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Immunology and Infection

Préparation d'une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

Une préparation de culot bactérien rapide à partir d'une culture de sang positif peut être utilisé comme échantillon pour des applications telles que l'identification par MALDI-TOF, la coloration de Gram, les tests de sensibilité aux antibiotiques et le test basé sur la PCR. Les résultats peuvent être transmis rapidement aux cliniciens pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections du courant sanguin.

Abstract

Les bactériémies et septicémie sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Le succès des patients atteints de bactériémie dépend de l'identification rapide de l'agent infectieux pour guider le traitement antibiotique optimal. L'analyse de la coloration de Gram de la culture de sang positive peut être réalisée rapidement et déjà d'impact significatif sur le traitement antibiotique. Cependant, l'identification précise de l'agent infectieux est toujours nécessaire pour établir le traitement optimal ciblée. Nous présentons ici une préparation de culot bactérien simple et rapide à partir d'une hémoculture positive qui peut être utilisé comme un échantillon de plusieurs applications essentielles en aval telles que l'identification par MALDI-TOF MS, les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) par méthode de diffusion sur disque ou systèmes AST automatisés et par PCR automatisé à base de tests de diagnostic. La performance de ces systèmes d'identification et AST différentes appliquées directement sur les culots bactériens d'hémoculture est très similar à la performance s'obtient normalement à partir des colonies isolées cultivées sur des plaques d'agar-agar. Par rapport aux approches conventionnelles, l'acquisition rapide d'un culot bactérien réduit considérablement le temps de signaler la fois l'identification et AST. Ainsi, suite à sang positivité de la culture, de l'identification par MALDI-TOF peut être signalée en moins de 1 heure alors que les résultats d'AST par des systèmes AST automatisés ou des essais de diffusion de disque dans les 8 à 18 heures, respectivement. De même, les résultats d'un test rapide basé sur la PCR peuvent être communiqués aux cliniciens moins de 2 heures suivant le rapport d'une bactériémie. Ensemble, ces résultats démontrent que la préparation rapide d'un culot bactérien de la culture du sang a un impact significatif sur le temps d'identification et AST redressement et donc sur le succès de patients souffrant d'infections de la circulation sanguine.

Introduction

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Les bactériémies et septicémie chez les patients hospitalisés sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Ainsi, la mortalité liée à la circulation sanguine infections est observée chez environ 14% à 37% des patients hospitalisés et peut augmenter de 35% en unités de soins intensifs des patients 1-3. L'identification rapide de l'agent infectieux est essentiel pour guider le traitement optimal des antimicrobiens et à accroître le succès de la thérapie antimicrobienne 4,5. L'analyse rapide de la coloration de Gram de hémoculture positive a déjà un impact significatif sur l'adaptation de la thérapie antimicrobienne 6,7 mais l'identification précise de l'agent infectieux est nécessaire pour fournir le traitement antibiotique le mieux adapté aux patients. Par exemple, les différents régimes de traitement antibiotique doivent être mis en œuvre suivant une bactériémie avec les entérocoques et les streptocoques qui sont difficiles à distinguer par la coloration de Gram. De même, l'identification à l'espèce Level est nécessaire pour détecter les entérobactéries Gram négatif ampC codant pour un gène chromosomique qui confère une résistance accrue aux β-lactames 8.

Avec une hémoculture positive, l'approche diagnostique classique consiste à repiquer l'agent infectieux sur différentes plaques d'agar, qui nécessite plusieurs heures d'incubation supplémentaire identification préalable avec diverses approches, y compris des tests biochimiques, la croissance sur différents milieux sélectifs et les systèmes d'identification microbienne automatisés. Le temps les résultats d'une approche diagnostique classique est d'environ 1 à 3 jours.

L'émergence de la technologie désorption laser assistée par matrice / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF) pour l'identification rapide des micro-organismes a fourni un nouvel outil pour identifier rapidement les micro-organismes de colonies cultivées sur des plaques d'agar-agar, mais aussi directement à partir de sang positif cultures (Figure 1) 9-12. Thl'utilisation de l'e de MALDI-TOF d'identifier un agent infectieux à partir d'hémocultures a considérablement réduit le temps aux résultats de quelques minutes au lieu des heures et des jours requis par les méthodes traditionnelles. Comme on le verra par Croxatto et al. 13, l'efficacité de l'identification MALDI-TOF repose sur différents paramètres, y compris la pureté et la quantité du micro-organisme. Ces deux critères sont facilement obtenus à partir des colonies distinctes cultivées sur des plaques d'agar mais nécessaire un traitement pré-analytique pour l'enrichissement bactérienne et purification à partir d'échantillons complexes tels que la culture de sang, qui contiennent plusieurs composants cellulaires et des protéines qui peuvent interférer avec identification MALDI-TOF.

