Summary
Слезной железы (LG) представляет собой ветвящийся орган, который производит водные компоненты слез, необходимых для поддержания зрение и глазное здоровье. Здесь мы опишем мышиный LG рассечение и Экс естественных методов культуры расшифровать путей, вовлеченных в развитие LG сигнализации.
Abstract
Слезной железы (LG) выделяет водные слезы, необходимые для поддержания структуры и функции роговицы, прозрачного ткани необходим для зрения. В человеке один LG находится в орбите над боковой конце каждого глаза доставки слезы на поверхности глаза через 3 - 5 каналов. Мышь имеет три пары основных глазных желез, наиболее изученным из которых является exorbital слезной железы (LG) расположен передний и вентральный к уху. Как и в других железистых органов, LG развивается через процесс эпителиального морфогенеза ветвления, в которой один эпителиальных почка в пределах уплотненной мезенхимы претерпевает несколько раундов зародыше и формирования канала, чтобы сформировать сложную взаимосвязанную сеть секреторной ацинусов и протоков. Это сложный процесс, были хорошо документированы во многих других эпителиальных органов, таких как поджелудочная железа и слюнной железы. Тем не менее, LG была гораздо менее изучены и механизмы, контролирующие морфогенез плохо подстоял. Мы подозреваем, что это недостаточная представленность в качестве модельной системы является следствием трудностей, связанных с поиском, рассекая и культивирование LG. Таким образом, здесь мы опишем методы рассечение для уборки эмбрионального и послеродового LG и методы для экс естественных культуры ткани.
Introduction
Слезной железы (LG) отвечает за водный секреции слезной критической для остроты зрения и здоровья, обслуживания и защиты клеток глазной поверхности. LG дисфункция приводит к одной из самых распространенных и изнурительных заболеваний глаз: болезни водный дефицит сухого глаза, который характеризуется раздражения глаз, чувствительность к свету и снижение зрения 1. В человеке LG находится в орбите выше боковой концу глаза, где 3 - 5 выводные протоки депозитные слезы на поверхности глаза. Мышь имеет три пары основных глазных желез, наиболее изученным из которых является слезной железы (LG) расположен передний и вентральный к уху (exorbital) со слезами, направляющимся в глаза через один выводной проток. Как и в других железистых органов, LG развивается через процесс эпителиального морфогенеза ветвления, в которой один эпителиальных почка в пределах уплотненной мезенхимы претерпевает несколько раундов зародыше и образование воздуховода длям сложную взаимосвязанную сеть секреторной ацинусов и протоков (рис 1) 2. В процессе разработки эпителий становится васкуляризации, а также в большой степени иннервируют парасимпатических нервов крылонебной ганглия и в меньшей степени по симпатических нервов от верхнего шейного ганглия 3. Взаимодействия между каждой из этих ячеек типа т.е. нервных, эпителиальных, эндотелиальных и мезенхимальных клеток, имеют важное значение для функционирования и поддержания взрослой ткани. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы, координирующие развитие LG и регенерации, а также, как тип межсотовые связи направляет эти процессы, остается неясным.
Появление эмбриональных Экс естественных методов культивирования позволило выявить развития и регенеративных путей в нескольких ветвящихся органов 4. Культивирование экс естественных дает исследователю возможность манипулировать орган (меняническое, генетическая или химического) при определенных условиях, а также для характеристики развития органов и межклеточных взаимодействий в реальном масштабе времени. Exorbital LG мыши является наиболее подходящей для этой техники и недавние исследования определяется систем, которые регулируют его развитие 2,5 сигнализации. Однако, несмотря на необходимость, чтобы понять молекулярные сигналы, лежащие в основе развития LG и регенерации, в настоящее время он остается недостаточно изученной, скорее всего, из-за технических трудностей в изоляции орган. В этой статье мы расскажем, как изолировать и выполнять Экс естественных культуру эмбриональных мышиных LG определить программ развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все для животных Работа выполнена в рамках строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был одобрен уходу и использованию комитета за животными (IACUC) из Университета Калифорнии, Сан-Франциско.
