Summary
Obwohl ein bekanntes Modell, stellt das Meerschweinchen noch eine Nische in der experimentellen Tierforschung und der begrenzten Daten über die Ausführung der meisten Verfahren zur Verfügung. Hier präsentieren wir Ihnen vier verschiedene Ansätze, um Nicht-Terminal in vivo Blutentnahme Techniken entweder bewusst oder betäubt Meerschweinchen.
Abstract
Meerschweinchen besitzen mehrere biologische Ähnlichkeiten zum Menschen und experimentellen Tiermodellen validiert 1-3. Allerdings ist die Verwendung von Meerschweinchen stellt derzeit einen relativ engen Bereich der Forschung und beschreibenden Daten zu spezifischen Methodik ist entsprechend knapp. Die anatomischen Merkmale der Meerschweinchen sind etwas anders als andere Nagetiermodellen, daher Modulation von Stichprobenverfahren für artenspezifische Unterschiede unterzubringen, zB., Im Vergleich zu Mäusen und Ratten, sind notwendig, um eine ausreichende und qualitativ hochwertige Proben zu erhalten. Wie lange und kurze Laufzeit in-vivo-Studien erfordern oft wiederholte Entnahme von Blut die Wahl der Technik sollte auch, um Stress und Unbehagen bei den Tieren zu reduzieren, sondern auch in Betracht gezogen werden, um das Überleben als auch die Einhaltung der Anforderungen der Stichprobengröße und die Zugänglichkeit zu gewährleisten. Venöse Blutproben können bei einer Reihe von Standorten in Meerschweinchen zB erhalten werden., Die Vena jugularis undVenen, jede Technik, die sowohl Vor-und Nachteile von 4,5. Hier stellen wir vier verschiedene Techniken zur Blutentnahme entweder bewusst oder betäubt Meerschweinchen. Die Verfahren sind alle Nicht-Terminal-Verfahren vorgesehen, dass die Probenvolumina und die Anzahl der Proben nicht bei Labortieren 6 nicht Richtlinien für die Blutentnahme überschreiten. Alle beschriebenen Methoden wurden gründlich getestet und angewandt für die in vivo Blutentnahme in Studien innerhalb unserer Forschungseinrichtung wiederholt.
Introduction
Das Meerschweinchen ist ein wertvolles und validiert experimentellen Tiermodell aufgrund einer Reihe von biologischen Ähnlichkeiten zum Menschen wie das Erfordernis einer diätetischen Versorgung mit Vitamin C, vergleichbar Plasma-Lipoprotein-Stoffwechselenzyme und Lipoprotein-Profile sowie gemeinsamen Ähnlichkeiten mit der menschlichen Plazenta und pränatalen Entwicklung 1-3,7,8. Dies macht die Meerschweinchen eine attraktive und geeignete Modell für die Untersuchung die Auswirkungen der Ernährung-assoziierten Erkrankungen wie nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und vermeintliche Wirkungen von Vitamin-C-Mangel, sondern auch die Wirkung von zB., Mütterliche diätetische Intervention auf der Entwicklung Nachkommen.
Wiederholte Entnahme von Blut wird häufig sowohl in lang-und kurzfristigen in-vivo-Untersuchungen erforderlich. Aufgrund artenspezifischer anatomischer Unterschiede Modulation der Entnahmetechnik ist notwendig, um Blutproben beim Meerschweinchen im Vergleich zu anderen Tiermodellen erhalten
Hier stellen wir vier verschiedene Techniken zur Blutentnahme entweder bewusst oder betäubt Meerschweinchen. Das procedures sind alle Nicht-Terminal-Verfahren vorgesehen, dass die Probenvolumina und die Anzahl der Proben nicht bei Labortieren 6 nicht Richtlinien für die Blutentnahme überschreiten. Es ist im Interesse der guten Wissenschaft sowie des Tierschutzes, dass Stress auf ein Minimum gehalten werden. Folglich kann nur gut ausgebildete und kompetente persönliche sollten die Tierversuche durchführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die gezeigten Verfahren wurden nach Protokollen, die von der dänischen Tierversuchsinspektion des Ministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Fischerei zugelassenen geführt.