Les méthodes d'isolement de divers micro-organismes de culture de sang ont été utilisés dans un certain nombre d'études, y compris la saponine ou une autre méthode de détergents doux pour l'extraction bactérienne 9,14, méthode de séparation de sérum 10, la lyse des méthodes de centrifugation 12 (figure 2) 15. Cette préparation de pastilles hémoculture également fournir un échantillon pour d'autres applications directes en aval tels que la coloration de Gram, tests de diagnostic basés sur la PCR automatisées telles que POCT-PCR pour la détection rapide de résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM) et les tests de sensibilité aux antibiotiques des Les systèmes automatisés d'AST et / ou par des essais de diffusion de disque sur plaques d'agar-agar (figure 3).

Dans ce travail, nous décrivons les différentes étapes de la préparation du culot bactérien sang-culture, comme expliqué par Prod'hom et al. 15 (figure 4). Nous allons également déscribe les protocoles pour trois des principales applications qui peuvent être exécutées sur le culot de la culture de sang: Identification par MALDI-TOF 15, l'identification (ID) et les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) avec les systèmes automatisés 16 pour les entérobactéries et les staphylocoques et PCR automatisé test diagnostique pour la détection du SARM 17.

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Protocol

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Ce protocole a été développé et validé en suivant les processus de recherche et développement et les règles éthiques de notre institution avant d'être mis en œuvre comme un outil de routine.

1 Préparation d'une culture bactérienne du sang Pellet par ammonium procédure chlorure érythrocytes-lyse

  1. Préparation d'une hémoculture positive pour la centrifugation ultérieure.
    1. Stériliser le bouchon de culture de sang. Ajouter 70% d'éthanol sur le bouchon de la bouteille et de le brûler.
      NOTE: Ne pas effectuer cette étape sous une hotte à flux laminaire.
    2. Déplacer la bouteille à une hotte à flux laminaire. Recueillir 5 ml de la culture de sang avec une seringue de 20 G.
    3. Ajouter 5 ml de la culture de sang dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 45 ml d'eau stérile (H 2 O) et de mélanger l'échantillon.
  2. Préparation d'une culture de sang par lyse culot bactérien centrifugation.
    1. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min à température ambiante.
    2. Remove du surnageant (qui contient principalement du H 2 O et de cellules sanguines) avec une pompe à vide de laboratoire.
    3. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de chlorure d'ammonium artisanale solution (0,15 M de NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3) de lyse. Décomposer le culot par grattage et au vortex et centrifuger le tube de l'échantillon à 140 xg pendant 10 min à température ambiante.
    4. Jeter le surnageant qui contient principalement les globules rouges débris.
      1. Si la pastille est restée hémorragique, remettre en suspension le culot dans 2 ml d'eau stérile distillée et 2 0 en outre à lyser les globules rouges résiduels et laver le culot. Centrifuger l'échantillon à 140 g pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
    5. Remettre en suspension le culot dans 200 pl de H 2 O
  3. Subculture de culture de sang sur divers milieux de gélose sélective et non sélective.
    1. Prélever 1 ml de la culture de sang avec une seringue de 20 G.
    2. Inoculer une goutte de culture de sang into quatre quadrants sur gélose au sang, une gélose au chocolat, de l'agar agar et Schaedler McConkey.
    3. Incuber à 37 ° C, la gélose au sang et des plaques d'agar au chocolat dans une atmosphère de CO2 à 5%, la gélose de McConkey dans une atmosphère normale, et la plaque de gélose Schaedler dans des conditions anaérobies.
    4. Suivez la croissance bactérienne sur les différents médias.
    5. Vérifier la pureté bactérienne.