1. мышиных эмбриональных слезных желез (LG): Сбор и микродиссекция
- После процедуры одобрены Институциональные животных в комитете Научно-исследовательский этики, усыпить приурочен беременных CD-1 (или трансгенных) самок с ростом CO 2 ингаляции с последующим подтверждением смещением шейных позвонков к эмбрионов урожая на соответствующем эмбрионального дня. Назначить день вагинального e0 открытия плагина.
Примечание: слезных желез (LGS) могут быть собраны из E14 один бутон этапе и далее. Тем не менее, E16 (5 - 10 бутонов) эмбрионы дать наиболее достоверные результаты для экс естественных культуры. - Стерилизовать стЕНТРАЛЬНАЯ стороне мыши с помощью 70% этанола. Зажмите кожу и сделать надрез на средней линии с стерильных хирургических ножниц; прорезать кожу и брюшины, чтобы разоблачить брюшной полости. Удалите 2 рога матки путем разрезания вдоль mesometrium в верхней части каждого рога матки и место в холодном PBS (фосфатно-солевой буфер) или DMEM F12 среде с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Использование щипцов (# 5), удалить эмбрионов из амниотической мешочков и помещают во вторую стерильную чашку Петри, содержащую холодный PBS. Будьте осторожны, чтобы не коснуться глаза или голова область.
- Поместите эмбрион на вскрытии микроскопом с просвечивания основания. Если эмбрион <e17, выполните шаги 1,5 - 1,7. Если эмбрионы> e17, эти шаги могут быть полезны, но не являются существенными, поэтому перейдите к шагу 1.8.
- Отрежьте голову от туловища чуть ниже нижней челюсти (шаг 1, рисунок 2) USINга стерильный скальпель (# 10 лезвие). Поверните голову так, чтобы нижняя челюсть находится сейчас на вскрытии пластины. Используйте пинцет, чтобы стабилизировать голову и скальпель для удаления около ¼ спинной стороне мозга (шаг 2, 1-й вырезом, Рисунок 2) - это особенно важно когда хрящ застывает вокруг e15.
- Расположите головку так, что скальпель может проколоть нос между глазами. Сделайте надрез через центр головы, так что глаза сейчас на отдельных половинок (шаг 2, 2 нарезанных й, Рисунок 2).
- Использование двух # 5 щипцы, взять одну половину головы и удалить лишнюю ткань (см шаг 3, рисунок 2). Будьте уверены, чтобы ориентировать голову так, LG (расположен в нижней задней углу глаза) не теряется в этом процессе удаления. Удалите излишки мозговой, хрящи и носовые ткани, окружающие и ниже глаз. Поскольку железы едва виден в этот момент, обеспечить глаз в правильной ориентации после удаления избытка ткани то не потерять расположение LG.
- Осторожно захватить кожу от задней, нижней угла глаза с обеих щипцов. Снимите кожу, осторожно потянув открыт с пинцетом, чтобы разоблачить LG. Используйте дополнительное освещение выше и ниже ткани, чтобы помочь визуализировать LG.
Примечание: LG, выделялся своей внешностью, как бутон на воздуховод в более темный, уплотненной мезенхимы, должны быть видны в этой точке. - Осторожно начинают рассекать LG и связанного мезенхиму (см диаграмму и изображения) от окружающих тканей с помощью щипцов, стараясь не захватить LG или связанный с ним канал. После железа от окружающей ткани свободно, осторожно удалить всю железу путем захвата эпителий, окружающие глаз у основания канала LG. Позаботьтесь, чтобы сохранить мезенхиму окружающий эпителий, который можно наблюдать в виде уплотненной мезенхимы в которых эпителий инвагинирует.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые дополнительные удаление Tissuе (любые мелкие фрагменты костей, мышц и соединительной ткани) может быть необходимо, чтобы избежать сигнализации факторы / роста из соседних тканей. - Для культуры, урожай 4 - 5 желез и связанный мезенхимы за тарелку (ОМС высевают сразу же после вскрытия); собрать минимум 14 желез на 100 мкл буфера для лизиса РНК для ОТ-ПЦР 6.
