Summary
Tårkörteln (LG) är en förgrenings organ som producerar de vattenbaserade komponenter i tårar som krävs för att upprätthålla syn och ögonhälsa. Här beskriver vi mus LG dissektion och ex vivo odlingstekniker för att dechiffrera signalvägar involverade i LG utveckling.
Abstract
Tårkörteln (LG) utsöndrar vatten tårar som krävs för att upprätthålla struktur och funktion på hornhinnan, en transparent vävnad viktigt för vision. I människan en enda LG ligger i omloppsbana ovanför sidoänden av varje öga levererar tårar till den okulära ytan genom 3 - 5 kanaler. Musen har tre par stora okulära körtlar, den mest studerade av dessa är exorbital tårkörteln (LG) belägna främre och ventrala till örat. I likhet med andra körtel organ, LG utvecklas genom processen att epitel förgrening morfogenes i vilka en epitelial knopp i en kondenserad mesenkymet genomgår flera omgångar av linda och kanalbildning för att bilda ett intrikat sammankopplat nätverk av sekretorisk acini och kanaler. Denna genomarbetade process har dokumenterats väl i många andra epiteliala organ såsom bukspottkörteln och spottkörteln. Däremot har LG varit betydligt mindre utforskade och de mekanismer som styr morphogenesis är dåligt istod. Vi misstänker att detta underrepresentation som modellsystem är en följd av de svårigheter som är förknippade med att hitta, dissekera och odling av LG. Alltså, här beskriver vi dissektion tekniker för skörd embryonala och postnatal LG och metoder för ex vivo odling av vävnaden.
Introduction
Tårkörteln (LG) är ansvarig för vatten tårsekretion avgörande för synskärpa och hälsa, underhåll och skydd av cellerna i ögats yta. LG dysfunktion leder till en av de vanligaste och försvagande ögonsjukdomar: vatten bristfällig Torra ögon sjukdom, som kännetecknas av ögonirritation, ljuskänslighet och försämrad synskärpa 1. I människan LG ligger i omloppsbana ovanför sido änden av ögat där 3-5 utförsgångar inlånings tårar har laddats in i ögats yta. Musen har tre par stora okulära körtlar, den mest studerade av dessa är tårkörteln (LG) belägna främre och ventrala för örat (exorbital) med tårar som reser till ögat via en enda utskiljningskanal. I likhet med andra körtel organ, LG utvecklas genom processen att epitel förgrening morfogenes i vilka en epitelial knopp i en kondenserad mesenkymet genomgår flera omgångar av knopp och kanalbildning till förm ett intrikat sammankopplat nätverk av sekretorisk acini och kanaler (figur 1) 2. Under utvecklingen epitelet blir vaskulariserad liksom tungt innerveras av de parasympatiska nerverna i pterygopalatine ganglion och i mindre utsträckning av sympatiska nerver från den överlägsna cervikala ganglion 3. Interaktioner mellan var och en av dessa celler typer dvs neuronala, epitelceller, endotelceller och mesenkymala celler, är avgörande för funktion och underhåll av vuxen vävnad. Men de bakomliggande molekylära mekanismer samordning LG utveckling och förnyelse samt hur inter celltyp kommunikation styr dessa processer är fortfarande oklart.
Tillkomsten av embryonala ex vivo odlingstekniker har möjliggjort identifiering av utvecklingsstörningar och regenerativa vägar i flera förgrenings organ 4. Odling ex vivo ger forskaren möjlighet att manipulera orgeln (migmekanisk, genetisk eller kemisk) under definierade förhållanden och för att karakterisera utveckling orgel och cell-cell interaktioner i realtid. Den exorbital LG av musen är mycket mottaglig för denna teknik och nya studier har definierat signalsystem som reglerar dess utveckling 2,5. Trots behovet av att förstå molekylära signaler som ligger till grund LG utveckling och förnyelse, för närvarande är det fortfarande understudied, sannolikt på grund av de tekniska svårigheterna att isolera orgeln. I detta dokument beskriver vi hur du isolerar och utföra ex vivo kultur embryonala murina LG att definiera utvecklingsprogrammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur har gjorts med strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of California, San Francisco.