2 Identification par MALDI-TOF MS

  1. L'identification directe à partir du culot de sang.
    1. Transfert 1 pl de la pastille de sang sur une plaque cible MALDI et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C.
    2. Superposer l'échantillon avec de l'acide formique 1 ul de 70% et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C.
    3. Superposer l'échantillon avec 1 pl de matrice MALDI et laisser sécher sur une plate-forme C 42 ° chauffage (solution de α-cyano-4-hydroxycinnamique dans 50% d'acétonitrile-2.5% d'acide trifluoroacétique saturé).
    4. Passez à la MALDI-TOF MS avec un système MALDI-TOF MS comme décrit par les fabricants.
    5. Si le score d'identification est valide au niveau de l'espèce (par exemple, avec un score <2), effectuer une extraction de protéines de l'échantillon de granulés dans le sang.
  2. Identification de la protéine après extraction du culot de la culture de sang.
    1. Mélanger 20 ul de la pastille avec 1 ml d'éthanol à 70% et centrifugation à 13 000 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
    2. Jeter le surnageant et ajouter 25 ul d'acide formique à 70% et 25 ul de 100% d'acétonitrile à la pastille. Vortex vigoureusement pour remettre en suspension les culots. Remettre en suspension granulés difficiles en les décomposant avec des embouts de pipette avant vortex.
    3. Centrifuger à 13 000 g pendant 2 min à température ambiante. Transfert 1 pi du surnageant (qui contiennent des protéines extraites) sur une plaque cible MALDI et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C. Procédez comme décrit dans le paragraphe 2.1.2.

3. bactérienne Identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques avec un système automatisé microbienne

  1. Préparation d'une suspension bactérienne d'identification bactérienne et AST avec un système automatisé microbienne.
    1. Préparer un tube en matière plastique contenant 3 ml de solution stérile de NaCl à 0,45% compatible avec le système automatisé microbienne.
    2. Ajouter une quantité suffisante de la culture de culot de sang dans la solution de NaCl à 0,45% pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8. Mesure de la turbidité en utilisant un appareil à densitomètre.
      NOTE: Le volume du culot bactérien de la culture de sang varie de 50 à 200 pl pour obtenir une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8.
  2. Inoculer les bactéries Gram-positif (GP) ou Gram-négatif (GN) cartes automatisés d'identification et les cartes AST automatisés pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens des Cocci Gram-positives et Gram-négatives bactéries comme décrit par le fabricant.
    REMARQUE: identification avec GP ou cartes GN n'est pas appliquée si MALDI-TOF MS valeur du score d'identification est> 2. Vérifier la pureté de la suspension bactérienne par repiquage la suspension bactérienne sur gélose au sang (GP et GN) et la gélose Mac Conkey (GN) plaques.

4 essais de sensibilité aux antibiotiques par disque Diffusion Assay

Le test de diffusion sur disque est décrit par le Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST, Version 3.0, Avril 2013, www.eucast.org).

  1. Préparation d'une suspension bactérienne à effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens par un essai de diffusion de disques.
    1. Préparer un tube en verre contenant 3 ml de solution stérile de NaCl à 0,9%.
    2. Ajouter une quantité suffisante de la culture de culot de sang dans la solution de NaCl à 0,9% pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité de 0,5 McFarland. Mesure de la turbidité en utilisant un appareil à densitomètre.
      REMARQUE: Le volume de la culture de sangculot bactérien varie de 50 à 200 pl pour obtenir une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8.
    3. Vortex la suspension bactérienne.
  2. L'inoculation de la suspension bactérienne sur de la gélose de Mueller-Hinton (MH) ou Mueller-Hinton agar agar organismes-fastidieuse (MHF) (MH supplémenté avec 5% de sang de cheval défibriné et 20 mg / L de β-nicotinamide adénine dinucléotide).
    1. Trempez un coton-tige stérile dans la suspension bactérienne et retirez délicatement l'excès de liquide en tournant la tige sur la paroi interne du tube de verre.
    2. Etaler la suspension bactérienne de façon égale sur toute la surface de la plaque de gélose MH / MHF par écouvillonnage ou dans trois directions à l'aide d'un rotateur de plaque automatisé.
  3. Application des disques antimicrobiens sur des plaques de gélose ensemencées.
    1. Appliquer près les disques sur la surface des plaques de gélose ensemencées séchées manuellement ou à l'aide d'un distributeur de sensibilité sur disque.
    2. Incuber la plaque à la tempe appropriérature et de l'atmosphère, comme décrit dans la méthode de diffusion EUCAST disque de test de sensibilité aux antimicrobiens (Version 3.0, Avril 2013, www.eucast.org).

