Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

הכנת גלולה חיידקים מהירה מתרבית דם חיובית יכולה לשמש כמדגם עבור יישומים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF, צביעת גראם, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת PCR מבוססת. התוצאות ניתן להעביר במהירות לרופאים כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

Abstract

זיהומים ואלח דם דם הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. התוצאה המוצלחת של חולים הסובלים מבקטרמיה תלויה בזיהוי מהיר של הגורם המדבק להנחות טיפול אנטיביוטי אופטימלי. הניתוח של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יכול להתנהל במהירות וכבר להשפיע על המשטר האנטיביוטי באופן משמעותי. עם זאת, זיהוי מדויק של הגורם המדבק עדיין יידרש לקבוע את הטיפול האופטימלי ממוקד. אנו מציגים כאן הכנת גלולה חיידקים פשוטה ומהירה מתרבית דם חיובית שיכול לשמש כדוגמה לכמה יישומים במורד הזרם חיוניים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF MS, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי assay דיפוזיה דיסק או מערכות AST אוטומטיות ועל ידי אוטומטי PCR מבוסס בדיקות אבחון. הביצועים של מערכות זיהוי וAST אלה שונים מיושמים ישירות על כדורי חיידקי תרבית הדם הוא מאוד siמילר לביצועים בדרך כלל מתקבל ממושבות מבודדות גדלו על צלחות אגר. בהשוואה לגישות קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן כדי לדווח על זיהוי שני וAST. לפיכך, החיוביות הבאה דם התרבות, זיהוי על ידי MALDI-TOF ניתן לדווח בתוך שעה פחות מ 1 ואילו תוצאות של AST ידי מערכות AST אוטומטיים או מבחני דיפוזיה הדיסק בתוך 8 עד 18 שעות, בהתאמה. באופן דומה, התוצאות של assay PCR מבוסס מהיר ניתן להעביר לרופאים פחות משעה 2 בעקבות הדו"ח של בקטרמיה. יחד, תוצאות אלו מראות כי ההכנה המהירה של גלולה חיידקי תרבית דם יש השפעה משמעותית על זמן זיהוי ותפנית AST ובכך על התוצאות המוצלחות של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זיהומים בדם ואלח דם בחולים מאושפזים הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. כך, תמותה הקשורים לזרם דם זיהומים הוא ציין ב% על 14 ל37% ממטופל מאושפז ועלולה להגביר 35% ביחידות לטיפול נמרצים לחולי 1-3. זיהוי המהיר של הגורם המדבק הוא מרכזי שינחה את טיפול מיקרוביאלית אופטימלי ולהגדיל את התוצאה המוצלחת של 4,5 טיפול האנטיביוטי. הניתוח המהיר של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יש כבר השפעה משמעותית על ההסתגלות של טיפול האנטיביוטי 6,7 אבל זיהוי מדויק של הגורם המדבק נדרש לספק הטיפול האנטיביוטי המותאם הטוב ביותר לחולים. למשל, משטרי טיפול אנטיביוטי שונים צריכים להיות מיושמים, לאחר בקטרמיה עם Enterococci וסטרפטוקוקוס שקשה להבחין על ידי צביעת גראם. באופן דומה, זיהוי במיני לבאל דרוש כדי לאתר enterobacteria השלילי גרם קידוד גן ampC כרומוזומליות מקנות התנגדות מוגברת לβ-lactams 8.

עם תרבית דם חיובית, הגישה לאבחון הקונבנציונלית היא תת הגורם המדבק על צלחות אגר שונות, אשר דורש כמה שעות של זיהוי לפני דגירה נוספת עם גישות שונות, כוללים בדיקות ביוכימיות, צמיחה בתקשורת סלקטיבית שונה ומערכות זיהוי חיידקים אוטומטיות. הזמן לתוצאות של גישת אבחון קונבנציונלית הוא של כ 1 עד 3 ימים.