1. Blutentnahme aus der Vena Lateral oder Tarsal Vein
- Führen Sie dieses Verfahren ohne Narkose und die Hilfe von einem Prüfer, ein Umgang mit dem Meerschweinchen und ein Sammeln der Probe.
- Rasieren Sie die Fußwurzel Region des Hinterbein mit einem elektrischen Rasierer, bis die Venen sichtbar sind. Stellen Sie sicher, das Gebiet ist groß genug, um fur Eingriffe in die Einstichstelle zu vermeiden.
- Legen Sie das Hinterbein in einem lauwarmen Wasserbad und sanft einmassieren das Bein, so dass die Venen erweitert und mehr offensichtlich.
- Wischen Sie das Bein mit einem sauberen Handtuch und desinfizieren Sie die Einstichstelle mit Gaze oder einem Wattestäbchen, das mit 70% Alkohol gedämpft.
- Hemmen die Meerschweinchen und erweitern das Hinterbein nach unten, während mit leichtem Druck direkt über dem Kniegelenk to Bereitstellung von Stasis.
- Punktion der Vene mit einer Nadel 21 G oder Lanzette. Blutentnahme zB., Indem Sie eine Sammlung oder Kapillare. Manipulieren Sie vorsichtig das Bein, um den Blutfluss zu unterstützen.
- Frei Stase, sobald die Probe erhalten worden ist. Mit einem Stück Gaze oder Watte mit sanftem Druck auf die Einstichstelle, bis Blutung aufgehört hat.
- Schicken Sie das Tier in seinen Käfig und Monitor für 5-10 min zur Blutstillung zu gewährleisten.
2. Blutentnahme aus der Ohrvene
- Führen Sie dieses Verfahren ohne Narkose entweder allein oder vorzugsweise mit der Hilfe von einem Kollegen.
- Desinfizieren Sie die Rückenfläche des Ohres mit Gaze oder einem Wattestäbchen mit 70% Alkohol gedämpft.
- Mit leichtem Druck an der Basis des Ohres zu Stase bieten.
- Punktion der Vene mit einer Nadel 21 G oder Lanzette, und sammeln Blut.
- Lassen Sie Stase, sobald die Probe erhalten worden ist, mit einem Stück Gaze oder Watte mit GEntle Druck auf die Einstichstelle, bis Blutung aufgehört hat.
- Schicken Sie das Tier in seinen Käfig und Monitor für 5-10 min zur Blutstillung zu gewährleisten.
3. Blutentnahme aus der Vena jugularis
- Führen Sie diesen Vorgang mit der Hilfe von einem zusätzlichen Ermittler; einen Umgang mit dem Meerschweinchen und ein Sammeln der Probe.
- Betäuben das Meerschweinchen mit einem geeigneten Betäubungsmittel für die gesamte Dauer dieses Verfahrens. Eine Mischung von Tiletamin (0,93 mg / kg), Zolazepam (0,93 mg / kg), Xylazin (1,49 mg / kg) und Butorphanol (0,06 mg / kg) verwendet werden.
- Legen Sie den narkotisierten Meerschweinchen auf dem Rücken und sanft zurückziehen den Vorderbeinen kaudal.
- Rasieren und desinfizieren (zB., Mit 70% Alkohol) dem ventralen Teil des Halses.
- Bestreichen Sie die Spritze mit Heparin oder EDTA entweder vor der Probenahme, um das Risiko von Gerinnungs reduzieren.