5. automatisé PCR à base de test de diagnostic pour la détection de SARM

  1. Utilisation d'une micro-pipette, transférer 50 pi de la pastille de culture de sang dans le flacon de réactif d'échantillon fourni avec le kit SARM automatisé de test de diagnostic basé sur la PCR et vortex pendant 20 s.
  2. L'utilisation d'une micropipette de 1 ml, distribuer l'échantillon dans l'orifice d'échantillon de la cartouche. Insérez la cartouche dans le système PCR automatisé et commencer le dosage comme décrit par le fabricant.

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Representative Results

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Dans l'étude effectuée par Prod'hom et al. 15, culots bactériens obtenus par lyse de chlorure d'ammonium centrifugation de 122 hémoculture positive à partir de 78 patients ont été analysés par MALDI-TOF MS. Sur 122 hémoculture positive, 95 (77,9%) ont été correctement identifiés au niveau de l'espèce et un (0,8%) au niveau du genre. Les 26 (21,3%) des pastilles d'hémoculture restants n'ont donné aucune identification fiable par MALDI-TOF. Parmi ceux-ci, 21 sont des bactéries Gram positives, y compris les streptocoques et 13 5 staphylocoques à coagulase négative. Surtout, 10 des 13 streptocoques non identifié étaient Streptococcus pneumoniae qui possèdent souvent une capsule difficile à lyse et ne sont guère distingués des espèces de la S. groupe mitis MALDI-TOF MS. Cinq des bactéries Gram-négatives ne sont pas identifiées par MALDI-TOF, parmi lesquels quatre difficiles à lyser les espèces bactériennes encapsulées comprenant deux Klebsiella pneumoniae et deux Haemophile influenzae. Ainsi, l'identification correcte par MALDI-TOF a été obtenue dans 78,7% des granulés de la culture de sang, ce qui représente un rendement efficace par rapport à l'identification de 84,1% obtenu à partir d'identification classique de colonies bactériennes cultivées sur des plaques de gélose 11.

Le fonctionnement du système automatisé pour l'identification microbienne bactérienne (ID) et de l'AST a été testé sur 278 culots bactériens de culture sanguine positive cocci à Gram positif en amas et les bactéries à Gram négatif. Ces résultats ont été comparés aux résultats classiques obtenus avec les cartes du système microbiennes automatisés de colonies cultivées sur des plaques d'agar suivants sous-culture de la culture de sang positive sur les médias appropriés 16. Identification microbienne directe utilisant des cartes d'identité du système d'identification peut être utilisé lors de l'identification du culot bactérien par MALDI-TOF MS a échoué. Par rapport à une identification finale par MALDI-TOF MS, avec une identification correctemicrobiennes cartes d'identité du système d'identification a été observée dans 99% des Enterobacteriaceae, 74% de staphylocoques, 71% des bactéries à Gram négatif non fermentaires et 33% des autres cocci Gram-positif. Une erreur d'identification a été observée dans 11% des cas totaux alors que 8% des culots bactériens a pas d'identification. Un total de 220 ​​pastilles bactériennes, y compris 87 133 entérobactéries et les staphylocoques ont été analysés pour AST avec le système microbienne automatisée AST GN26 et AST 580 cartes 16. Les résultats ont été analysés selon les définitions données par la US Food and Drug Administration (FDA) des résultats de l'accord d'interprétation, qui a défini une fausse sensibles comme une erreur très importante (VME) et un faux résistant comme une erreur majeure (ME). AST obtenu à partir de l'inoculation directe de la culture de sang granulés par rapport à l'inoculation de colonies cultivées sur des plaques d'agar-agar a montré 0,1% VME et 0,3% ME pour les entérobactéries, et 0,7% VME et 0,1 ME% pour les staphylocoques. Ainsi, le rendement de l'ASTcartes inoculées directement avec le sang des pastilles de culture sont en accord avec les critères de performance reconnus par la FDA.

La performance du test de SARM technologie d'amplification de l'acide nucléique par PCR ciblant le spa, mecA et gènes CCN a été appliquée directement sur ​​Staphylococcus aureus hémoculture culots bactériens identifiés par MALDI-TOF MS 17. Sur la base de 106 cas, la détection de la résistance à la méthicilline a montré une sensibilité de 99% et une spécificité de 100%. Fait intéressant, la durée médiane de signaler les nucléiques résultats de la technologie d'amplification de l'acide de la culture de sang positivité était égal à 201 min (gamme 100-430), tandis que la durée médiane de l'identification MALDI-TOF de rapporter des résultats semblables était égal à 97 min (plage 25 250).