הופעתה של טכנולוגית הלייזר desorption בסיוע מטריקס / ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסת יינון (MALDI-TOF) לזיהוי מהיר של מיקרואורגניזמים סיפקה כלי חדש כדי לזהות במהירות מיקרואורגניזמים ממושבות גדלו על צלחות אגר אלא גם ישירות מהדם חיובי תרבויות (איור 1) 9-12. השימוש בדואר של MALDI-TOF לזהות גורם מזהם מתרביות דם צמצם באופן משמעותי את הזמן לתוצאות לכמה דקות במקום שעות וימים הנדרשים על ידי שיטות מסורתיות. כפי שנאמר על ידי Croxatto et al. 13, את היעילות של זיהוי MALDI-TOF מסתמכת על פרמטרים שונים כולל טוהר של מיקרואורגניזם וכמות. שני קריטריונים אלו מתקבלים בקלות ממושבות דיסקרטיות גדלו על צלחות אגר אבל נדרשו טיפול קדם אנליטיים להעשרת חיידקים וטיהור מדגימות מורכבות כגון תרבות דם, אשר מכילות מרכיבים תאיים וחלבון מרובים שעלולים להפריע לזיהוי MALDI-TOF.

שיטות צנטריפוגה שיטות בידוד מיקרואורגניזמים שונים מתרבות דם כבר בשימוש במספר המחקרים כולל saponin או שיטת חומרי ניקוי עדין אחרת להפקת חיידקים 9,14, שיטה מפריד בסרום 10, תמוגה 12 (איור 2) 15. הכנת גלולה דם תרבות זו גם מספקת לדוגמה עבור יישומים במורד הזרם ישירים אחרים כגון צביעת גראם, בדיקות אבחון המבוססת על PCR אוטומטיים כגון POCT-PCRs לזיהוי המהיר של methicillin עמיד Staphyloccocus aureus (MRSA), ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה עם מערכות אוטומטיות AST ו / או על ידי מבחני דיפוזיה דיסק על צלחות אגר (איור 3).

בעבודה זו, אנו מתארים את השלבים השונים של הכנת גלולה חיידקים בדם התרבות כפי שהוסבר על ידי Prod'hom et al. 15 (איור 4). אנו גם דהסופר הפרוטוקולים עבור שלושה היישומים העיקריים שיכול להתבצע על גלולה תרבות דם: זיהוי על ידי 15 MALDI-TOF, זיהוי (ID) ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) עם המערכות האוטומטיות 16 לEnterobacteriaceae וstaphylococci וPCR- האוטומטי בדיקת אבחון המבוסס על זיהוי של MRSA 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה פותח ומאומתים הבא תהליכי המחקר ופיתוח וכללי אתיקה של המוסד שלנו לפני שמיושם ככלי שגרתי.

.1 הכנת תרבות הדם בקטריאלי גלולה ידי נוהל כלוריד כדורית אדומה-lysing אמוניום

  1. הכנת תרבית דם חיובית לצנטריפוגה שלאחר מכן.
    1. לעקר את כובע תרבית דם. הוספת 70% אתנול בכובע של הבקבוק ולשרוף אותו.
      הערה: אל תבצע את הצעד הזה תחת הזרימה למינרית.
    2. הזז את הבקבוק לזרימה למינרית. לאסוף 5 מ"ל של תרבית הדם עם מזרק 20 G.
    3. הוסף 5 מ"ל של תרבית דם בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל מכיל 45 מ"ל של מים סטריליים (H 2 O) ולערבב את המדגם.
  2. הכנה של גלולה חיידקי תרבית דם על ידי צנטריפוגה תמוגה.
    1. צנטריפוגה המדגם XG ב 1000 ל10 דקות ב RT.
    2. רמוve supernatant (המכיל בעיקר H 2 O ותאי דם) עם משאבת ואקום מעבדה.
    3. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של אמוניום כלוריד תוצרת הבית lysing פתרון (0.15 M NH 4 Cl, 1 מ"מ KHCO 3). לשבור את הכדור על ידי גירוד ועל ידי vortexing הצינור צנטריפוגות המדגם ב140 XG ל10 דקות ב RT.
    4. בטל supernatant שמכיל בעיקר תאי דם אדומים פסולת.
      1. אם גלולה נותרה מדממת, resuspend גלולה ב2 מ"ל של H סטרילי והמזוקק 2 0 עד lyse נוסף תאי דם אדומים שיורית ולשטוף את הכדור. צנטריפוגה המדגם ב140 XG 10 דקות ב RT וזורקים supernatant.
    5. Resuspend גלולה ב200 μl של H 2 O
  3. תת תרבות דם על תקשורת אגר סלקטיבי ולא סלקטיבי שונים.
    1. לאסוף 1 מ"ל של תרבית הדם עם מזרק 20 G.
    2. לחסן 1 טיפה של int תרבות הדםo ארבעה רבעים על אגר דם, אגר שוקולד, אגר McConkey ואגר Schaedler.
    3. לדגור על 37 ° C אגר הדם וצלחות אגר שוקולד באווירה 5% CO 2, אגר McConkey באווירה רגילה והצלחת אגר Schaedler בתנאים אנאירוביים.
    4. עקוב צמיחת חיידקים על מדיה שונה.
    5. הגעה לטוהר חיידקים.

