Summary
Även en känd modell, representerar marsvin närvarande en nisch i försöksdjursvetenskap och begränsade data finns tillgängliga för utförandet av de flesta förfaranden. Här presenterar vi fyra olika metoder för icke-terminal in vivo blodprovtagningsmetoder i antingen medvetna eller sövda marsvin.
Abstract
Marsvin har flera biologiska likheter med människor och valideras experimentella djurmodeller 1-3. Däremot representerar användningen av marsvin för närvarande ett relativt smalt område av forskning och beskrivande data om särskild metod är på motsvarande knapp. De anatomiska funktioner i marsvin skiljer sig något från andra djurmodeller, därav modulering av urvalsmetoder för att rymma för artspecifika skillnader, t ex., Jämfört med möss och råttor, är nödvändiga för att få tillräckliga och högkvalitativa prover. Eftersom både lång och kort sikt in vivo-studier ofta kräver upprepade blodprover valet av teknik bör vara väl övervägas för att minska stress och obehag i djuren utan också för att säkerställa överlevnaden och överensstämmelse med kraven i provstorlek och tillgänglighet. Venblodprover kan erhållas från ett antal platser i marsvin t.ex.., Vena och halsvenenvener, varje teknik som innehåller både fördelar och nackdelar 4,5. Här presenterar vi fyra olika blodprovtagningsmetoder för antingen medvetna eller sövda marsvin. Procedurerna är alla icke-terminalförfaranden under förutsättning att provvolymer och antal prover inte överstiger riktlinjer för blodinsamling i försöksdjur 6. Alla de beskrivna metoderna är noggrant testade och tillämpas för upprepad in vivo provtagning blod i studier inom vår forskningsanläggning.
Introduction
Den marsvin är en värdefull och validerad experimentell djurmodell på grund av ett antal biologiska likheter med människan, såsom ett krav på kost tillförsel av C-vitamin, jämförbar plasma lipoprotein enzymer och lipoprotein profiler, samt delade likheter med människans placentation och prenatal utveckling 1-3,7,8. Detta gör marsvin en attraktiv och lämplig modell för att studera effekter av kost-associerade sjukdomar såsom alkoholfri fettlever, hjärt-kärlsjukdomar och förmodade effekter av C-vitaminbrist, men också effekten av t ex., Maternal dietary intervention på utvecklings avkomma.
Upprepad provtagning blod krävs ofta både lång och kort sikt in vivo-studier. På grund av artspecifika anatomiska skillnader modulering av provtagningsteknik som är nödvändigt för att erhålla blodprover hos marsvin jämfört med andra gnagarmodeller
Här presenterar vi fyra olika blodprovtagningsmetoder för antingen medvetna eller sövda marsvin. Den procedures är alla icke-terminalförfaranden under förutsättning att provvolymer och antal prover inte överstiger riktlinjer för blodinsamling i försöksdjur 6. Det är av intresse för god vetenskap samt för djurens välbefinnande att stress bör hållas till ett minimum. Följaktligen kan endast välutbildad och kompetent personal bör utföra djurförsök.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden som visas utfördes enligt protokoll som godkänts av den danska djurförsöksInspektionen under ministeriet för livsmedel, jordbruk och fiske.
1 Blodprovstagning från Lateral Saphenous eller Tarsal Vein
- Utför denna procedur utan bedövning och med hjälp av en utredare, en hantering av marsvin, och en insamling av provet.
- Raka böjd regionen i bakbenet med en elektrisk rakapparat tills venerna syns. Se till att området är tillräckligt stort för att undvika päls stör punkteringsstället.
- Placera bakben i ett ljummet vattenbad och försiktigt gnugga benet, vilket gör venerna mer vidgad och uppenbar.
- Torka av benet med en ren handduk och desinficera punktionsstället med gasbinda eller en bomullspinne fuktad med 70% alkohol.