1. Mouse embryonala tårkörtlar (LG): Skörd och Microdissection
- Efter förfaranden som godkänts av Institutional djur för vetenskapliga forskningsetisk kommitté, euthanize tids gravida CD-1 (eller transgena) honor med stigande CO2 inhalation, följt av bekräftelse halsdislokation att skörda embryon på lämplig embryonala dag. Utse dagen av vaginal plugg upptäckt E0.
Obs: tårkörtlar (LGS) kan skördas från E14 enda knoppstadiet och framåt. Men e16 (5 - 10 knoppar) embryon ger de mest konsekventa resultat för ex vivo kultur. - Sterilisera ventral sida av musen med 70% etanol. Nyp huden och gör ett snitt vid mittlinjen med sterila kirurgiska sax; skära genom huden och peritoneum för att exponera bukhålan. Ta bort de två livmoderhornen genom att skära längs mesometrium vid toppen av varje livmoderhorn och placera i kall PBS (fosfatbuffrad saltlösning) eller DMEM F12-medium supplementerat med 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- Använd pincett (# 5), ta bort embryon från fostersäckar och placera i en andra steril petriskål med kall PBS. Var noga med att inte röra ögonen eller huvudet området.
- Placera embryo till en dissekera mikroskop med en genomlysning bas. Om embryot är <E17, utför steg från 1,5 till 1,7. Om embryon är> E17, kan dessa steg vara till hjälp, men inte nödvändigt, därför gå till steg 1,8.
- Avskilja huvudet från torson strax nedanför undernäbben (steg 1, Figur 2) A nga steril skalpell (# 10 blad). Vrid huvudet så att underkäken är nu på dissekera plattan. Använd pincett för att stabilisera huvudet och en skalpell för att avlägsna ca ¼ av ryggsidan av hjärnan (steg 2, 1 st cut, figur 2) - detta är särskilt viktigt när brosket hårdnar kring E15.
- Orientera huvudet så att skalpellen kan tränga igenom näsan mellan ögonen. Gör ett snitt genom mitten av huvudet, så att ögonen är nu på separata halvor (steg 2, 2 nd slipade, figur 2).
- Med hjälp av två # 5 pincett, ta ena halvan av huvudet och ta bort överflödig vävnad (se steg 3, figur 2). Var noga med att orientera huvudet så LG (placerad i nedre bakre hörnet av ögat) inte går förlorad i den här borttagningen. Avlägsna överskott av cerebrala, brosk, och nasal vävnad som omger och under ögat. Eftersom körteln är knappt synlig på denna punkt, se till att ögat är rätt orienterad efter överflödig vävnad borttagning to undvika att förlora platsen för LG.
- Försiktigt tag i huden från den bakre, nedre hörnet av ögat med båda pincett. Ta bort skinnet genom att försiktigt dra öppna med pincett för att exponera LG. Använd extra belysning över och under vävnaden för att visualisera LG.
Obs: LG, särskiljas genom sitt utseende som en knopp på en kanal i en mörkare, kondenserad mesenkym, bör vara synliga på denna punkt. - Börja försiktigt att dissekera LG och tillhörande mesenkymet (se bild och bilder) från den omgivande vävnaden med pincett, försiktigt så att inte greppa LG eller dess tillhörande kanal. När körteln är fri från den omgivande vävnaden, försiktigt ta bort hela körteln genom att greppa epitel kring ögat vid basen av LG kanalen. Var noga med att bevara mesenkymet omger epitel, vilket kan observeras som en kondenserad mesenkymet i vilken epitelet invaginates.
