Summary
Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.
Abstract
Gözyaşı bezi (LG) korneanın yapısını ve işlevini, görme için gerekli şeffaf bir doku korumak için gerekli sulu gözyaşı salgılar. 5 kanallar - insanda bir tek LG 3 ile oküler yüzeye gözyaşları veren her gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunur. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu okudu kulağına exorbital gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik bir şebekenin oluşturulması için tomurcuk ve kanal formasyonu birçok kere maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. Bu ayrıntılı süreci iyi gibi pankreas ve tükürük bezi gibi diğer birçok epitelyal organlarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, LG daha az araştırılmıştır ve morfojenezini kontrol eden mekanizmalar zayıf biçimde altındadırdurdu. Biz bir model sistem olarak bu altında temsil bulma diseksiyon ve LG kültürleme ile ilişkili zorluklar bir sonucu olduğunu sanıyorum. Bu nedenle, burada diseksiyon hasat embriyonik ve doğum sonrası LG için teknikler ve doku ex vivo kültür için yöntemleri tarif eder.
Introduction
Gözyaşı bezi (LG) görme keskinliği ve sağlık, bakım ve göz yüzeyinin hücrelerinin korunması için kritik sulu gözyaşı salgılanmasından sorumludur. Batma, ışık duyarlılığı ile karakterize ve vizyonunu 1 azalır sulu eksik Kuru Göz Hastalığı: En sık ve zayıflatıcı göz bozuklukları birinde LG disfonksiyon sonuçları. İnsanda LG gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunduğu yeri 3 - oküler yüzey üzerine 5 boşaltım kanalları mevduat gözyaşları. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu çalışılan tek bir boşaltım kanalı yoluyla göze seyahat gözyaşları ile kulak (exorbital) için gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk birden tomurcuğu mermi ve talimat için oluk oluşumu maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir(Şekil 1) salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik ağ m 2. Gelişimi sırasında epitel vaskülare olur yanı olarak ağır şekilde üstün servikal ganglion 3 sempatik sinirler tarafından pterigopalatin ganglion parasempatik sinirler tarafından ve daha az bir ölçüde innerve. Türleri nöronal, epitel, endotel ve mezenkimal hücreler yani bu hücrelerin her biri arasındaki etkileşimleri, işlevi ve yetişkin doku bakımı için gereklidir. Ancak, arası hücre tipi iletişim bu süreçleri kılavuzları nasıl yanı sıra LG gelişimini ve yenilenmesini koordine yatan moleküler mekanizmalar belirsizdir.
Embriyonik ex vivo kültür tekniklerinin ortaya çıkışı, çok dallanmış organ 4 gelişimsel ve rejeneratif yolların belirlenmesi izin vermektedir. Ex vivo kültürlenmesiyle araştırmacıya (beni organı manipüle yeteneği verirchanical, genetik veya kimyasal) tanımlanmış koşullar altında yanı sıra gerçek zamanlı organ gelişimi ve hücre-hücre etkileşimleri karakterize etmek. Farenin exorbital LG, bu tekniğin son derece müsait olduğunu ve son çalışmalar gelişimini 2,5 düzenleyen sinyalizasyon sistemi tanımlamıştır. Ancak, LG gelişimini ve yenilenmesini destekleyen moleküler ipuçlarını anlamak için ihtiyaca rağmen, şu anda büyük olasılıkla nedeniyle organın izole teknik zorluklar, ilgili yeterli kalır. Bu yazıda, izole ve gelişim programları tanımlamak için embriyonik fare LG ex vivo kültürünü gerçekleştirmek için nasıl açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerilere sıkı göre altında yapıldı. Protokol California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), San Francisco tarafından onaylandı.
1. Fare Embriyonik Gözyaşı bezleri (LG): Hasat ve Mikrodiseksiyon
- Bilimsel Araştırma Etik komite için Kurumsal Hayvanlar tarafından onaylanan prosedürleri takiben uygun embriyonik günde hasat embriyolar servikal dislokasyon tarafından onaylanması ardından, yükselen CO 2 inhalasyon ile hamile CD-1 (veya transgenik) kadın aşımına euthanize. Vajinal fiş keşif e0'ın gün belirleyin.