- Hindra marsvin och utöka bakben nedåt medan ett lätt tryck omedelbart ovanför knäleden to tillhandahålla stas.
- Punktera venen med hjälp av en 21 G nål eller lansett. Samla blod ex. Genom användning av en samling eller kapillärrör. Manipulera försiktigt på benet för att hjälpa blodflödet.
- Släpp stasis, när provet har erhållits. Applicera en bit gasbinda eller bomull med lätt tryck på punktionsstället tills blödningen upphört.
- Tillbaka djuret till sin bur och monitor i 5-10 min för att säkerställa hemostas.
2 Blodprovstagning från öronvenen
- Utför denna procedur utan bedövning antingen ensam eller helst med hjälp av en kollega.
- Desinficera dorsala ytan av örat med hjälp av gasväv eller en bomullspinne fuktad med 70% alkohol.
- Tryck lätt på basen av örat för att ge stasis.
- Punktera venen med hjälp av en 21 G nål eller lansett, och samla blod.
- Släpp stasis, när provet har erhållits, Applicera en bit gasbinda eller bomull med GEntle tryck till punktionsstället tills blödningen upphört.
- Tillbaka djuret till sin bur och monitor i 5-10 min för att säkerställa hemostas.
3 Blodprovstagning från halsvenen
- Utför den här proceduren med hjälp av ytterligare en utredare; en hantering av marsvin och en insamling av provet.
- Bedöva marsvin med ett lämpligt bedövningsmedel för hela varaktigheten av detta förfarande. En blandning av tiletamin (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), xylazin (1,49 mg / kg) och butorfanol (0,06 mg / kg) kan användas.
- Placera den bedövade marsvin på rygg och försiktigt dra frambenen kaudalt.
- Raka och desinficera (t ex., Med 70% alkohol) den ventrala delen av halsen.
- Coat sprutan med antingen heparin eller EDTA före provtagningen för att minska risken för koagulering.
- Palpera nyckelbenet och sätt in en 25 G (eller 23 G) nål monterad på en 1 ml spruta approximately 1 cm lateralt om mittlinjen i nivå med axelleden. Förvara sprutan i en svagt uppåtgående och mediala vinkel samtidigt som en svagt undertryck. Undvik att skada underliggande strukturer som halsvenen ligger ganska ytlig. Vippa halsen marsvin något bakåt för att ge ökad stas av venen.
- Släpp frambenen när blodprovet som erhållits, och lindra stasis innan nålen dras tillbaka. Använd en torr bit gasbinda eller bomull för att tryck lätt på punktionsstället.
- Tillbaka djuret till en återhämtning bur och övervaka att säkra hemostas och återhämtning från anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fyra olika sätt att icke-terminala in vivo blodprovtagningstekniker i antingen medvetna eller sövda marsvin har presenterats. Figur 1 illustrerar loppet av den laterala vena och böjd ven i marsvin och möjliga injektionsställen. Öron vener synliga på den övre delen av ett marsvin öra illustreras i figur 2 Dessa vener kan användas för blodprovstagning då krävs endast en mycket liten volym. Placeringen av marsvin för jugular blodprov är show i figur 3. Kursen i halsvenen illustreras av pilarna med den översta pilen pekar på den rekommenderade punktionsstället.
Figur 1 Sido saphenous och böjd ven i marsvin. Bilden illustrerar kursen ochpunktionsstället för blodprovstagning från den laterala vena (övre pilen) eller böjd ven (nedre pilen) i marsvin.
Figur 2 Öron vener. Bilden illustrerar öron vener (pilar) synliga på den övre delen av ett marsvin öra. Dessa vener kan användas för blodprovstagning då krävs endast en mycket liten volym.