2. Подготовьте Тарелки для Ex Vivo культуры
Эта процедура основана на том, что используются для развивающегося слюнной железы 7,8.
- Добавить 200 мкл DMEM F12, дополненной (100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) культуральной среде с 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 50 мкг / мл трансферрина голо-к прозрачным дном диаметром 50 мм микролуночным блюдо 7.
Примечание: DMEM F12 был выбран, как мы ранее обнаружили, что он максимально морфогенез в эмбриональном слюнной железы. - Поплавок 13 мм polycarbOnate мембранный фильтр с порами 0,1 мкм на верхней части массовой информации.
- Дополнительный этап Развести 3-D Ламинин 1: 1 с DMEM / F12, чтобы получить конечную концентрацию 3 мг / мл (использовать 200 мкл пипетки осторожно перемешать; центрифуги в течение 1 мин, если появляются пузырьки). Добавить 15 мкл этого разбавляют 3-D ламинином фильтровать.
Примечание: Это разбавление было установлено, что оптимальным для поддержания LG в своем 3D состоянии без ущерба эпителиальных разветвление. Тем не менее, это не является необходимым для культуры LG. - Поместите 4 - 5 LG на фильтре или в ламинином. Культура ОМС экс естественных для 24 - 48 часов (рисунок 3) или исправить с 4% PFA в течение 20 мин для дальнейшего анализа по кПЦР или иммуноокрашивания (рисунок 4). Для КПЦР анализа эмбрионального железистой ткани, пожалуйста, обратитесь к Rebustini др., 2011. Для иммунофлуоресцентным анализа эмбриональных железистой ткани, пожалуйста, обратитесь к следующим цитатам: Хоффман и др, (2002) и Steinberg е.т др., (2005).
3. Мышь Послеродовая и взрослых слезных желез (LG): Вскрытие
- Усыпить послеродовой мышь в соответствии со стандартами соответствующий комитет по этике животного. Для послеродовых щенков день 8 или более молодых, усыпить путем разделения на голову стерильными ножницами. Для послеродового день 8 лет и старше, спрей мех с 70% этанола.
- Чтобы найти LG, лежал мыши боковой стороне под микроскопом рассекает с подсветкой сверху. Примечание: послеродовой и взрослых LG окаймлены сонной артерии, жевательные мышцы и дермы (рисунок 5).
- Использование малых ножницы рассечение, делают небольшой разрез в эпидермисе, где в боковом направлении от LG должны быть расположены.
- Использование щипцов, выдвиньте эпидермис к уху, чтобы разоблачить LG.
- Используйте пинцет, чтобы аккуратно ослабьте LG от окружающей ткани.
- После того, как LG освобождается от окружающих тканей, осторожно удалите LG по воздуховоду,взявшись где воздуховод и эпителий, окружающий глаз подключения (рисунок 1).
- Поместите ЛГС в буфере для лизиса РНК для ОТ-ПЦР, или закрепить с 4% PFA в течение 20 мин для иммунным окрашиванием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LG разрабатывает в процессе эпителиального морфогенеза ветвления. Светлое образы эмбриональных МСУ расчлененный на e14, e15, e16, e17, и Р2 иллюстрируют это событие.
Рисунок 1. LG разрабатывает в процессе эпителиальные разветвления морфогенез. Светлое образы эмбриональных МСУ недавно расчлененный на E14, E15, E16, E17 и P2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Следует отметить, что, как эпителия увеличивается в размерах, количество мезенхимы уменьшается. Экспериментальные шаги для микродиссекции эмбриональных МСУ изображены на рисунке 2.
Рисунок 2. Схема этапов в LG микродиссекции из мышиных эмбрионов. Принципиальная схема вскрытия и снятия LG от эмбрионального мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Для LG культуры мы постоянно использовать E16 эмбрионов из-за консистенции в экс естественных роста. Как показано на рисунке 3, в LG экс виво условия культивирования разработать таким же образом, к в естественных железы (по сравнению с фиг.1).