Not: Gözyaşı bezleri (Lgs) itibaren e14 tek tomurcuk aşamasından hasat edilebilir. Ancak, e16 (5-10 tomurcukları) embriyolar ex vivo kültür için en tutarlı sonuçlar verir. - V sterilize% 70 etanol kullanılarak fare Entral tarafında. Cildi çimdik ve steril cerrahi makas ile orta hatta bir kesi yapmak; deri yoluyla kesilmiş ve karın boşluğuna maruz periton. 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Her bir uterusa ve yerine soğuk PBS (fosfat tamponlu salin) ya da DMEM F12 ortamında üstündeki mesometrium boyunca keserek 2 rahim boynuzları çıkarın.
- Forseps kullanarak (# 5), amnion kesesi embriyolar çıkarın ve soğuk PBS içeren ikinci bir steril Petri kabı içine yerleştirin. Gözleri veya kafa alana dokunmayın dikkatli olun.
- Bir transillüminasyonu tabanı ile bir mikroskop üzerine embriyo yerleştirin. 1.7 - embriyo <E17 ise, adımları 1.5 gerçekleştirin. Embriyolar iseniz> E17, bu adımlar bu nedenle 1.8 adıma geçin, faydalı olabilir, ancak şart değildir.
- Sadece alt çene altındaki gövde (aşama 1, şekil 2) 'deki Bağın gelen kafa Severga steril neşter (# 10 bıçak). Mandibula diseksiyon plaka üzerinde şimdi böylece başını döndürün. Kafa ve yaklaşık ¼ beyin (adım 2, 1. kesim, Şekil 2) dorsal tarafına kaldırmak için bir neşter stabilize forseps kullanın - Bu kıkırdak e15 etrafında stiffens kez özellikle önemlidir.
- Neşter gözler arasındaki burun delmek böylece başını döndürün. Gözleri ayrı yarımları (aşama 2, 2. kesme, Şekil 2) artık demektir ki, başlığın merkezinden geçen bir kesim yapın.
- İki # 5 forseps kullanarak, başın bir yarısını almak ve aşırı doku (Şekil 2 adım 3) çıkarın. (Gözün alt arka köşede bulunur) LG bu kaldırma işlemi kayıp değil bu yüzden başını yönlendirmek için emin olun. Fazlalığı serebral, kıkırdak ve burun çevresindeki doku ve gözün altında çıkarın. Bezi bu noktada zor görünür olduğundan, doğru aşırı doku kaldırma t sonra yönlendirilmiş gözü sağlamako LG konumunu kaybetmemek.
- Dikkatle posterior, hem forseps ile göz alt köşesinde cildi kapmak. Dikkatle LG maruz forseps ile açık çekerek cildi çıkarın. LG görselleştirmek yardımcı olmak için doku altında ve üstünde ek aydınlatma kullanın.
Not: LG, koyu, yoğun mezenşimin içinde bir kanal üzerinde bir tomurcuk olarak görünüm ile ayırt, bu noktada görünür olmalıdır. - Dikkatle LG ve ilgili mezenşimi LG veya ilişkili kanalı kapmak için dikkatli olmak, forseps kullanarak uzak çevreleyen dokudan (diyagram ve görüntüler bakın) incelemek başlar. Bezi çevreleyen dokudan serbest sonra, yavaşça LG kanalının dibinde gözünü çevreleyen epitel kavrayarak tüm bezini çıkarın. Yoğunlaştırılmış bir mezenşimin içine epitel invaginates olarak görülebilir epiteli çevreleyen mezenşimi korumak için özen gösterin.
Not: Tissu'dan bazı ilave gerie (herhangi bir küçük kemik fragmanları, kas ve bağ doku) komşu / büyüme faktörü sinyal önlemek için gerekli olabilir. - Kültür, hasat 4 - 5 bezleri ve plaka başına ilişkili mezenşimin (Lgs hemen diseksiyon üzerine ekilir); RT-PCR 6 RNA lisis tampon 100 ul başına 14 bezlerinin en az toplamak.
2. ex vivo Kültür Plakaları hazırlayın
Bu prosedür, gelişmekte olan tükürük bezi 7,8 için kullanılana dayanır.