OBS! Vissa avlägsnad Tissue (alla små benfragment, muskler och bindväv) kan vara nödvändigt för att undvika signalering / tillväxtfaktorer från angränsande vävnad. - För kultur, skörd 4-5 körtlar och tillhörande mesenkymet per platta (LGs stryks omedelbart efter dissektion); samla minst 14 körtlar per 100 | il av RNA-lyseringsbuffert för RT-PCR 6.
2. Förbered Plattor för Ex vivo Kultur
Detta förfarande grundar sig på den som används för att utveckla spottkörteln 7,8.
- Addera 200 pl av DMEM F12 (kompletterat med 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) odlingsmedium med 50 | ig / ml askorbinsyra och 50 | ig / ml holo-transferrin till en glasbottnad 50 mm mikrobrunndiameter skålen 7.
Obs: DMEM F12 valdes som vi tidigare funnit det maximera morfogenesen i embryonala spottkörteln. - Float en 13 mm Polycarbonate membranfilter med 0,1 um porer ovanpå media.
- Valfritt steg: Späd 3-D laminin 1: 1 med DMEM / F12 för att göra en slutlig koncentration av 3 mg / ml (använd 200 l pipett för att försiktigt blanda, centrifugera i 1 minut, om bubblor). Tillsätt 15 pl av denna utspädda 3D-laminin att filtrera.
Not: Denna utspädning befanns vara optimal för att upprätthålla LG i sin 3D-tillstånd utan att kompromissa epitelial förgrening. Det är emellertid inte nödvändigt för odling av LG. - Placera 4-5 LG på filter eller till laminin. Kultur LGs ex vivo för 24-48 timmar (Figur 3) eller fix med 4% PFA i 20 min för vidare analys av qPCR eller immunfärgning (Figur 4). För qPCR analys av embryonal körtelvävnad, se Rebustini et al., 2011. För immunofluorescens analys av embryonala körtelvävnad, se följande citat: Hoffman et al, (2002) och Steinberg e.t al., (2005).
3. Musen Födsel och Adult tårkörtlarna (LG): Dissection
- Avliva postnatal musen enligt lämplig djuretik utskottets krav. För postnatala valpar dag 8 eller yngre, avliva genom att bryta huvudet med steril sax. För postnatal dag 8 eller äldre, spraya pälsen med 70% etanol.
- För att hitta LG, lägg musen laterala sidan upp under en dissekera mikroskop med belysning uppifrån. Obs: postnatal och vuxna LG är kantad av halspulsådern, tuggmuskel och dermis (se Figur 5).
- Med små dissektion sax, göra små snitt i överhuden sidled från där LG ska placeras.
- Använd pincett, dra öppna epidermis mot örat för att exponera LG.
- Använd pincett för att försiktigt lossa LG från omgivande vävnad.
- När LG frigörs från omgivande vävnad, försiktigt bort LG av kanalen,genom att ta tag om kanalen och epitel kring ögat ansluta (Figur 1).
- Placera LGS i RNA lysbuffert för RT-PCR, eller fäst med 4% PFA under 20 minuter för immunfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LG utvecklas genom processen epitel förgrening morfogenes. Bright bilder av embryonala LGs dissekerade vid E14, E15, e16, e17, och P2 visar denna händelse.
Figur 1. LG utvecklas genom processen epitel förgrening morfogenes. Bright bilder av embryonala LGs nyligen dissekeras på E14, E15, e16, E17 och P2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Notera att såsom epitelet ökar i storlek, mängden mesenkym minskar. De experimentella steg för microdissection av embryonala LGs visas i figur 2.
Figur 2. Schematisk av stegen i LG microdissection från musembryon. Schematisk beskrivning av dissekering och borttagning av LG från embryonala musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För LG kultur vi rutinmässigt använder E16 embryon på grund av den enhetlighet i ex vivo tillväxt. Såsom visas i figur 3, LG i ex vivo-odlingsbetingelser utvecklas på ett sätt som liknar det in vivo genomföring (jämför figur 1).