Figure 1
Figure 1: pré et post-MALDI-TOF ère. Comparativement aux approches conventionnelles de diagnostic qui comprennent un O / N sous-culture de l'échantillon, l'identification MALDI-TOF MS peut être réalisée en quelques minutes qui suivent la livraison des échantillons au laboratoire de diagnostic. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Flux de traitement de sang à partir de la culture de prélèvement identification MALDI-TOF MS. Lorsque les cultures de sang sont positifs, un culot bactérien est préparée par lyse de chlorure d'ammonium par centrifugation. Ce culot bactérien est ensuite utilisé pour l'identification directe par MALDI-TOF MS. Identification MALDI-TOF MS peut être obtenu dans les 30 à 60 min fo llowing hémoculture positivité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Beaucoup d'applications en aval y compris la coloration de Gram, MALDI-TOF identification MS, AST en utilisant des systèmes automatisés et / ou des essais de diffusion de disque et le test rapide basé sur la PCR telles que le point de PCR de dépistage de soins (POCT-PCR) pour la détection du SARM peut être effectuée directement sur ​​le culot bactérien de la culture de sang. évaluation directe des bactéries pastilles d'hémoculture diminuer considérablement le temps de demi-tour pour signaler ID et AST résultats qui est essentiel pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections de la circulation sanguine. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Le protocole de lyse de centrifugation de chlorure d'ammonium permet la préparation d'un culot bactérien enrichie et purifiée à partir de bouillons de culture de sang positifs. Coloration de Gram d'hémoculture positive de Escherichia coli, Staphylococcus à coagulase négative capitis et Streptococcus dysgalactiae effectuée avant et après la préparation de la culture de sang de culot bactérien. Les morphologies classiques de staphylocoques et de streptocoques en grappes dans les chaînes sont plus facilement observés dans le bouillon de culture de sang indigène que dans le culot bactérien de la culture de sang. Barre d'échelle = 25 um.= "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Par rapport aux approches diagnostiques d'hémoculture positifs classiques, l'acquisition rapide d'un culot bactérien en utilisant le chlorure lyse approche de centrifugation d'ammonium réduire le temps de signaler l'identification de 16 à 24 heures et le temps de signaler AST de 24 à 48 h (figures 1 et 3).

Introduction rapide d'une antibiothérapie appropriée est essentielle pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections de la circulation sanguine. Ainsi, l'identification précoce des agents infectieux dans 1 heure suivie d'une AST rapide obtenu en environ 8 à 16 heures représente un impact majeur dans la prise en charge clinique des patients septiques. La déclaration rapide de la coloration de Gram a déjà été associée à un grand impact sur ​​la thérapie antimicrobienne et donc à une diminution de la morbidité et de la mortalité des patients 6,7. La coloration de Gram du culot bactérien de la culture dans le sang peut être effectué pour augmenter la sensibilité lors de la coloration de Gram du blood bouillon de culture est négatif ou faiblement positif (Figure 4). Cependant, la coloration de Gram effectuée sur le bouillon de culture de sang natif est recommandé d'observer les morphologies typiques telles que les staphylocoques ou les streptocoques en grappes dans les chaînes. Dans une récente étude prospective réalisée sur 202 cas d'infection sanguine, l'identification de sang pastilles de culture MALDI-TOF MS a montré un impact en antibiothérapie dans 35,1% des cas alors que la coloration de Gram a seulement un impact supplémentaire dans 20% des cas 8. Fait intéressant, la différence maximale entre l'impact de la coloration de Gram et MALDI-TOF MS des rapports d'identification pour la gestion clinique a été observée lorsque les bactéries associées à une augmentation de la résistance aux antibiotiques tels que AmpC entérobactéries productrices ont été identifiées par MALDI-TOF MS. De même, Martiny et al. Ont montré que MALDI-TOF MS identification rapide peut fixer l'adaptation de l'antibiothérapie dans 13,4% des cas, alors un montant rétroactify effectuée par Stoneking et al. suggère une identification rapide des micro-organismes provoquant la bactériémie peut aider à ajuster la thérapie empirique dans 77% des cas, soit par l'administration d'un antibiotique supplémentaire non recouverte par le premier régime, soit en réduisant le spectre des antibiotiques 18,19 . De plus, l'utilisation d'un dosage à base de PCR rapide tel que le SARM de la technologie d'amplification d'acide nucléique suivant S. identification aureus par MALDI-TOF MS à partir de pastilles d'hémoculture a permis de fournir la thérapie antibiotique le plus approprié en moins de 4 heures pour les patients souffrant de S. aureus bactériémie 17. Si l'on exclut les patients atteints d'allergie à la pénicilline, l'utilisation de la technologie d'amplification de l'acide nucléique SARM permis une réduction significative de l'anti-SARM antibiotiques abus tels que les glycopeptides de 26,1% à 8,1%. Ensemble, ces données suggèrent que les rapports séquentielle rapide de la coloration de Gram, identification MALDI-TOF MS et rapide basée sur la PCR uneéssayé de pastilles d'hémoculture s'améliorent de façon significative le traitement antibiotique et donc la prise en charge clinique ainsi que les résultats des patients souffrant d'infections de la circulation sanguine.