.2 זיהוי על ידי MALDI-TOF MS

  1. זיהוי ישיר מגלולת הדם.
    1. העברת 1 μl של גלולה הדם על צלחת יעד MALDI ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס.
    2. כיסוי המדגם עם 1 μl 70% חומצה פורמית ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס.
    3. כיסוי המדגם עם 1 μl של מטריצת MALDI (רווי פתרון של α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה ב50% אצטוניטריל-2.5% חומצת trifluoroacetic) ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס.
    4. המשך MALניתוח DI-TOF MS עם מערכת MALDI-TOF MS כפי שתואר על ידי היצרנים.
    5. אם ציון ההזדהות אינו חוקי, ברמת המין (למשל עם ציון <2), לבצע הפקת חלבון של מדגם גלולה דם.
  2. זיהוי לאחר מיצוי חלבון מגלולת תרבות דם.
    1. מערבבים 20 μl של גלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב XG 13,000 עבור 2 דקות ב RT.
    2. בטל supernatant ולהוסיף 25 μl של 70% חומצה פורמית ו25 μl של אצטוניטריל 100% לגלולה. וורטקס במרץ לresuspend את כדורים. Resuspend כדורים קשים על ידי פירוקם עם טיפים פיפטה לפני vortexing.
    3. צנטריפוגה ב13,000 XG למשך 2 דקות ב RT. העברת 1 μl של supernatant (המכיל חלבונים המופקים) על צלחת יעד MALDI ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס. המשך כמתואר ב2.1.2.

.3 בקטריאלי Identification ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה עם אוטומטית של מערכת מיקרוביאלית

  1. הכנת השעיה חיידקים לזיהוי חיידקים וAST עם מערכת חיידקים אוטומטית.
    1. הכן צינור פלסטיק המכיל 3 מ"ל של 0.45% פתרון NaCl סטרילי תואם למערכת החיידקים האוטומטית.
    2. הוספת נפח מספיק של גלולה תרבות דם ב0.45% פתרון NaCl לקבל השעיה חיידקים המתאימה לעכירות מק 'פרלנד של 0.6-0.8. מדוד את העכירות באמצעות מכונה densitometer.
      הערה: הנפח של גלולה חיידקי תרבית הדם משתנה 50-200 μl להשיג עכירות מק 'פרלנד של 0.6-.8.
  2. לחסן כרטיסים האוטומטיים גראם חיובי (GP) או גראם שלילי (GN) לזיהוי וכרטיסי AST האוטומטיים לבדיקת רגישות מיקרוביאלית של חיידקי Cocci גראם חיובי וגראם השלילי כפי שתואר על ידי היצרן.
    הערה: identification עם GP או כרטיסי GN אינו מיושם אם ערך ציון הזדהות MALDI-TOF MS הוא> 2. בדוק את טוהר של ההשעיה חיידקים על ידי subculturing ההשעיה חיידקים על אגר דם (GP וGN) וצלחות אגר MacConkey (GN).

.4 אנטיביוטי רגישות בדיקה על ידי Assay דיפוזיה דיסק

Assay דיפוזיה הדיסק מתואר על ידי הוועדה האירופית לבדיקת רגישות מיקרוביאלית (EUCAST, הגרסה 3.0, אפריל 2013, www.eucast.org).