- Abtasten dem Schlüsselbein und legen Sie eine 25 G (oder 23 G) Nadel auf einer 1 ml Spritze ap montiertproximately 1 cm seitlich der Mittellinie auf der Höhe des Schultergelenks. Halten Sie die Spritze in einem leichten Aufwärtswinkel und medial, während ein leichter Unterdruck. Damit eine Beschädigung der darunter liegenden Strukturen wie der Halsschlagader ist ziemlich oberflächlich entfernt. Neigen Sie den Hals der Meerschweinchen leicht nach hinten erhöht Stase der Vene ist.
- Lassen Sie die Vorderbeine, wenn die Blutprobe erhalten und zu lindern Stase, bevor die Nadel zurückgezogen wird. Verwenden Sie ein trockenes Stück Gaze oder Watte, um sanften Druck auf die Punktionsstelle.
- Zurück, das Tier zu einer Erholung Käfig und zu überwachen, um die Blutstillung und Erholung von der Anästhesie zu gewährleisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vier verschiedene Ansätze zur nicht-terminale Blutentnahme in vivo Techniken entweder bewusst oder narkotisierten Meerschweinchen wurden vorgelegt. Abbildung 1 zeigt den Verlauf der lateralen Vena saphena und Fußwurzel Vene im Meerschweinchen und mögliche Punktionsstellen. Ohrvenen auf der dorsalen Oberfläche des Meerschweinchens Ohr sichtbar sind in Abbildung 2 dargestellt Diese Adern können zur Blutentnahme verwendet werden, wenn nur ein sehr kleines Volumen erforderlich ist. Die Position der Meerschweinchen für Vena Blutentnahme ist Show in Abbildung 3. Der Verlauf der Halsschlagader wird durch die Pfeile mit dem obersten Pfeil, der auf der empfohlenen Punktionsstelle veranschaulicht.
Abbildung 1. Die Seiten Vena und Fußwurzel Vene beim Meerschweinchen. Das Bild veranschaulicht den Verlauf und diePunktionsstelle für Blutentnahme aus der Vena Seiten (oberer Pfeil) oder der Fußwurzel Vene (unterer Pfeil) in der Meerschweinchen.
Abbildung 2. Ohrvenen. Dieses Bild veranschaulicht Ohr Venen (Pfeile) auf der Rückenfläche eines Meerschweinchen Ohr sichtbar. Diese Adern können zur Blutentnahme verwendet werden, wenn nur ein sehr kleines Volumen erforderlich ist.
Abbildung 3. Position des Meerschweinchens für Halsschlagader Blutentnahme. Dies veranschaulicht die Position der Meerschweinchen und die Einstichstelle für Halsschlagader Blutentnahme. Die Pfeile zeigen den Verlauf der Jugularvene mit dem obersten Pfeil in Richtung der Einstichstelle empfohlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Im Vergleich zu Mäusen und Ratten, Meerschweinchen sind von Natur aus ängstlich und muss ruhig angegangen und richtig, um Stress zu reduzieren behandelt werden. Aus Tierschutzsicht, mit Sorgfalt handeln, sind natürlich eine Priorität; jedoch wird dies auch das Risiko von Angst damit verbundenen Auswirkungen auf die erfassten Daten beispiels., erhöhte Blutspiegel von Corticosteroiden und Glucose 12. Ebenso wird täglich Umgang mit den Tieren zu normalen Verfahren zu gewöhnen und kann dazu dienen, Stress noch weiter zu reduzieren. Praktisches Know-how in einem bestimmten Blutabnahme Technik sollte durch erste Beobachtung eines erfahrenen Betreiber und danach die Durchführung der Technik unter Aufsicht, bis Kompetenz erreicht gewonnen werden. Die gewählte Technik sollte im Idealfall sowohl Stress und Unbehagen auf ein Minimum reduzieren, sondern auch um das Überleben als auch die Einhaltung der Anforderungen der Stichprobengröße und die Zugänglichkeit zu gewährleisten. Für alle vorgestellten Methoden Blutentnahme aseptischer Techniken sollteverwendet werden, um das Infektionsrisiko zu minimieren und sicherzustellen, Sammlung von unberührten Proben.