Рисунок 3. Примерестественных культура e16 МСУ повторяет в естественных условиях формообразования. E16 ОМС были получены из Рах6-Cre, эмбрионов GFP, где GFP выражается эпителия. Последовательные флуоресцентные изображения были взяты из этой одной железы на 0, 3, 6, 12, 24, и 48 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Здесь мы использовали Pax6-Cre, GFP (также называемый Le-Cre 5) эмбрионов, чтобы выделить эпителиальные клетки, что позволяет нам принимать последовательные флуоресцентные изображения разветвления эпителия в период культуры 48 ч. Мыши, несущие Рах6-Cre, GFP трансгена может быть получена из JAX: Tg (Рах6-Cre, GFP) 1Pgr но не являются необходимыми для железы рассечение и культуры.
Культуры или недавно расчлененный LG могут быть установлены для анализа иммунофлуоресцентным. Рисунок 4 схау визуализацию 4 сотовых отсеков, мезенхимы, эпителия (EpCAM), нервов (Tubb3) и кровеносных сосудов (PECAM), в качестве e16 LG от дикого типа (CD1) эмбриона.
Рисунок 4. В LG состоит из нескольких типов клеток, включая эпителиальные, нейронов и эндотелиальных клеток. E16 LG был иммунному окрашиванию для эпителиальных клеток (ЕрСАМ, зеленый), нейронов (Tubb3, красный) и эндотелиальных клеток (РЕСАМ, голубой). Пожалуйста, нажмите здесь Чтобы смотреть большую версию этого рисунка.
Для свеже расчлененный ткани легче встроить в первую LG в ламинин, как это было сделано для культуры, так как для иммобилизации железу для фиксации и последующей обработки. На рис 5 показана схемадля рассечения послеродовом / взрослый LG.
Рисунок 5. Схема этапов в LG микродиссекции от послеродовой и взрослой мыши. Принципиальная схема вскрытия и снятия LG от либо послеродовой или взрослой мыши. Рах6-Cre, GFP послеродовой день 30 мышь используется для визуализации положения LG и связанного канала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Положение послеродовой / взрослый LG был визуализируется с помощью Рах6-Cre, GFP мышь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Универсальность культуры и манипулировать LG экс естественных обеспечивает значительные преимущества для изучения его развитие. Это включает в себя скорость, с которой исследователь способен проверять гипотезы и множество возмущений, которые могут быть выполнены, чтобы оценить, как эпителиальных, нейронов, эндотелия и mesencyhmal клетки взаимодействуют, чтобы сформировать орган. Тем не менее, есть ряд оговорок при использовании этой модели. не первый, в силу своей изолированности железы больше не подключен к периферийному сосудистой или нервной системы, которые могут повлиять на сигнальные пути, проходит испытания, если они работают в сочетании с сигналами, поставляемых нервов или кровеносных сосудов 9,10. Во-вторых, окружающие не-LG ткани могут обеспечить факторы, которые регулируют развитие LG 4. Чтобы избежать этого другие компоненты не-мезенхимальных тканей должны быть удалены до культуры. В-третьих, в настоящее время мы не в состоянии обеспечить условия, необходимые для полного cytodifferentтельная в полнофункциональный ткани. Это тот случай, для всех органов культивируемых экс виво и, вероятно, из-за нескольких причин, в том числе отсутствие функциональных кровеносных сосудов и нервов и / или механических сил из окружающих тканей. Несмотря на эти предостережения, механизмы, обнаруженные в экс естественных культуры показали быть обобщены в последующем в естественных экспериментов, делая это надежную систему для тестирования новых гипотез 8,11.
Было показано, что с развитием и регенеративные путей значительно перекрываются, указывая, что экс виво Система культура также может быть использован для изучения регенерации органов 12. Хотя мы не доказали, этот аспект здесь мы, и другие, ранее показали эмбриональных слюнных желез могут быть использованы для моделирования последствий терапевтической радиации на повреждения органов и регенерации 13. Будущие исследования необходимы, чтобы изучить возможность использования в LG экс естественных системемодель для регенерации тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность финансирование предусмотренных программой распределения UCSF ресурсов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
