Biology

טכניקות דגימת דם ללא מסוף בגינאה חזירים

Published: October 11, 2014 doi: 10.3791/51982

Malene M. Birck¹, Pernille Tveden-Nyborg¹, Maiken M. Lindblad¹, Jens Lykkesfeldt¹

¹Department of Veterinary Disease Biology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

למרות שמודל ידוע, שפן הניסיונות כיום מייצגים נישה במדעי בעלי חיים ניסיוניים ונתונים מוגבלים נגיש בביצוע של רוב ההליכים. כאן אנו מציגים ארבע גישות שונות למי שאינו מסוף בטכניקות דגימת דם vivo באו חזירי ים מודעים או מורדם.

Abstract

גינאה חזירים יש כמה קווי דמיון ביולוגיים לבני אדם והן תוקפים מודלים של בעלי חיים ניסיוניים ^1-3. עם זאת, השימוש בחזירי ים מהווה כיום אזור צר יחסי של נתוני מחקר ותיאורים על מתודולוגיה מסוימת היא בהתאמה נדירה. התכונות האנטומי של שרקנים שונות מעט ממודלים של מכרסמים אחרים, ומכאן אפנון של טכניקות דגימה כדי להתאים להבדלי מינים ספציפיים, למשל., בהשוואה לעכברים וחולדות, נחוצים כדי להשיג דגימות באיכות מספקות וגבוהות. כשני לטווח הארוך וקצר במחקרי vivo לעתים קרובות דורש חוזר ונשנה דם דגימת הבחירה של טכניקה יש לשקול היטב על מנת להפחית את הלחץ ואי נוחות בבעלי החיים, אלא גם כדי להבטיח את הישרדות, כמו גם עמידה בדרישות של גודל מדגם ונגישות. ניתן להשיג דגימות דם ורידים במספר האתרים בשרקנים למשל., saphenous וצווארורידים, כל טכניקה המכילה את שני יתרונות וחסרונות ^4,5. כאן, אנו מציגים ארבע טכניקות דגימת דם שונות לאו חזירי ים מודעים או מורדם. הנהלים כל הנהלים שאינם המסוף ובלבד שכרכי המדגם ומספר הדגימות לא יעלו על הנחיות לאיסוף דם בחיות מעבדה ^6. כל השיטות שתוארו נבדקו ביסודיות והגישו בקשה לחזרו בדגימת דם vivo במחקרים בתוך מתקן המחקר שלנו.

Introduction

שפן הניסיונות הוא מודל חיה ניסיוני יקר ומאומתים בשל מספר קווי דמיון ביולוגי לבני אדם כגון דרישה לאספקה תזונתית של ויטמין C, ליפופרוטאין פלזמה הדומה חילוף חומרים של אנזימים ופרופילי ליפופרוטאין, כמו גם קווי דמיון משותפים עם placentation ואנושי פיתוח טרום לידתי ^1-3,7,8. זה הופך את חזיר ים מודל אטרקטיבי ומתאים ללימוד השפעות של מחלות הקשורות דיאטה כגון מחלת שאינה אלכוהוליים כבד שומני, מחלות לב וכלי דם והשפעות המשוערות של מחסור בויטמין C, אלא גם את ההשפעה של לדוגמא., התערבות תזונתית אימהית על הפיתוח צאצאים.

דגימת דם חוזרת נדרשה לעתים קרובות בשני הטווח הארוך וקצר במחקרי vivo. בשל הבדלים אנטומיים מינים ספציפיים אפנון של טכניקת הדגימה הוא הכרחי על מנת להשיג דגימות דם בחזירי ים בהשוואה למודלים של מכרסמים אחרים 3,9. טכניקה זו מאפשרת לי חזרו דגימות של כמויות קטנות של דם (100-400 μl), למשל., כדי לקבוע סמנים ביוכימיים בפלזמה. אם גודל מדגם קטן עוד יותר הוא מספיק (50-100 μl), יכולה די בקלות ניתן להשיג זאת על ידי ניקוב וריד האוזן. טכניקה זו יכולה גם להתבצע בבעלי חיים מודעים ושימושית לדוגמא בעת מדידת רמת סוכר בדם ^10,11. דגימה מוריד הצוואר מאפשרת לאוסף של כמויות גדולות יותר של דם (1-2 מ"ל) אבל דורשת הרדמה.