Die dargestellten Ansätze zur Blutentnahme zu gewährleisten das Überleben des Tieres vorgesehen, dass die Probenvolumen und Frequenz wird nach den Richtlinien erreicht und kann alle für wiederholte Probenahme in kurze und lange Zeitstudien 6 angewendet werden. Dies ermöglicht konsistente Überwachung der einzelnen Tiere im Laufe der Zeit reduziert hiermit Varianz und Anzahl der Tiere enthalten in Übereinstimmung mit den 3R "(Reduktion) 13,14. Die hier vorgestellten Techniken haben unterschiedliche Bereiche der erhältlichen Probenvolumen (ein paar ul bis zu 1-2 ml), die als vor dem Beginn eines Experiments werden sollen. Obwohl Verfahren für die Entnahme von Blut aus der Halsschlagader in un-narkotisierten Meerschweinchen beschrieben worden, 12, empfehlen wir dringend die Verwendung der Narkose zu Stress und Unbehagen so weit wie möglich zu reduzieren. Dabei sollte die Wahl der Anästhesie vorsichtig seiny angesprochen, unter Hinweis darauf, dass Meerschweinchen sind notorisch schwer zu betäuben und zeigt erhebliche Unterschiede Wirksamkeit der Betäubung sowie eine hohe Sensibilität gegenüber induzierten Atmung Depression 15,16. Da der Halsschlagader bei Meerschweinchen ist weder sichtbar noch tastbar jede Verringerung in Stasis / Venenerweiterung kann die Probenahme Schwierigkeiten zu erhöhen, damit es in der Regel empfohlen, gefäßverengenden Mittel in der Anästhesie-Mischungen zu vermeiden. . Weiterhin bekannt Wirkungen bestimmter Anästhesiemittel, die mit der gewünschten Datenerfassung zB stören können, kardiovaskuläre Effekte und / oder erhöhte Blutglucosespiegel nach α 2 - Agonisten sollten Maßnahmen bei Nagetieren beurteilt 16,17 werden. Die Verwendung von Inhalationsnarkose wie Isofluran kann auch eine Option sein, aber wie Intubation bei Meerschweinchen ist muss eine sehr schwierige Aufgabe darauf zu achten, um Störungen durch die Inhalation-Maske mit dem Kopf / Hals-Position zu vermeiden, da dies zu complicaß das Verfahren unnötig. Generali Anästhesie zB., Durch Inhalation ist auch für Herzpunktion, die einen größeren Probenvolumen bieten kann erforderlich. Jedoch ist ein Herzpunktion Klemme Verfahren und damit nicht für wiederholte Probenahme und werden nicht weiter beschrieben.
Mögliche nachteilige Effekte wie Blutungen, Blutergüsse, Thrombosen, Infektionen und Narbenbildung kann auftreten, nach Punktion einer Vene. Nach unserer Erfahrung ist das Meerschweinchen nicht zeigen ein erhöhtes Risiko für solche unerwünschten Komplikationen im Vergleich zu anderen Tiermodellen vorgesehen, dass das Verfahren erledigt ist, wie in der aktuellen Manuskript beschrieben. Da die Jugularvene nicht von der Außenfläche sichtbar ist, ist es sehr wichtig, Stase vor Zurückziehen der Nadel zu entlasten und um eine angemessene Hämostase, um das Risiko von peri-venösen Blutungen und Blutergüsse zu minimieren. Im Falle von Nebenwirkungen sollte die Behandlung immer von der zuständigen Veter gesucht werdenArztes. Aus Gründen der guten Tierschutz und Wissenschaft, müssen ernsthafte Überlegungen, die das Zusammenwirken von Probenvolumen und Frequenz und die Wahl der Sampling-Technik gegeben. Alle beschriebenen Blutentnahme Techniken wurden gründlich getestet und für in vivo Blutentnahme in Studien innerhalb unserer Forschungseinrichtung wiederholt angewendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren. Alle Verfahren wurden von der Tierversuchsgesetz von Dänemark, das im Einklang mit dem Übereinkommen des Europarates ETS 123 ist genehmigt.