Figur 3. Exvivo kultur av e16 LGS rekapitulerar in vivo morfogenes. E16 LGS härleddes från Pax6-Cre, GFP embryon, där GFP uttrycks av epitelet. På varandra följande fluorescerande bilder togs av denna enda körtel vid 0, 3, 6, 12, 24 och 48 timmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Här anställda vi Pax6-Cre, GFP (även kallad Le-Cre 5) embryon för att markera epitelceller, vilket tillåter oss att ta i följd fluorescerande bilder av förgrenings epitel över 48 h odlingsperioden. Möss som hyser Pax6-Cre, GFP transgenen kan erhållas från JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr men är inte nödvändiga för körtel dissekering och kultur.
Kulturer eller nyligen dissekeras kan LG sedan fastställas för immunofluorescens analys. Figur 4 shows visualisering av 4 cellulära avdelningar, mesenkymet, epitel (EpCAM), nerver (Tubb3) och blodkärl (PECAM), i en e16 LG från en vild typ (CD1) embryo.
Figur 4. LG består av flera celltyper inklusive epitel, neuronal och endotelceller. E16 LG var immunostained för epitelceller (EpCAM, grönt), neuroner (Tubb3, röd) och endotelceller (PECAM, cyan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För nyligen dissekerade vävnad är det lättare att först bädda LG i laminin, som gjort för kulturen, för att immobilisera föring för fixering och efterföljande hantering. Figur 5 visar en schematiskför dissektion av den postnatala / vuxen LG.
Figur 5. Schematisk bild av stegen i LG microdissection från postnatal och vuxen mus. Schematisk beskrivning av dissekering och borttagning av LG från antingen efter förlossning eller en vuxen mus. En Pax6-Cre, GFP postnatal dag 30 mus användes för att visualisera placeringen av LG och tillhörande kanal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Placeringen av postnatal / vuxen LG har visualiseras med hjälp av Pax6-Cre, GFP mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mångsidig till kultur och manipulera LG ex vivo ger betydande fördelar för att studera dess utveckling. Detta inkluderar den hastighet med vilken forskaren har möjlighet att testa hypoteser och de många störningar som kan utföras för att bedöma hur epitelial, neuronal, endotelceller och mesencyhmal cellerna samverkar för att bilda organ. Det finns emellertid ett antal förbehåll när använder denna modell. Först på grund av sin isolering körteln inte längre är ansluten till den perifera kärlsystemet eller nervsystemet, vilket kan påverka de signalvägar som testas om de arbetar tillsammans med signaler som levereras av nerver eller blodkärl 9,10. För det andra kan de omgivande icke-LG vävnader ge faktorer som reglerar LG utveckling 4. För att undvika denna andra icke-mesenkymala vävnadskomponenter måste tas bort före kulturen. För det tredje, vi för närvarande inte har möjlighet att ge förutsättningar som krävs för fullständig cytodifferentiation till en fullt funktionell vävnad. Detta är fallet för alla organ odlade ex vivo och beror sannolikt på flera orsaker, exempelvis avsaknad av funktionella blodkärl och nerver och / eller mekaniska krafter från omgivande vävnader. Trots dessa varningar, har mekanismer som upptäckts i ex vivo odling visat att rekapituleras i efterföljande in vivo experiment, vilket gör detta till ett robust system för att testa nya hypoteser 8,11.
Det har visats att utvecklingsstörningar och regenerativa banor överlappar signifikant, vilket indikerar att ex vivo kultursystem kan också användas för att studera organregenerering 12. Även om vi inte har visat denna aspekt här är vi, och andra, har tidigare visat den embryonala spottkörteln kan användas för att modellera effekterna av terapeutisk strålning på organskada och förnyelse 13. Framtida studier behövs för att undersöka användningen av LG ex vivo-system somen modell för vävnadsregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för finansiering från UCSF Resource Allocation Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