כאן, אנו מציגים ארבע טכניקות דגימת דם שונות לאו חזירי ים מודעים או מורדם. Procedures כל הנהלים שאינם המסוף ובלבד שכרכי המדגם ומספר הדגימות לא יעלו על הנחיות לאיסוף דם בחיות מעבדה ^6. זה באינטרסים של מדע טוב, כמו גם לרווחת בעלי החיים שלחץ צריך להיות כל הזמן למינימום. כתוצאה מכך, מאומן היטב בלבד ואישי מוסמך צריך לבצע את ההליכים בבעלי החיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים מוצגים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הדני לניסויים בבע"ח הפקוח תחת משרד המזון, החקלאות והדיג.

.1 דגימת דם מsaphenous לרוחב או Tarsal הווריד

לבצע הליך זה ללא הרדמה ואת עזרתו של חוקר אחד, אחד טיפול שפן הניסיונות, ואחד איסוף הדגימה.
לגלח את אזור הקרסול של הרגל האחורית עם מכונת גילוח חשמלי עד שהוורידים גלויים. ודא האזור הוא גדול מספיק כדי להימנע מפרווה מפריעה לאתר לנקב.
הנח את הרגל האחורית באמבט מים פושר ולשפשף בעדינות את הרגל, מה שהופך את הוורידים מורחבים יותר וברורים.
נגב את הרגל במגבת נקייה ולחטא את האתר לנקב עם גזה או מקלון צמר גפן הטבול באלכוהול 70%.
לרסן את פן הניסיונות ולהאריך את הרגל האחורית כלפי מטה תוך הפעלת לחץ עדין באופן מיידי מעל מפרק הברך to לספק קיפאון.
לנקב את הווריד באמצעות מחט 21 G או אזמל. לאסוף למשל דם., על ידי שימוש בצינור איסוף או נימים. בעדינות לתפעל את הרגל כדי לסייע לזרימת הדם.
לשחרר קיפאון, פעם אחת המדגם הושג. החל פיסת צמר גזה או צמר גפן עם לחץ עדין לאתר לנקב עד דימום הפסק.
להחזיר את החיה לכלוב והצג שלה ל5-10 דקות כדי להבטיח עצירת דימום.

2 דגימת דם מוריד האוזן

לבצע הליך זה ללא הרדמה לבד או עדיף עם עזרתו של חברי אחד.
לחטא את פני השטח הגבי של האוזן באמצעות גזה או מקלון צמר גפן טבול באלכוהול 70%.
להפעיל לחץ קל לבסיס של האוזן כדי לספק קיפאון.
לנקב את הווריד באמצעות מחט 21 G או אזמל, ולאסוף דם.
לשחרר קיפאון, פעם אחת המדגם הושג, החל פיסת גזה או צמר גפן עם geלחץ ntle לאתר לנקב עד דימום פסק.
להחזיר את החיה לכלוב והצג שלה ל5-10 דקות כדי להבטיח עצירת דימום.

.3 דגימת דם מוריד הצוואר

לבצע הליך זה באמצעות העזרה של חוקר אחד נוסף; אחד טיפול שפן ניסיונות ואחד איסוף הדגימה.
לטשטש פן הניסיונות עם חומר הרדמה מתאימה לכל תקופת של הליך זה. תערובת של tiletamine (0.93 מ"ג / קילוגרם), zolazepam (0.93 מ"ג / קילוגרם), xylazine (1.49 מ"ג / קילוגרם) וbutorphanol (0.06 מ"ג / קילוגרם) יכולה לשמש.
הנח את פן הניסיונות מורדמים על הגב שלה בעדינות לחזור בי הרגליים הקדמיות caudally.
לגלח ולחטא (למשל., עם 70% אלכוהול) חלק הגחון של הצוואר.
מעיל המזרק עם או הפרין או EDTA לפני דגימה על מנת להקטין את הסיכון של קרישה.
למשש את עצם הבריח ולהכניס 25 G (או 23 G) מחט רכובה על ap מזרק 1 מ"לבסמיכות 1 סנטימטר לרוחב קו האמצע ברמה של מפרק כתף. שמור את המזרק בזווית כלפי מעלה והמדיאלי קלה בעת החלת לחץ שלילי קל. למנוע נזק למבני היסוד כמו וריד הצוואר נמצא די שטחי. הטה את הצוואר של חזיר הים מעט לאחור כדי לספק קיפאון מוגבר של הווריד.
שחרר את הרגליים הקדמיות כאשר דגימת הדם שהושגה, ולהקל על קיפאון לפני המחט חזר בו. השתמש בפיסת גזה או צמר גפן יבש להפעיל לחץ עדין לאתר לנקב.
להחזיר את בעלי החיים לכלוב התאוששות ולפקח על מנת להבטיח עצירת דימום והתאוששות מן ההרדמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ארבע גישות שונות בטכניקות דגימת דם שאינו מסוף vivo באו חזירי ים מודעים או מורדם הוצגו. איור 1 מדגים את מהלך saphenous לרוחב ווריד קרסול בפן הניסיונות והאתרים לנקב אפשריים. ורידי אוזן גלויים על פני השטח הגבי של אוזן חזיר ים הם באיור 2 ורידים אלה יכולים לשמש לדגימת דם כאשר נדרש רק נפח קטן מאוד. עמדתו של פן הניסיונות לדגימת דם הצוואר היא מופע באיור 3. במהלך וריד הצוואר בא לידי ביטוי בחיצים עם החץ מצביע העליון באתר לנקב המומלץ.