Figur 3 Placering av marsvin för hals provtagning ven blod. Detta illustrerar läget för marsvin och punktionsstället för hals provtagning ven blod. Pilarna indikerar loppet av jugularvenen med den översta pilen pekar mot den rekommenderade punktionsstället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med möss och råttor, marsvin är rädda av naturen och måste närma sig lugnt och hanteras på rätt sätt för att minska stress. Ur djurskyddssynpunkt, båda med omsorg är naturligtvis en prioritering; Men kommer detta också att minska risken för ångestrelaterade effekter på insamlade data t ex., förhöjda blodnivåer av kortikosteroider och glukos 12. På samma sätt kommer daglig hantering vänja djuren till normala rutiner och kan tjäna till att minska stressen ytterligare. Praktisk kunskap i en viss blodprovtagningsteknik skall förvärvas genom att först observera en erfaren operatör och därefter genomför tekniken under övervakning tills kompetens uppnås. Den valda tekniken ska helst både minska stress och obehag till ett minimum, men också för att säkerställa överlevnaden och överensstämmelse med kraven i provstorlek och tillgänglighet. För alla presenterade blodprovtagningsmetoder aseptisk teknik bör varaanvänds för att minimera risken för infektion och säkerställa insamling av icke kontaminerade prover.
De illustrerade metoder för blodprovtagning säkerställa överlevnaden av djuret under förutsättning att provvolym och frekvens uppnås enligt riktlinjer och kan alla användas för upprepad provtagning i både kort och lång sikt studier 6. Detta möjliggör enhetlig kontroll av enskilda djur över tid skall minska variansen och antalet inkluderade djur i enlighet med 3R-principen "(sänkning) 13,14. De tekniker som presenteras här har olika sortiment av erhållas provvolym (några pl upp till 1-2 ml) som bör beaktas innan inleds ett experiment. Även rutiner för insamling av blod från halsvenen i un-bedövades marsvin har beskrivits 12, rekommenderar vi starkt att använda narkos för att minska stress och obehag så mycket som möjligt. När detta sker, bör valet av anestesi vara försiktigy behandlas som noterar att marsvin är notoriskt svåra att söva och visa avsevärd variation effektivitet narkos samt en hög känslighet mot respiration depression 15,16. Som halsvenen hos marsvin varken syns eller påtaglig varje minskning av stasis / venös dilatation kan öka svårigheterna för provtagning, alltså det är allmänt rekommenderas för att undvika vaso-hållande agenter i anestesi-blandningar. . Vidare kända effekter av specifika bedövande medel som kan störa den önskade datainsamling t.ex. kardiovaskulära effekter och / eller ökade blodsockernivåer efter α 2 - bör agonist åtgärder på gnagare bedömas 16,17. Användning av inhalationsanestesi t.ex. isofluran kan också vara ett alternativ, men som intubation hos marsvin är en mycket svår uppgift försiktighet måste iakttas för att undvika störningar genom inandning-mask med huvud / halsläge då detta kan complicåt förfarandet onödigt. Gener anestesi ex., Genom inhalation krävs också för hjärtpunktion, som kan ge en större provvolym. Emellertid är hjärtpunk en terminal förfarande och därför inte tillämplig för upprepad provtagning och kommer inte att beskrivas ytterligare.
Eventuella negativa effekter såsom blödning, blåmärken, trombos, infektion och skrämmande kan uppstå efter punktering av en ven. I vår erfarenhet, inte marsvin inte uppvisa en ökad risk för sådana oönskade komplikationer jämfört med andra djurmodeller som att förfarandet sker enligt beskrivningen i den aktuella manuskriptet. Som halsvenen inte kan visualiseras från utsidan, är det mycket viktigt att lindra stasis innan nålen dras ut och att ge adekvat hemostas för att minimera risken för peri-venösa blödningar och blåmärken. I händelse av biverkningar skall behandlingen alltid sökas från ansvarig veterinarian. Med hänsyn till god djuromsorg och vetenskap, måste allvarliga överväganden tas till den kombinerade effekten av provvolym och frekvens och val av provtagningsteknik. Alla de beskrivna blodprovtagningsmetoder är noggrant testade och tillämpas för upprepad in vivo provtagning blod i studier inom vår forskningsanläggning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut. Samtliga förfaranden har godkänts av djurförsökslagen i Danmark, vilket är i överensstämmelse med Europarådets konvention ETS 123.