- Cam tabanlı bir 50 mm çaplı bir mikro çanak 7 50 ug / ml, askorbik asit ve 50 ug / ml holo-transferrin ile birlikte kültür ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş), DMEM F12 200 ul ekle.
Not: Daha önce embriyonik tükürük bezinde morfogenetiğine maksimize etmek için bunu buldum DMEM F12 seçildi. - 13 mm POLYCARB Floatmedyanın üstüne 0.1 mikron gözenekleri ile onat membran filtre.
- İsteğe bağlı Adım: 3 mg / ml'lik bir son konsantrasyon sağlamak için DMEM / F12 ile 1 (hafifçe karıştırmak için, 200 ul pipet kullanın, santrifüj 1 dakika boyunca kabarcıklar görüldüğünde): 3-D laminin 1 seyreltin. Ekle Bu 15 ul filtre 3-D laminin seyreltilmiş.
Not: Bu seyreltme epitel dallanma ödün vermeden, 3B durumda LG muhafaza edilmesi için uygun olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, LG'nin kültürü için gerekli değildir. - Filtrenin üzerine ya da laminin içine 5 LG - 4 yerleştirin. Kültür Lgs ex vivo olarak 24 - 48 saat (Şekil 3) veya 20 qPCR daha fazla analiz için dk ya da immüno-boyama (Şekil 4)% 4 PFA ile yapışması. Embriyonik glandüler doku QPCR analizi için, Rebustini ark bakın., 2011. Embriyonik bez dokularında imüno-analizi için aşağıdaki alıntılarda bakınız: Hoffman ve arkadaşları, (2002), Steinberg ör.T ve arkadaşları., (2005).
3. Fare Postnatal ve Erişkin Gözyaşı bezleri (LG): Diseksiyon
- Uygun hayvan etik komitenin standartlarına göre doğum sonrası fareyi euthanize. Doğum sonrası yavrular gün 8 ya da daha genç, steril makas ile kafa kesilmesinin euthanize. Doğum sonrası gün 8 veya üzeri için,% 70 etanol ile kürk sprey.
- LG bulmak için, fare yukarıdan aydınlatma ile bir mikroskop altında yan yanal yatıyordu. Not: doğum sonrası ve yetişkin LG karotid arter, masseter kas ve dermis (Şekil 5) ile çevrelenmiştir.
- Küçük diseksiyon makas kullanarak, yanal LG nerede olması gerektiğini Epidermisteki küçük bir kesi yapmak.
- Forseps kullanarak, LG maruz kulak doğru epidermis çekerek açın.
- Yavaşça çevreleyen dokudan LG gevşetmek için forseps kullanın.
- LG çevreleyen dokudan serbest bırakıldıktan sonra, dikkatli, kanal tarafından LG kaldırmakkanal ve göz çevresindeki epitel (Şekil 1) bağlamak nerede kavrama tarafından.
- RT-PCR için RNA, liziz tamponu içinde LGS yerleştirin veya immün için 20 dakika boyunca% 4 PFA ile yapışması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LG epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. E14, e15, E16, E17, ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler bu olay göstermektedir.
Şekil 1. LG morfogenetiğine dallanma epitel sürecinde gelişir. Taze e14, e15, E16, E17 ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Boyutunda epitel arttıkça, mezenşim miktarı azaldığına dikkat edin. Embriyonik LGS mikro-kesim için deneysel adım, Şekil 2 'de gösterilmiştir.
Fare embriyoları LG mikrodiseksiyonu katılan adımlar Şekil 2. şematik. Diseksiyonu ve embriyonik fare LG çıkarılması şematik. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
LG kültürü için rutin ex vivo büyüme tutarlılık nedeniyle e16 embriyoları kullanmak. Şekil 3'te gösterildiği gibi, kültür koşulları, in vivo bezine benzer bir şekilde geliştirmek in vivo LG ex (Şekil 1 ile karşılaştırınız).