איור 1 הווריד saphenous וקרסול לרוחב שבפן הניסיונות. התמונה מתארת את המסלול ואתאתר לנקב לדגימת דם מsaphenous לרוחב (החץ העליון) או וריד הקרסול (חץ תחתון) שבפן הניסיונות.

איור 2 ורידי אוזן. תמונה זו ממחישה ורידי אוזן (חיצים) נראו על פני השטח הגבי של אוזן שפן ניסיונות. ורידים אלו יכולים לשמש לדגימת דם כאשר נדרש רק נפח קטן מאוד.

תפקיד איור 3 של פן הניסיונות לדגימת דם וריד הצוואר. זה ממחיש את עמדתו של חזיר הים והאתר לנקב לדגימת דם וריד הצוואר. החיצים מצביעים על מהלך וריד הצוואר עם החץ מצביע לכיוון העליון האתר לנקב המומלץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בהשוואה לעכברים וחולדות, חזירי ים חוששים ידי הטבע ויש לגשת בשלווה ולטפל בו כראוי על מנת להפחית את הלחץ. מנקודת מבט של רווחת בעלי חיים, הפועלות בזהירות הוא באופן טבעי בראש סדר עדיפויות; עם זאת, זה יהיה גם להפחית את הסיכון לתופעות הקשורים חרדה בלמשל הנתונים שנאסף., רמות דם מוגברות של סטרואידים וגלוקוז ^12. כמו כן, טיפול יומי יהיה להרגיל את החיות לנהלים רגילים ויכול לשמש כדי להפחית את הלחץ עוד יותר. מומחיות מעשית בטכניקת דגימת דם מסוימת צריכה להיות שנרכש על ידי ההתבוננות ראשונה מפעיל מנוסה ולאחר מכן נהל את הטכניקה תחת פיקוח עד יכולת מושגת. הטכניקה שנבחרה צריכה באופן אידיאלי שתי להפחית את הלחץ ואי נוחות למינימום, אלא גם כדי להבטיח את הישרדות, כמו גם עמידה בדרישות של גודל מדגם ונגישות. לכל שיטות דגימת הדם הציגו טכניקות ספטית צריכה להיותלהשתמש כדי למזער את הסיכון לזיהום ולהבטיח איסוף דגימות מזוהמים.