Acknowledgments
Vi erkänner skicklig hjälp av Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft och djur vaktmästare vid institutionen för experimentell medicin, Frederiksberg Campus, Fakulteten för Hälsa och medicinska vetenskaper, Köpenhamns universitet, Danmark. Jacob Lønholdt är tackade för hans utmärkta tekniskt bistånd filma förfarandena. Denna studie stöddes delvis av LIFEPHARM Centrum för in vivo farmakologi och Köpenhamns universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electric shaver | Wella (Contura), Denmark | 273207 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Syringes | B.Braun-Omnifix-F, Germany | 9161406V | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Needles | BD Microlance, Spain | 301156 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Microvette collection tube | Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany | 201,288,100 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Accu-Check analyzer | Roche A/S Diagnostics, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Heparin 5000 IE/ml | LEO Pharma, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Zoletil 50, Chemvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Neutral eye ointment | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Gauze or a cotton swab | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Disinfectant (70% alcohol) | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
References
- DeOgburn, R., et al. Effects of increased dietary cholesterol with carbohydrate restriction on hepatic lipid metabolism in Guinea pigs. Comp.Med. 62 (2), 109-115 (2012).
- Fernandez, M., Volek, J. S. Guinea pigs a suitable animal model to study lipoprotein metabolism, atherosclerosis and inflammation. Nutr Metab (Lond). 3 (17), (2006).
- Frikke-Schmidt, H., Tveden-Nyborg, P., Birck, M. M., Lykkesfeldt, J. High dietary fat and cholesterol exacerbates chronic vitamin C deficiency in guinea pigs. Br J Nutr. 105 (1), 54-61 (2011).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig, ferret and mink. Lab Anim. 32 (4), 364-368 (1998).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ye, P., Cheah, I. K., Halliwell, B. High fat diets and pathology in the guinea pig Atherosclerosis or liver damage. Biochim Biophys Acta. 1832 (2), 355-364 (2013).
- Tveden-Nyborg, P., et al. Maternal vitamin C deficiency during pregnancy persistently impairs hippocampal neurogenesis in offspring of guinea pigs. PLoS One. 7 (10), 12-18391 (2012).
- Schjoldager, J. G., Tveden-Nyborg, P., Lykkesfeldt, J. Prolonged maternal vitamin C deficiency overrides preferential fetal ascorbate transport but does not influence perinatal survival in guinea pigs. Br J Nutr. 110 (9), 1573-1579 (2013).
- Greulich, S., et al. Secretory products of guinea pig epicardial fat induce insulin resistance and impair primary adult rat cardiomyocyte function. J Cell Mol Med. 15 (11), 2399-2410 (2011).
- Swifka, J., Weiss, J., Addicks, K., Eckel, J., Rosen, P. Epicardial fat from guinea pig a model to study the paracrine network of interactions between epicardial fat and myocardium. Cardiovasc Drugs Ther. 22 (2), 107-114 (2008).
- Pilny, A. A. Clinical hematology of rodent species. Vet.Clin North Am Exot Anim Pract. 11 (3), 523-vii (2008).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Van, L. J., et al. eAssessing the application of the 3Rs a survey among animal welfare officers in The Netherlands. Lab Anim. 47 (3), 210-219 (2013).
- Sloan, R. C., et al. High doses of ketamine-xylazine anesthesia reduce cardiac ischemia-reperfusion injury in guinea pigs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (3), 349-354 (2011).
- Jacobson, C. A. A novel anaesthetic regimen for surgical procedures in guinea pigs. Lab Anim. 35 (3), 271-276 (2001).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine xylazine anesthesia in rats mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med(Maywood). 230 (10), 777-784 (2005).