Acknowledgments
Wir erkennen die geschickte Unterstützung von Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft und den Tierpflegern bei der Abteilung für Experimentelle Medizin, Frederiksberg Campus, Fakultät für Gesundheit und Medizin, Universität von Kopenhagen, Dänemark. Jacob Lønholdt wird dankte für die hervorragende technische Unterstützung bei Dreharbeiten die Verfahren. Diese Studie wurde zum Teil durch die LIFEPHARM Center zur in vivo-Pharmakologie und Universität Kopenhagen unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electric shaver | Wella (Contura), Denmark | 273207 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Syringes | B.Braun-Omnifix-F, Germany | 9161406V | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Needles | BD Microlance, Spain | 301156 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Microvette collection tube | Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany | 201,288,100 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Accu-Check analyzer | Roche A/S Diagnostics, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Heparin 5000 IE/ml | LEO Pharma, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Zoletil 50, Chemvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Neutral eye ointment | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Gauze or a cotton swab | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Disinfectant (70% alcohol) | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
References
- DeOgburn, R., et al. Effects of increased dietary cholesterol with carbohydrate restriction on hepatic lipid metabolism in Guinea pigs. Comp.Med. 62 (2), 109-115 (2012).
- Fernandez, M., Volek, J. S. Guinea pigs a suitable animal model to study lipoprotein metabolism, atherosclerosis and inflammation. Nutr Metab (Lond). 3 (17), (2006).
- Frikke-Schmidt, H., Tveden-Nyborg, P., Birck, M. M., Lykkesfeldt, J. High dietary fat and cholesterol exacerbates chronic vitamin C deficiency in guinea pigs. Br J Nutr. 105 (1), 54-61 (2011).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig, ferret and mink. Lab Anim. 32 (4), 364-368 (1998).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ye, P., Cheah, I. K., Halliwell, B. High fat diets and pathology in the guinea pig Atherosclerosis or liver damage. Biochim Biophys Acta. 1832 (2), 355-364 (2013).
- Tveden-Nyborg, P., et al. Maternal vitamin C deficiency during pregnancy persistently impairs hippocampal neurogenesis in offspring of guinea pigs. PLoS One. 7 (10), 12-18391 (2012).
- Schjoldager, J. G., Tveden-Nyborg, P., Lykkesfeldt, J. Prolonged maternal vitamin C deficiency overrides preferential fetal ascorbate transport but does not influence perinatal survival in guinea pigs. Br J Nutr. 110 (9), 1573-1579 (2013).
- Greulich, S., et al. Secretory products of guinea pig epicardial fat induce insulin resistance and impair primary adult rat cardiomyocyte function. J Cell Mol Med. 15 (11), 2399-2410 (2011).
- Swifka, J., Weiss, J., Addicks, K., Eckel, J., Rosen, P. Epicardial fat from guinea pig a model to study the paracrine network of interactions between epicardial fat and myocardium. Cardiovasc Drugs Ther. 22 (2), 107-114 (2008).
- Pilny, A. A. Clinical hematology of rodent species. Vet.Clin North Am Exot Anim Pract. 11 (3), 523-vii (2008).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Van, L. J., et al. eAssessing the application of the 3Rs a survey among animal welfare officers in The Netherlands. Lab Anim. 47 (3), 210-219 (2013).
- Sloan, R. C., et al. High doses of ketamine-xylazine anesthesia reduce cardiac ischemia-reperfusion injury in guinea pigs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (3), 349-354 (2011).
- Jacobson, C. A. A novel anaesthetic regimen for surgical procedures in guinea pigs. Lab Anim. 35 (3), 271-276 (2001).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine xylazine anesthesia in rats mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med(Maywood). 230 (10), 777-784 (2005).