גישות מאוירות לדגימת דם להבטיח את הישרדותו של בעל החיים ובלבד שנפח הדגימה והתדירות מושגת על פי הנחיות וכולם יכולות להיות מיושמת על דגימה חוזרת ונשנית בשני מחקרים לטווח קצרים וארוכים ^6. זה מאפשר מעקב העקבי של בעלי חיים בודדים לאורך זמן הפחתה בזאת שונות ומספר בעלי החיים שנכללו בעמידה ב'3Rs (הפחתה) ^13,14. יש לי הטכניקות שהוצגו כאן טווחים שונים של השגה נפח דגימה (כמה μl עד 1-2 מ"ל) שיש לשקול לפני תחילת ניסוי. למרות שנהלים לאיסוף דם מוריד הצוואר בשרקנים-מורדם בלתי תוארו ^12, אנו ממליצים בחום על השימוש בהרדמה כדי להפחית את הלחץ ואי נוחות ככל האפשר. כאשר עושים זאת, הבחירה של הרדמה צריכה להיות carefully התייחס, וציין כי רקנים הם קשים לשמצה לטשטש ולהציג יעילות רבה וריאציה של ההרדמה, כמו גם רגישות גבוהה כלפי דיכאון נשימה הנגרמת ^15,16. כוריד הצוואר בחזירי ים אינו נראה לעין ולא מוחשי הפחתה כלשהי בקיפאון / התרחבות ורידים עשויים להגדיל קשיי דגימה, ולכן הוא מומלץ בדרך כלל להימנע מסוכני הרחבת כלי דם-ההצרה בהרדמה-תערובות. . יתר על כן, השפעות ידועות של סוכנים מאלחשים ספציפיים שעלולים להפריע לדוגמא איסוף נתונים הרצויה, אפקטי לב וכלי דם ו / או רמות סוכר בדם מוגברות הבאות α ₂ - יש לבחון פעולות אגוניסט במכרסמים ^16,17. השימוש בהרדמת משאיפת כגון isoflurane יכול להיות גם אפשרות, עם זאת כאינטובציה בחזירי ים הוא יש לקחת טיפול משימה קשה מאוד כדי למנוע הפרעה על ידי שאיפה המסכה עם עמדת הראש / צוואר כמו זה עשוי complicאכלתי את ההליך שלא לצורך. למשל כללי הרדמה., על ידי שאיפה נדרש גם עבור לנקב לב אשר עשוי לספק יותר נפח דגימה. עם זאת, לנקב לב הוא הליך מסוף ולכן אינו ישים עבור דגימה חוזרת ונשנית ולא ניתן לתאר נוסף.

השפעות פוטנציאליות שליליות כגון דימום, שטפי דם, פקקת, זיהום ומפחיד עלולות להתרחש בעקבות ניקוב וריד. מניסיוננו, חזיר הים אינו תערוכת סיכון מוגבר לסיבוכים לא רצויים כגון בהשוואה למודלים של מכרסמים אחרים ובלבד שההליך מתבצע כפי שתואר בכתב היד הנוכחית. כוריד הצוואר לא יכול להיות דמיינו מהמשטח החיצוני, זה מאוד חשוב כדי להקל על קיפאון לפני נסיגת המחט ולספק עצירת דימום נאותה על מנת למזער את הסיכון של דימום ושטפי דם פרי ורידים. במקרה של תופעות לוואי, טיפול צריך להיות תמיד חיפש מוטרינריה האחראיםnarian. מסיבות של רווחת בעלי חיים טובה ולמדע, שיקולים רציניים יש לתת להשפעה המשולבת של נפח דגימה ותדרים ובחירה של טכניקת דגימה. כל טכניקות דגימת דם שתוארו נבדקו ביסודיות והגישו בקשה לחזרו בדגימת דם vivo במחקרים בתוך מתקן המחקר שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף. כל ההליכים אושרו על ידי הניסויים בבעלי חי החוק של דנמרק, אשר הנו בהתאם למועצת אירופה אמנת ETS 123.

Acknowledgments

אנו מכירים בסיוע המיומן של אנני ב 'Kristensen, אליזבת V. אנדרסן, לינדה ב' Bringtoft ומטפלים בבעלי החיים במחלקה לרפואה ניסויית, קמפוס פרדריקסברג, הפקולטה לבריאות ומדעי רפואה, אוניברסיטת קופנהגן, דנמרק. יעקב Lønholdt הוא הודה לקבלת הסיוע הטכני מצוין שלו בצילומי הנהלים. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז LIFEPHARM לin vivo פרמקולוגיה ואוניברסיטת קופנהגן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric shaver	Wella (Contura), Denmark	273207	Alternative product may be used. Multiple suppliers
Syringes	B.Braun-Omnifix-F, Germany	9161406V	Alternative product may be used. Multiple suppliers
Needles	BD Microlance, Spain	301156	Alternative product may be used. Multiple suppliers
Microvette collection tube	Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany	201,288,100	Alternative product may be used. Multiple suppliers
Accu-Check analyzer	Roche A/S Diagnostics, Denmark		Alternative product may be used. Multiple suppliers
Heparin 5000 IE/ml	LEO Pharma, Denmark		Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia	Zoletil 50, Chemvet, Denmark		Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia	Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark		Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia	Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark		Alternative product may be used. Multiple suppliers
Neutral eye ointment			Alternative product may be used. Multiple suppliers
Gauze or a cotton swab			Alternative product may be used. Multiple suppliers
Disinfectant (70% alcohol)			Alternative product may be used. Multiple suppliers