  1. הכנת השעיה חיידקים לבצע בדיקת רגישות מיקרוביאלית על ידי assay דיפוזיה דיסק.
    1. הכן שפופרת זכוכית המכילה 3 מ"ל של .0.9% פתרון NaCl סטרילי.
    2. הוספת נפח מספיק של גלולה תרבות דם ב0.9% פתרון NaCl לקבל השעיה חיידקים המתאימה לעכירות מק 'פרלנד של 0.5. מדוד את העכירות באמצעות מכונה densitometer.
      הערה: הנפח של תרבות הדםגלולה חיידקים משתנה 50-200 μl להשיג עכירות מק 'פרלנד של 0.6-.8.
    3. מערבולת ההשעיה החיידקים.
  2. הרכבה של השעיה חיידקים על גבי אגר Mueller-Hinton (MH) או אגר אורגניזמים אגר אנין Mueller-Hinton (MHF) (MH בתוספת 5% דם defibrinated סוס ו20 מ"ג / L של dinucleotide אדנין β-Nicotinamide).
    1. טובלים מקלון צמר גפן סטרילי בהשעית החיידקים ולהסיר בעדינות את נוזלים עודפים על ידי הפיכת הספוגית על הקיר הפנימי של צינור הזכוכית.
    2. מורחים את ההשעיה החיידקים באופן אחיד על כל פני השטח של הצלחת אגר MH / MHF על ידי שטיפה בשלושה כיוונים או באמצעות מסובב צלחת אוטומטית.
  3. יישום של דיסקים מיקרוביאלית על צלחות אגר מחוסנת.
    1. החל מקרוב הדיסקים על פני השטח של יבשות צלחות אגר מחוסנת באופן ידני או על ידי שימוש במתקן רגישות דיסק.
    2. דגירה את הצלחת על טמפה המתאימהrature ואווירה כפי שמתואר בשיטת דיפוזיה EUCAST דיסק בדיקת רגישות מיקרוביאלית (3.0 גרסה, אפריל 2013, www.eucast.org).

.5 האוטומטי PCR מבוסס בדיקת אבחון לאיתור של MRSA

  1. באמצעות micropipette, להעביר 50 μl של גלולה תרבות דם לתוך הבקבוקון מגיב מדגם מסופק עם MRSA האוטומטי ערכת PCR מבוססת אבחון בדיקה ומערבולת במהלך 20 שניות.
  2. באמצעות micropipette 1 מ"ל, לוותר המדגם ליציאת הדגימה של המחסנית. הכנס את המחסנית לתוך מערכת PCR האוטומטית ולהתחיל assay כפי שתואר על ידי היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במחקר שבוצע על ידי Prod'hom et al. 15, כדורי חיידקים המתקבלים על ידי צנטריפוגה תמוגה אמוניום כלוריד של 122 תרבות דם חיובית מ78 חולים נותחו על ידי MALDI-TOF MS. מתוך 122 תרבות דם חיובית, 95 (77.9%) זוהו בצורה נכונה, ברמת המין ואחד (0.8%) ברמת הסוג. 26 כדורי תרבות דם הנותרים (21.3%) לא נתנו שום זיהוי אמין על ידי MALDI-TOF. בין אלה, 21 היו חיידקים חיוביים גרם כולל 13 סטרפטוקוקוס ו5 staphylococci coagulase שלילי. חשוב לציין, 10 מתוך סטרפטוקוקוס מזוהה 13 היו Streptococcus pneumoniae אשר לעתים קרובות להחזיק כמוסה קשה לlyse וכמעט מכובדים ממינים של ס קבוצת mitis באמצעות MALDI-TOF MS. חמישה חיידקים גראם שליליים לא זוהו על ידי MALDI-TOF, ביניהם ארבעה קשים לlyse במארז מיני חיידקים ובם שתי קלבסיאלה pneumoniae ושתי Haemopהמופילוס hilus. לפיכך, זיהוי נכון של MALDI-TOF הושג ב78.7% מכדורי תרבות דם, המייצג את ביצועים יעיל בהשוואה ל84.1% מזיהוי המתקבל מזיהוי מקובל של מושבות חיידקים גדלו על צלחות אגר 11.