MALDI-TOF MS a permis une identification correcte de 78,7% de sang pastilles de culture, ce qui est une très bonne performance par rapport à un taux d'identification de 84,1% obtenu par conventionnelle MALDI-TOF MS effectuée sur des colonies pures cultivées sur des plaques d'agar-agar. Plus que 50% des infections sanguines sont causées par des espèces bactériennes, telles que les entérobactéries, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et les entérocoques. Ces bactéries sont efficacement identifiés par MALDI-TOF MS qui a probablement une influence positive sur la bonne performance de l'identification MALDI-TOF MS effectué directement sur hémoculture culots bactériens. La faible performance pour l'identification de certaines espèces bactériennes par MALDI-TOF MS effectuée sur le sang des pastilles de culture est principalement due à des facteurs similairesque celles observées pour l'identification classique de colonies pures cultivées sur des plaques de gélose. Par exemple, de nombreuses espèces microbiennes telles que les streptocoques appartenant au groupe mitis et staphylocoques coagulase-négatifs sont étroitement liés et identifié avec une faible précision par MALDI-TOF MS. En outre, une composition particulière de la paroi cellulaire bactérienne de bactéries à Gram positif ou à la présence d'une capsule dense observé chez des espèces bactériennes telles que Klebsiella pneumoniae diminuent de façon significative l'efficacité de lyse et donc les performances de l'identification MALDI-TOF MS. Enfin, le faible rendement de MALDI-TOF MS pour l'identification de bactéries anaérobies est principalement due à une mauvaise représentation incomplète et de ces bactéries dans la base de données de type MALDI-TOF.

La faible réduction de la performance de l'identification MALDI-TOF MS à partir de pastilles de culture de sang par rapport à l'identification de colonies pures conventionnel peut être due à la protéine dans le sang résiduel composantes ou à une quantité insuffisante de lyse des bactéries obtenues après centrifugation. De même, les différences observées avec les cartes du système microbiennes automatisés inoculées directement avec des pastilles de culture de sang par rapport à ceux inoculés avec les colonies isolées peuvent être provoquées par le sang résiduel des composants de la culture, tels que des protéines, des cellules sanguines et des composés de milieu de sang qui peuvent interférer avec la croissance des bactéries dans l' automatisé des cartes du système microbienne et peut avoir un impact significatif tant sur l'identification et AST. En outre, les résultats de l'AST obtenus par les systèmes microbiens automatisés doivent être vérifiées par des essais de diffusion sur disque également effectuées directement sur hémoculture culots bactériens pour valider les résultats de certains antibiotiques connus pour présenter des écarts importants par rapport aux approches conventionnelles. Toutefois, l'inoculation directe des cartes du système microbiennes automatisés avec des pastilles de culture de sang présente une excellente ID et AST les performances de entérobactéries et staphylococci.

Ainsi, le culot bactérien obtenu par le chlorure d'ammonium lyse centrifugation des hémocultures positives a été validé à exécuter directement plusieurs applications en aval permettant une communication rapide des résultats essentiels tels que ID et AST dans un TAT significativement réduite par rapport aux approches conventionnelles. De plus, des applications supplémentaires telles que β-lactamases à spectre étendu tests (BLSE) ont été validées sur la lyse similaire centrifugation de hémoculture positive Méthodologies 20 ce qui suggère qu'ils pourraient également être appliquées sur le culot bactérien obtenu avec le protocole décrit dans ce travail.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions les techniciens du laboratoire de bactériologie du CHU de Lausanne pour leur aide à la mise en œuvre des techniques de laboratoire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques
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Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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