Şekil 3. ExE16 LGS vivo kültür in vivo morfogenezindeki tekrarıdır. E16 Lgs GFP epitel ile ifade edilir Pax6-Cre GFP embriyolar elde edilmiştir. Ardıl floresan görüntüler bu tek bezinin alındı 0, 3, 6, 12, 24, ve 48 saat. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Burada bize 48 saatlik kültür süresi boyunca dallanma epitel ardışık floresan görüntüleri çekmek için izin, epitel hücreleri vurgulamak için (aynı zamanda Le-Cre 5 olarak adlandırılır) Pax6-Cre, GFP embriyolar istihdam. Pax6-Kre, GFP transjeni barındıran Fareler jax elde edilebilir: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr ama bezi diseksiyonu ve kültür için gerekli değildir.
Kültürler veya taze LG sonra immunofluorescent analiz için sabit olabilir disseke. 4 s ŞekilBir vahşi tip (CD1) embriyo bir e16 LG 4 hücre bölmeleri, mezenşimin, epitel (EpCAM), sinirler (Tubb3) ve kan damarlarının (PECAM), görselleştirme hows.
Şekil 4. LG epitel, nöronal ve endotel hücreleri gibi birçok hücre tipleri oluşur. E16 LG epitel hücreleri (EpCAM, yeşil), nöronlar (Tubb3, kırmızı) ve endotel hücreleri (PECAM, camgöbeği) immunohistokimyasal oldu. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Taze kesilmiş doku için, tespit ve daha sonraki kullanım için bezi hareketsiz şekilde, kültür için yapılan ilk olarak, laminin LG gömmek için daha kolaydır. 5 şematik bir görünüşünü göstermektedir ŞekilDoğum sonrası / yetişkin LG diseksiyonu için.
Doğum sonrası ve yetişkin fare LG mikrodiseksiyonu katılan adımlar Şekil 5. şematik. Ya post-natal veya erişkin fareden diseksiyon ve LG çıkarılması şematik. A Pax6-Kre, GFP doğum sonrası gün 30 fare LG ve ilgili kanalın konumunu görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Doğum sonrası / yetişkin LG konumu Pax6-Kre, GFP fare kullanılarak görsel hale getirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürüne çok yönlülük ve LG ex vivo gelişimini incelemek için önemli avantajlar sağlamaktadır manipüle. Bu araştırmacı hipotezleri ve nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler organı oluşturacak nasıl etkileşimde epitel değerlendirmek için yapılabilir pertürbasyonların sayıda test edebilir hızını içerir. Bu modeli kullanarak, ancak, uyarılar bir dizi bulunmaktadır. İlk olarak, izolasyon sayesinde bezi sırada artık sinirler veya kan damarlarının 9,10 tarafından teslim sinyalleri ile bağlantılı olarak çalışır durumunda sinyal yollarının test edilen etkileyebilecek çevresel damar ya da sinir sistemine bağlanır. İkinci olarak, çevreleyen, LG dokular LG gelişimini 4 regüle eden faktörlere sağlayabilir. Bu olmayan diğer mezenkimal doku bileşenleri kültürü önce kaldırılması gerekir önlemek için. Üçüncü olarak, şu anda biz tam cytodifferent için gerekli koşulları sağlamak mümkün değildirtamamen işlevsel bir doku içine iation. Bu, ex vivo kültürlenmiş bütün organları için durum nedeniyle fonksiyonel kan damarları ve sinirler ve / veya çevre dokulardan mekanik kuvvetlerin yokluğunda da dahil olmak üzere, birçok nedenle muhtemeldir. Bu uyarılar rağmen, ex vivo kültür içinde tespit mekanizması yeni hipotezler 8,11 test etmek için, bu sağlam bir sistem haline in vivo deneyler, daha sonra değinmeyecek olduğu da gösterilmiştir.
Bu, ex vivo kültür sistemi, aynı zamanda organ rejenerasyonu 12 incelemek üzere kullanılabilir belirten, gelişim ve rejeneratif yollarının önemli ölçüde üst üste gelecek gösterilmiştir. Biz, ve diğerleri, daha önce göstermiştir burada yönünü tespit edilmemiştir, ancak embriyonik tükürük bezi organ hasarı ve rejenerasyonu 13 üzerinde tedavi edici etkileri ile modellemek için de kullanılabilir. Gelecekteki çalışmalar olarak LG ex vivo sisteminin kullanımı keşfetmek için gereklidoku rejenerasyonu için bir model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar ucsf Kaynak Tahsis Programı tarafından sağlanan fon kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