הביצועים של המערכת של חיידקים האוטומטיים לזיהוי חיידקים (ID) ועבור AST נבדקו על 278 כדורי חיידקים של תרבית דם החיובית לCocci גראם חיובי באשכול וחיידקים גראם שליליים. תוצאות אלו הושוו לתוצאות קונבנציונליות שהושגו עם כרטיסי מערכת חיידקים האוטומטיים ממושבות גדלו על צלחות אגר הבאים תת תרבות דם החיובית על תקשורת המתאימה 16. זיהוי ישיר באמצעות תעודות זהות מערכת זיהוי חיידקים יכול לשמש בעת זיהוי של גלולה חיידקים על ידי MALDI-TOF MS נכשל. בהשוואה לזיהוי סופי על ידי MALDI-TOF MS, זיהוי נכון עםתעודות זהות מערכת זיהוי חיידקים נצפו ב99% מEnterobacteriaceae, 74% מstaphylococci, 71% מחיידקים גראם שלילית שאינה תסיסה ו33% מCocci גראם החיובי האחר. זיהוי שגוי נצפה ב11% מהמקרים בסך הכל ואילו 8% מכדורי חיידקים לא נתנו שום הזדהות. כולל של 220 כדורי חיידקים כוללים 87 Enterobacteriaceae ו133 staphylococci נותחו לAST עם מערכת חיידקים אוטומטית AST GN26 וAST 580 כרטיסים 16. התוצאות נותחו בהתאם להגדרות שניתנו על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לקבלת תוצאות הסכם פרשניות, אשר הגדירו שווא רגיש כשגיאה מאוד גדולה (VME) וכוזבת עמידה כשגיאה גדולה (ME). AST התקבל מחיסון הישיר של גלולה תרבות דם בהשוואה לחיסון ממושבות גדלו על צלחות אגר הראה 0.1% VME ו0.3% ME לEnterobacteriaceae, ו0.7% VME ו0.1% ME לstaphylococci. כך הביצועים של ASTכרטיסים מחוסן ישירות עם כדורי תרבות דם הם בהסכם עם קריטריוני ביצועים מקובלים על ידי ה FDA.

ביצוע בדיקת MRSA טכנולוגית הגברה חומצת גרעין המבוססת על PCR מיקוד הספא, MECA וגני SCC יושם ישירות על כדורי חיידקי תרבית דם Staphylococcus aureus זוהו על ידי MALDI-TOF MS 17. בהתבסס על 106 מקרים, זיהוי של התנגדות methicillin הציג רגישות 99% וסגוליים 100%. מעניין לציין, כי חציון הזמן כדי לדווח על תוצאות טכנולוגית ההגברה של חומצות גרעין מחיוביות תרבית הדם היה שווה ל201 דקות (טווח 100-430) ואילו חציון הזמן מזיהוי MALDI-TOF לדווח על תוצאות דומות היו שווה ל97 דקות (טווח 25- 250).

איור 1
עידן איור 1 לפני ואחרי MALDI-TOF. בהשוואה לגישות אבחון קונבנציונליות הכוללות O / תת N של המדגם, זיהוי MALDI-TOF MS יכול להתבצע בתוך דקות לאחר לידת דגימות למעבדה לאבחון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 זרימת עבודה של עיבוד תרבות דם מדגימה לזיהוי MALDI-TOF MS. כאשר תרביות דם הן חיוביות, גלולה חיידקים הוא הוכן על ידי צנטריפוגה תמוגה אמוניום כלוריד. גלולה חיידקים זה משמשת לאחר מכן לזיהוי ישיר של MALDI-TOF MS. ניתן להשיג זיהוי MALDI-TOF MS בתוך 30 עד 60 דקות FO חיוביות תרבית דם llowing. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 יישומים במורד הזרם רבים, כולל צביעת גראם, זיהוי MS MALDI-TOF, AST באמצעות מערכות אוטומטיות ו / או מבחני דיפוזיה הדיסק ובדיקה PCR מבוסס מהירה כגון נקודת PCRs בדיקת טיפול (POCT-PCR) לזיהוי של MRSA יכול יבוצע ישירות על גלולה חיידקי תרבית דם. בדיקה ישירה מכדורי תרבות דם החיידקים להפחית את זמן הסיבוב סביב לדווח על תוצאות זיהוי וAST הוא מרכזי כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם באופן משמעותי. "Target =" 5fig3highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 פרוטוקול צנטריפוגה תמוגה אמוניום כלוריד מאפשר הכנה של גלולה חיידקים מועשרת ומטוהרת ממרקי תרבות דם חיוביים. צביעת גראם של תרבית דם החיובית של Escherichia coli, capitis Staphylococcus coagulase שלילי וStreptococcus dysgalactiae נערכו לפני ואחרי הכנת תרבות דם גלולה חיידקים. המורפולוגיות הקלאסיות של staphylococci באשכולות וסטרפטוקוקוס ברשתות הם נצפו בקלות רבה יותר במרק תרבות דם הילידים מאשר בגלולת חיידקי תרבית דם. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר.= "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בהשוואה לגישות אבחון תרבית דם החיובית קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים על ידי שימוש בגישת צנטריפוגה אמוניום כלוריד תמוגה לצמצם את הזמן לדווח זיהוי על ידי 16 עד 24 שעה והזמן לדווח AST ידי 24 עד 48 שעה (איורים 1 ו 3).

