturas ou recém dissecadas LG pode, então, ser fixado para a análise de imunofluorescência. Figura 4 scomos a visualização das quatro compartimentos celulares, mesênquima, epitélio (EpCAM), nervos (Tubb3) e vasos sanguíneos (PECAM), em um e16 LG a partir de um embrião de tipo selvagem (CD1).

Figura 4. A LG é composta por vários tipos de células, incluindo epitélio, células neuronais e endoteliais. E16 LG foi histoquímica para células epiteliais (EpCam, verde), neurônios (Tubb3, vermelho) e células endoteliais (PECAM, ciano). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para o tecido dissecado de fresco é mais fácil de incorporar o primeiro LG em laminina, como feito para a cultura, de modo a imobilizar a glândula para fixação e manuseamento subsequente. A Figura 5 mostra um diagrama esquemáticopara dissecção da pós-natal / adulto LG.

Figura 5. Esquema de etapas envolvidas na LG microdissection de rato pós-natal e adulto. Diagrama esquemático da dissecção e remoção da LG a partir do mouse ou pós-natal ou adultos. A Pax6-Cre, GFP pós-natal dia 30 de rato foi usado para visualizar a posição do LG e do duto associado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A posição do pós-natal / adulto LG foi visualizada usando a Pax6-Cre, rato GFP.

Discussion

A versatilidade de cultura e manipular o LG ex vivo proporciona vantagens significativas para estudar o seu desenvolvimento. Isto inclui a velocidade a que o pesquisador é capaz de testar hipóteses e a multiplicidade de perturbações que podem ser realizados para avaliar a forma como epitelial, neuronais, células endoteliais e mesencyhmal interagem para formar o órgão. No entanto, há um número de advertências para a utilização deste modelo. Em primeiro lugar, em virtude de seu isolamento a glândula não está mais ligado ao sistema vascular periférico ou do sistema nervoso, que pode afetar as vias de sinalização que está sendo testado, se eles trabalham em conjunto com os sinais emitidos pelos nervos ou vasos sanguíneos ^9,10. Em segundo lugar, os tecidos não-LG circundantes podem fornecer fatores que regulam a LG desenvolvimento ^4. Para evitar esta outros componentes do tecido não-mesenquimais deve ser removido antes da cultura. Em terceiro lugar, no presente, não são capazes de fornecer as condições necessárias para cytodifferent completoiation em um tecido totalmente funcional. Este é o caso para todos os órgãos cultivadas ex vivo e é provavelmente devido a vários motivos, incluindo a ausência de vasos sanguíneos funcionais e nervos e / ou forças mecânicas dos tecidos circunvizinhos. Apesar dessas ressalvas, os mecanismos descobertos em cultura ex vivo demonstraram a ser recapitulada em subseqüente em experimentos in vivo, tornando este um sistema robusto para testar novas hipóteses ^8,11.

Tem sido demonstrado que as vias de desenvolvimento e regeneração sobrepõem-se significativamente, indicando que o sistema de cultura ex vivo também pode ser utilizada para estudar a regeneração de órgãos ^12. Apesar de não ter demonstrado esse aspecto aqui estamos, e outros, têm mostrado anteriormente glândula salivar embrionárias podem ser usadas para modelar os efeitos da radiação terapêutica sobre danos a órgãos e regeneração ^13. Futuros estudos são necessários para explorar o uso do sistema ex vivo LG comoum modelo para a regeneração do tecido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x			Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.