מבוא מהיר של טיפול אנטיביוטי המתאים הוא מרכזי כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם. לפיכך, זיהוי המוקדם של הגורמים מזהמים בתוך שעה 1 ואחריו AST מהיר שהושג בכ 8 עד 16 שעות מייצג השפעה משמעותית בניהול הקליני של חולים ספיגה. הדיווח המהיר של צביעת גראם כבר קשור עם השפעה רבה על טיפול אנטיביוטי ובכך לירידה בתחלואה בסבלנות ו6,7 תמותה. צביעת גראם של גלולה חיידקי תרבית דם ניתן לעשות כדי להגביר את הרגישות כאשר צביעת גראם של blood מרק התרבות הוא שלילי או חלש חיובי (איור 4). עם זאת, צביעת גראם שבוצעה על מרק תרבות דם האם מומלצת להתבונן מורפולוגיות טיפוסיות כגון staphylococci באשכולות או סטרפטוקוקוס ברשתות. במחקר פרוספקטיבי האחרון שבוצע על 202 מקרים של זיהום דם, זיהוי MALDI-TOF MS מכדורי תרבות דם הראה השפעה בטיפול אנטיביוטי ב35.1% מהמקרים ואילו כתם גרם השפעה נוספת רק ב20% מהמקרים 8. מעניין לציין, כי ההבדל המקסימאלי של השפעה בין צביעת גראם ודיווח זיהוי MALDI-TOF MS בניהול קליני נצפה כאשר חיידקים הקשורים עמידות לאנטיביוטיקה גדלה כגון Enterobacteriaceae AmpC-ייצור זוהו על ידי MALDI-TOF MS. באופן דומה, מרטיני et al. הראה כי זיהוי מהיר MALDI-TOF MS עשוי להדק את ההתאמה של הטיפול האנטיביוטי ב13.4% מהמקרים ואילו הרבעה למפרעy שבוצע על ידי Stoneking et al. הציע כי זיהוי מהיר של מיקרואורגניזמים גרימת בקטרמיה עשוי לעזור התאמת הטיפול האמפירי ב77% מהמקרים גם על ידי בניהול אנטיביוטיקה נוספת שאינו מכוסות על ידי המשטר הראשוני או על ידי צמצום הספקטרום של האנטיביוטיקה 18,19 . יתר על כן, השימוש בassay PCR מבוסס מהיר כגון MRSA טכנולוגית הגברה של חומצות הגרעין הבא S. aureus זיהוי על ידי MALDI-TOF MS מכדורי תרבות דם יורשה לתת הטיפול האנטיביוטי המתאים ביותר בפחות מ 4 שעות לחולים הסובלים מס בקטרמיה aureus 17. כאשר לא כולל חולים עם אלרגיה לפניצילין, השימוש בטכנולוגית ההגברה של חומצות גרעין MRSA אפשר הפחתה משמעותית של אנטי MRSA שימוש לרעה באנטיביוטיקה כגון glycopeptides מ26.1% ל8.1%. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שדיווח רציף מהיר של צביעת גראם, זיהוי MALDI-TOF MS ומבוסס PCR מהירssay מכדורי תרבות הדם משתפר באופן משמעותי את הטיפול האנטיביוטי ובכך הניהול הקליני, כמו גם את התוצאות של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

MALDI-TOF MS אפשר 78.7% זיהוי נכון של כדורי תרבות דם, שבו הוא ביצועים טובים מאוד בהשוואה לשיעור של 84.1% זיהוי מתקבל על ידי קונבנציונלי MALDI-TOF MS בוצעו על מושבות טהורות גדלו על צלחות אגר. יותר כי 50% מזיהומים בדם נגרמים על ידי זני חיידקים כגון Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa וEnterococci. חיידקים אלה מזוהים ביעילות על ידי MALDI-TOF MS אשר צפויים להשפיע באופן חיובי על ביצועים טובים של זיהוי MALDI-TOF MS מבוצע ישירות על כדורי חיידקי תרבית דם. הביצועים נמוכים לזיהוי של מינים מסוימים של חיידקים על ידי MALDI-TOF MS בוצעו על כדורי תרבות דם הוא בעיקר בשל גורמים דומיםמאלה שנצפו לזיהוי הקונבנציונלי ממושבות טהורות גדלו על צלחות אגר. לדוגמא, כמה מינים של חיידקים כגון סטרפטוקוקוס המשתייך לקבוצת mitis וstaphylococci coagulase השלילית הם קשורים באופן הדוק ומזוהה עם דיוק נמוך על ידי MALDI-TOF MS. יתר על כן, הרכב מסוים של קיר תא החיידק של חיידקים גראם חיוביים או הנוכחות של כמוסה צפופה נצפתה במינים חיידקים, כגון קלבסיאלה pneumoniae להקטין באופן משמעותי את יעילות תמוגה וכך הביצועים של זיהוי MALDI-TOF MS. לבסוף, הביצועים נמוכים של MALDI-TOF MS לזיהוי חיידקים אנאירוביים הוא בעיקר בשל ייצוג חסר ועניים של חיידקים אלה באתר MALDI-TOF.

ביצועים מופחתים הקטנים של הזדהות MALDI-TOF MS מכדורי תרבות דם בהשוואה לזיהוי קונבנציונלי ממושבות טהורות יכולים להיות בגלל שיורית ג חלבון דםomponents או לכמות מספקת של חיידקים המתקבלים לאחר תמוגה-צנטריפוגה. בדומה לכך, ההבדלים שנצפו עם כרטיסי מערכת חיידקים האוטומטיים מחוסן ישירות עם כדורי תרבות דם בהשוואה לאלו מחוסן עם מושבות מבודדות עלולים להיגרם על ידי רכיבי תרבות דם שיורית כגון חלבונים, תאי דם ותרכובות בינוניות דם שעלול להפריע להתפתחות חיידקים ב אוטומטי כרטיסי מערכת חיידקים ועלולים להשפיע באופן משמעותי על זיהוי שני וAST. יתר על כן, תוצאות AST מתקבלות על ידי מערכות של חיידקים אוטומטיים צריכה להיבדק על ידי מבחני דיפוזיה הדיסק גם מבוצעים ישירות על כדורי חיידקי תרבית דם כדי לאמת את התוצאות של כמה אנטיביוטיקה הידועה להציג פערים משמעותיים בהשוואה לגישות קונבנציונליות. עם זאת, חיסון ישיר של כרטיסי מערכת חיידקים האוטומטיים עם כדורי תרבות הדם מציג ביצועי זיהוי וAST מצוינים לשני Enterobacteriaceae וstaphylococci.

לפיכך, גלולה חיידקים המתקבלים על ידי צנטריפוגה תמוגה אמוניום כלוריד של תרביות דם חיוביות אומת לבצע ישירות כמה יישומים במורד הזרם המאפשרים דיווח מהיר של תוצאות חיוניות כגון זיהוי וAST בתאת מופחתת באופן משמעותי בהשוואה לגישות קונבנציונליות. יתר על כן, יישומים נוספים, כגון β-lactamases בדיקה מורחב ספקטרום (ESBLs) אומתו על צנטריפוגה תמוגה הדומה של תרבות דם החיובית מתודולוגיות 20 המצביעים על כך שהם יכולים להיות מיושמים גם בגלולת החיידקים שהושגו עם הפרוטוקול המתואר בעבודה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לטכנאים של המעבדה בקטריולוגיה של מרכז בית החולים של האוניברסיטה של ​​לוזאן לעזרתם כדי ליישם את הטכניקות במעבדה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter