Summary
Uma preparação sedimento bacteriano rápida de uma cultura de sangue positiva pode ser utilizado como uma amostra para aplicações tais como a identificação por MALDI-TOF, a coloração de Gram, teste de susceptibilidade aos antibióticos e ensaios baseados em PCR. Os resultados podem ser rapidamente comunicados aos médicos para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.
Abstract
Infecções da corrente sanguínea e septicemia são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O êxito de pacientes que sofrem de bacteremia depende de uma rápida identificação do agente infeccioso para orientar o tratamento antibiótico ideal. A análise de manchas Gram de hemocultura positiva pode ser rapidamente realizada e já impactar significativamente o regime de antibióticos. No entanto, a identificação precisa do agente infeccioso ainda é necessário para estabelecer o melhor tratamento direcionado. Apresentamos aqui uma preparação pellet bacteriano simples e rápido de uma hemocultura positiva que pode ser usado como um exemplo para várias aplicações a jusante essenciais, como a identificação por MALDI-TOF MS, teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) pelo método de difusão de disco ou sistemas automatizados AST e por PCR automatizados baseados em testes de diagnóstico. O desempenho desses sistemas de identificação e AST diferentes aplicados diretamente sobre as culturas de sangue pelotas bacterianas é muito siMilar para o desempenho, normalmente obtido a partir de colónias isoladas cultivadas em placas de agar. Em comparação com métodos convencionais, a rápida aquisição de um sedimento bacteriano, reduz significativamente o tempo de identificação e relatam tanto AST. Assim, seguindo a positividade da hemocultura, identificação por MALDI-TOF podem ser relatados em menos de 1 hora enquanto que os resultados de AST por sistemas automatizados ou AST difusão em disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Da mesma forma, os resultados de um ensaio baseado em PCR rápida podem ser comunicadas para os clínicos menos do que 2 horas após o relatório de uma bacteremia. Juntos, estes resultados demonstram que a preparação rápida de um sedimento de bactérias hemocultura tem um impacto significativo sobre o tempo de identificação e AST reviravolta e, portanto, sobre o sucesso de pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.
Introduction
Infecções da corrente sanguínea e septicemia em pacientes hospitalizados são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. Assim, a mortalidade relacionada com a corrente sanguínea infecções é observada em cerca de 14% a 37% dos pacientes hospitalizados e pode aumentar para 35% em unidades de terapia intensiva de pacientes 1-3. A rápida identificação do agente infeccioso é fundamental para orientar o tratamento antimicrobiano ideal e aumentar o êxito da terapia antimicrobiana 4,5. A análise rápida da coloração Gram da hemocultura positiva já tem um impacto significativo sobre a adaptação da terapia antimicrobiana 6,7, mas a identificação precisa do agente infeccioso é obrigada a fornecer o tratamento antibiótico mais adequado às pacientes. Por exemplo, diferentes regimes de tratamento antibiótico devem ser implementadas após bacteremia com enterococos e estreptococos que são difíceis de distinguir pela coloração de Gram. Do mesmo modo, a identificação da espécie level é necessária para detectar bactérias Gram enterobactérias negativa que codifica um gene cromossómico ampC que conferem uma maior resistência à β-lactâmicos 8.
Com uma hemocultura positiva, a abordagem convencional de diagnóstico é a subcultura do agente infeccioso em diferentes placas de ágar, que requer várias horas de incubação adicional identificação prévia com várias abordagens, incluindo testes bioquímicos, o crescimento em diferentes meios seletivos e sistemas de identificação microbiana automatizadas. O tempo para os resultados de um método de diagnóstico convencional é de cerca de 1 a 3 dias.
O surgimento da tecnologia de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF), para a rápida identificação de microrganismos forneceu uma nova ferramenta para identificar rapidamente os microrganismos a partir de colónias que cresceram em placas de agar como também directamente a partir de sangue positiva culturas (Figura 1), 9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar um agente infeccioso a partir de culturas de sangue tem reduzido significativamente o tempo para resultados de alguns minutos em vez de horas e dias exigidos por métodos tradicionais. Como discutido por Croxatto et al. 13, a eficiência de identificação de MALDI-TOF depende de diferentes parâmetros, incluindo a quantidade e pureza do microrganismo. Estes dois critérios são facilmente obtidos a partir de colónias discretas cultivadas em placas de agar, mas é necessária uma pré-tratamento analítico de enriquecimento bacteriana e purificação de amostras complexas, tais como a cultura de sangue, que contêm vários componentes celulares e de proteínas que podem interferir com a identificação de MALDI-TOF.
Vários métodos de isolamento de microrganismos de cultura do sangue tenham sido utilizados num certo número de estudos, incluindo a saponina ou outro método de detergentes suaves para a extracção 9,14 bacteriana, método de separação de soro de 10, a lise métodos de centrifugação 12 (Figura 2) 15. Esta preparação de pelotas de sangue-cultura também fornecer uma amostra para outras aplicações diretas jusante, tais como coloração de Gram, testes de diagnóstico automatizado com base na PCR, como POCT-PCRs para a detecção rápida de resistente à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA), e os testes de sensibilidade aos antibióticos com sistemas automatizados de AST e / ou por ensaios de difusão de disco em placas de agar (Figura 3).
Neste trabalho, nós descrevemos os diferentes passos para a preparação do sedimento bacteriano sangue-cultura, tal como explicado por Prod'hom et al. 15 (Figura 4). Nós também irá deescriba os protocolos de três das principais aplicações que podem ser executadas no pellet hemocultura: Identificação por MALDI-TOF 15, a identificação (ID) e teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) com os sistemas automatizados 16 de Enterobacteriaceae e estafilococos e PCR-automatizado teste de diagnóstico baseado na detecção de MRSA 17.
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Protocol
Este protocolo foi desenvolvido e validado seguindo os processos de pesquisa e desenvolvimento e as normas éticas da nossa instituição antes de ser implementado como uma ferramenta de rotina.
1 Preparação de uma Cultura de sangue bacteriana Pellet por Amônio Procedimento Chloride Erythrocyte-lise
- Preparação de uma hemocultura positiva para posterior centrifugação.
- Esterilizar a tampa hemocultura. Adicionar 70% de etanol na tampa da garrafa e queimá-lo.
NOTA: Não execute este passo debaixo de uma capela de fluxo laminar. - Mover o frasco para uma câmara de fluxo laminar. Recolha 5 ml da cultura de sangue com uma seringa 20 G.
- Adicionar os 5 ml de cultura de sangue em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 45 ml de água estéril (H 2 O) e agitar a amostra.
- Esterilizar a tampa hemocultura. Adicionar 70% de etanol na tampa da garrafa e queimá-lo.
- Preparação de uma cultura de sangue pelete bacteriana por centrifugação a lise.
- Centrifuga-se a amostra a 1000 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Remove-se o sobrenadante (que contém principalmente H2O e células do sangue) com uma bomba de vácuo de laboratório.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de cloreto de amónio caseira solução (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3) de lise. Quebrar o sedimento por raspagem e em vortex do tubo e centrifugar a amostra a 140 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Rejeitar o sobrenadante, que contém principalmente detritos de células vermelhas do sangue.
- Se o sedimento permaneceu hemorrágico, ressuspender o sedimento em 2 ml de solução estéril destilada e H 2 0 para lisar os glóbulos vermelhos mais residuais e para lavar o sedimento. Centrifuga-se a amostra a 140 xg durante 10 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 200 ul de H2O
- Subcultura da cultura de sangue em vários meios de ágar seletivo e não seletivo.
- Recolha de 1 ml da cultura de sangue com uma seringa 20 G.
- Inocular uma gota de hemocultura into quatro quadrantes em ágar-sangue, ágar chocolate, ágar McConkey e ágar Schaedler.
- Incubar a 37 ° C, o agar de sangue e as placas de ágar de chocolate em uma atmosfera de CO2 a 5%, o agar McConkey em atmosfera normal e a placa de ágar Schaedler em condições anaeróbicas.
- Siga o crescimento bacteriano na mídia diferente.
- Verifique se há pureza bacteriana.
2 Identificação por MALDI-TOF MS
- Identificação direta do sedimento sangue.
- Transferir 1 mL da pelota de sangue em uma placa-alvo MALDI e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C.
- Sobreponha a amostra com ácido fórmico 1 ml de 70% e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C.
- Sobreponha a amostra com 1 ml de matriz MALDI e deixe secar sobre uma plataforma C de aquecimento 42 ° (solução de α-ciano-4-hidroxicinâmico em 50% de acetonitrilo-2.5% de ácido trifluoroacético saturada).
- Vá para a MALDI-TOF MS a análise com um sistema de MALDI-TOF MS, como descrito pelos fabricantes.
- Se a pontuação de identificação não é válido a nível de espécie (por exemplo, com um score <2), realizar uma extração de proteínas da amostra de sedimento sangue.
- Identificação após a extracção de proteínas a partir do sedimento da cultura do sangue.
- Misturar 20 ul do sedimento com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 13.000 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante e adicionar 25 ul de ácido fórmico a 70% e 25 mL de 100% de acetonitrilo ao sedimento. Vortex vigorosamente, para voltar a suspender as pelotas. Ressuspender pelotas duras ao dividi-los com pontas de pipeta antes de vórtex.
- Centrifuga-se a 13000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Transferir 1 mL do sobrenadante (que contém proteínas extraídas) em uma placa-alvo MALDI e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C. Proceda como descrito no ponto 2.1.2.
3. bacteriana Identificação e Antibiótico Suscetibilidade Testes com um sistema automatizado Microbial
- Preparação de uma suspensão bacteriana para a identificação de bactérias e a AST, com um sistema automatizado microbiana.
- Preparar um tubo de plástico contendo 3 ml de solução estéril de 0,45% de NaCl compatível com o sistema microbiano automatizado.
- Adicionar um volume suficiente da pelete da cultura de sangue em solução de NaCl a 0,45% para se obter uma suspensão bacteriana correspondente para uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8. Medir a turvação, utilizando um densitómetro de máquina.
Nota: O volume do sedimento bacteriano, cultura do sangue varia de 50 a 200 ul para atingir uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8.
- Inocular as bactérias Gram-positivas (GP) ou Gram-negativa (GN) cartões automáticos de identificação e os cartões AST automatizadas para testes de susceptibilidade antimicrobiana de cocos Gram-positivos e Gram-negativas, como descrito pelo fabricante.
NOTA: identification com GP ou cartões de GN não é aplicada se MALDI-TOF MS valor pontuação identificação é> 2. Verifique a pureza da suspensão bacteriana por subcultura a suspensão bacteriana em agar de sangue (GP e GN) e ágar de MacConkey (GN) placas.
4. Antibiótico Teste à Susceptibilidade pelo Disk Diffusion Assay
O ensaio de difusão em disco é descrito pelo Comité Europeu para os testes de susceptibilidade antimicrobiana (EUCAST, versão 3.0, em abril de 2013, www.eucast.org).
- Preparação de uma suspensão bacteriana para realizar testes de susceptibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em disco.
- Preparar um tubo de vidro contendo 3 ml de solução estéril de NaCl a 0,9%.
- Adicionar um volume suficiente da pelete da cultura de sangue em solução de NaCl 0,9% para obter uma suspensão bacteriana correspondente para uma turbidez de McFarland de 0,5. Medir a turvação, utilizando um densitómetro de máquina.
NOTA: O volume da cultura de sanguesedimento bacteriano varia de 50 a 200 ul para atingir uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8. - Vortex a suspensão bacteriana.
- Inoculação de suspensão bacteriana em agar Mueller-Hinton (MH) ou de Mueller-Hinton agar-agar de organismos fastidiosos (MHF) (MH suplementado com 5% de sangue de cavalo desfibrinado e 20 mg / L de β-nicotinamida adenina dinucleótido).
- Mergulhar uma mecha de algodão estéril na suspensão bacteriana e cuidadosamente remover o excesso de fluido, rodando a mecha na parede interior do tubo de vidro.
- Espalhar a suspensão bacteriana uniformemente sobre toda a superfície da placa de agar MH / MHF por raspagem em três direcções, ou por meio de um rotor placa automatizado.
- Aplicação de discos antimicrobianos em placas de ágar inoculadas.
- Aplicar perto os discos na superfície das placas de agar inoculadas secas manualmente ou utilizando um dispensador de disco de sensibilidade.
- Incubar a placa na tempe apropriadoratura e atmosfera, conforme descrito no teste de suscetibilidade método de difusão em disco EUCAST antimicrobiana (Versão 3.0, em abril de 2013, www.eucast.org).
Baseado em PCR 5. automatizado de teste de diagnóstico para a detecção do MRSA
- Usando uma micropipeta, transferir 50 ul do sedimento de cultura de sangue para dentro do frasco de reagente de amostra fornecido com o MRSA baseada em PCR kit de teste de diagnóstico e automatizado vórtice durante 20 seg.
- Usando uma micropipeta 1 ml, distribuir a amostra na porta espécime do cartucho. Inserir o cartucho dentro do sistema de PCR automatizado e iniciar o ensaio, tal como descrito pelo fabricante.
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Representative Results
No estudo realizado por Prod'hom et al. 15, peletes bacterianas obtidas por lise de cloreto de amónio a centrifugação de 122 cultura sanguínea positiva a partir de 78 doentes foram analisadas por MALDI-TOF MS. Fora de 122 hemocultura positiva, 95 (77,9%) foram corretamente identificados ao nível da espécie e um (0,8%) no nível de gênero. Os restantes 26 (21,3%) pelotas de hemocultura não deu nenhuma identificação confiável por MALDI-TOF. Entre esses, 21 eram bactérias gram positivas, incluindo estreptococos 13 e 5 estafilococos coagulase-negativos. Importante, 10 dos 13 estreptococos não identificados foram Streptococcus pneumoniae que possuem muitas vezes uma cápsula de difícil lise e dificilmente são distinguidas a partir de espécies de S. grupo mitis utilizando MALDI-TOF MS. Cinco bactérias gram-negativas não foram identificados por MALDI-TOF, entre os quais quatro difícil de lise encapsulado espécies bacterianas incluindo dois Klebsiella pneumoniae e dois Haemopinfluenzae hilo. Assim, a identificação correcta por MALDI-TOF foi obtido em 78,7% de peletes de cultura de sangue, o que representa um rendimento eficiente comparado com o 84,1% de identificação obtidos de identificação convencional de colónias bacterianas cultivadas em placas de agar 11.
O desempenho do sistema automatizado para a identificação microbiana bacteriana (ID) e para AST foi testado em 278 peletes bacterianas de culturas sanguíneas positivas de cocos Gram-positivos, em conjunto e bactérias Gram-negativas. Estes resultados foram comparados com os resultados obtidos com os convencionais cartões sistema automatizado de colónias microbianas cultivadas em placas de agar seguintes subcultura de hemocultura positiva em suportes apropriados 16. A identificação directa usando um sistema de identificação microbiana cartões de identificação pode ser utilizado quando a identificação do sedimento bacteriano, por MALDI-TOF MS falhou. Comparado a uma identificação final por MALDI-TOF MS, a correta identificação comSistema de identificação microbiana cartões de identificação foi observado em 99% das Enterobacteriaceae, 74% de estafilococos, 71% das bactérias gram-negativas não fermentativas e 33% de outros cocos Gram-positivos. Um erro de identificação foi observada em 11% dos casos totais enquanto que 8% das pelotas bacterianas não deu nenhuma identificação. Um total de 220 aglomerados de bactérias, incluindo 87 Enterobacteriaceae e 133 estafilococos foram analisadas para AST com sistema microbiana automatizada AST GN26 e AST 580 cartões de 16. Os resultados foram analisados de acordo com as definições dadas por os EUA Food and Drug Administration (FDA) para resultados de concordância interpretativas, que definiram uma falsa suscetível como um erro muito grande (VME) e um falso resistente como um grande erro (ME). AST obtida a partir de inoculação direta de hemocultura pellet comparada à inoculação de colônias crescidas em placas de ágar apresentaram 0,1% e 0,3% VME ME para Enterobacteriaceae, e 0,7% e 0,1% VME ME por estafilococos. Assim, o desempenho da ASTcartões inoculados diretamente com pelotas de cultura de sangue estão de acordo com os critérios de desempenho aceites pela FDA.
O desempenho do teste de MRSA tecnologia de amplificação do ácido nucleico baseado em PCR para o spa, mecA e genes SCC foi aplicado diretamente sobre Staphylococcus aureus hemocultura pelotas bacterianas identificadas por MALDI-TOF MS 17. Com base em 106 casos, a detecção de resistência à meticilina exibiram uma sensibilidade de 99% e uma especificidade de 100%. Curiosamente, o tempo médio para relatar os resultados nucléicos tecnologia de amplificação de ácidos de hemocultura positividade foi igual a 201 min (intervalo de 100-430), enquanto o tempo médio entre a identificação MALDI-TOF para relatar resultados semelhantes foi igual a 97 min (intervalo de 25 a 250).
Figura 1 pré e pós-MALDI-TOF era. Comparado aos métodos diagnósticos convencionais que incluem uma O / N subcultura da amostra, identificação MALDI-TOF MS pode ser realizada em poucos minutos após o parto amostras para o laboratório de diagnóstico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Fluxo de trabalho de processamento de cultura do sangue de amostragem para identificação MALDI-TOF MS. Quando hemoculturas são positivas, uma massa bacteriana é preparado por cloreto de amônio lise centrifugação. Este sedimento de bactérias é então utilizada para a identificação directa por MALDI-TOF MS. Identificação de MALDI-TOF MS pode ser obtida dentro de 30 a 60 min fo llowing hemocultura positividade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Muitas aplicações a jusante, incluindo a coloração de Gram, de MALDI-TOF MS de identificação, AST utilizando sistemas automatizados e / ou ensaios de difusão em disco e ensaios baseados em PCR rápida, tais como ponto de ensaio PCRs cuidados (POCT-PCR) para a detecção de MRSA pode ser realizada diretamente na massa bacteriana hemocultura. teste direto das pelotas de hemocultura bacterianas diminuir significativamente o tempo de turn-around para relatar ID e AST resultados que é fundamental para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea. "Target =" 5fig3highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 O protocolo de lise de centrifugação de cloreto de amónio permite a preparação de um sedimento bacteriano enriquecido e purificada a partir de caldos de cultura de sangue positivas. Gram de cultura de sangue positivas de Escherichia coli, Staphylococcus coagulase negativa capitis e Streptococcus dysgalactiae realizada antes e após a preparação de hemocultura sedimento bacteriano. As morfologias clássicos de estafilococos e estreptococos em grupos em cadeias são mais facilmente observadas no caldo de cultura de sangue nativo do que no sedimento de bactérias hemocultura. Escala da barra = 25 m.= "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Comparado aos métodos diagnósticos hemocultura positiva convencionais, a rápida aquisição de um sedimento de bactérias, utilizando o cloreto de amônio lise abordagem centrifugação reduzir o tempo para relatar a identificação por 16 a 24 horas eo tempo para relatar AST por 24-48 horas (Figuras 1 e 3).
A rápida introdução de antibioticoterapia adequada é fundamental para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea. Assim, a identificação precoce dos agentes infecciosos dentro de 1 hora seguido por um AST rápida obtida em cerca de 8 a 16 horas representa um grande impacto no manejo clínico de pacientes sépticos. A comunicação rápida da coloração de Gram já foi associado com um grande impacto na terapia antimicrobiana e, portanto, com uma diminuição da morbidade do paciente e 6,7 mortalidade. A coloração de Gram do sedimento bacteriano cultura de sangue pode ser feito para aumentar a sensibilidade quando a coloração de Gram, o blood caldo de cultura é negativa ou fracamente positiva (Figura 4). No entanto, coloração de Gram realizada no caldo de cultura de sangue nativo é recomendado para observar morfologias típicas, como estafilococos em clusters ou estreptococos em cadeias. Em um recente estudo prospectivo realizado em 202 casos de infecção da corrente sanguínea, identificação MALDI-TOF MS a partir de sedimentos de cultura de sangue mostraram um impacto na antibioticoterapia em 35,1% dos casos, enquanto a coloração de Gram teve apenas um impacto adicional em 20% dos casos 8. Curiosamente, a diferença máxima de impacto entre a coloração de Gram e MALDI-TOF MS de informação de identificação na gestão clínica foi observada quando as bactérias associadas com o aumento da resistência a antibióticos, tais como AmpC produtoras Enterobacteriaceae foram identificados por MALDI-TOF MS. Da mesma forma, Martiny et al. Mostraram que MALDI-TOF MS identificação rápida pode fixar a adaptação da antibioticoterapia em 13,4% dos casos, enquanto um garanhão retrospectivay realizada por Stoneking et al. sugeriu que uma rápida identificação de microrganismos que provocam a bacteremia pode ajudar a ajustar a terapêutica empírica em 77% dos casos, quer através da administração de um antibiótico suplementar não abrangido pelo regime inicial ou reduzindo o espectro de antibióticos 18,19 . Além disso, a utilização de um ensaio baseado em PCR rápida, tal como a MRSA tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos na sequência de S. aureus identificação por MALDI-TOF MS a partir de sedimentos de cultura de sangue permitido para fornecer a terapia antibiótica mais adequada em menos de 4 h para os pacientes que sofrem de S. aureus bacteremia 17. Quando a exclusão de doentes com alergia a penicilina, o uso da tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos MRSA permitiu uma redução significativa de anti-MRSA uso indevido tais como antibióticos glicopéptidos de 26,1% para 8,1%. Juntos, estes dados sugerem que a rápida comunicação sequencial de coloração de Gram, identificação de MALDI-TOF MS e rápida baseada em PCR, umssay de pelotas de cultura de sangue estão a melhorar significativamente a terapia antibiótica e, assim, a gestão clínica, bem como a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.
MALDI-TOF MS permitiu a 78,7% correta identificação de pelotas de cultura de sangue, o que é um desempenho muito bom em comparação com uma taxa de identificação 84,1% obtidos por convencionais MALDI-TOF MS em colónias puras cultivadas em placas de ágar. Mais que 50% de infecção da corrente sanguínea são causadas por espécies bacterianas tais como a, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e enterococos. Estas bactérias são eficientemente identificado por MALDI-TOF MS que provavelmente influenciam positivamente o bom desempenho de identificação de MALDI-TOF MS realizada directamente em cultura de sangue peletes bacterianas. O baixo rendimento para a identificação de algumas espécies bacterianas por MALDI-TOF MS realizados em pelotas de cultura de sangue é principalmente devido a factores similaresdo que as observadas para a identificação convencional a partir de colónias puras cultivadas em placas de agar. Por exemplo, várias espécies microbianas, tais como Streptococci pertencentes ao grupo mitis e estafilococos de coagulase negativa estão intimamente relacionadas e identificado com baixo rigor por MALDI-TOF MS. Além disso, uma determinada composição da parede celular bacteriana de bactérias Gram-positivas ou a presença de uma cápsula denso observado nas espécies de bactérias tais como Klebsiella pneumoniae diminuir significativamente a eficiência de lise e, assim, o desempenho de identificação de MALDI-TOF MS. Finalmente, o baixo rendimento de MALDI-TOF MS para a identificação de bactérias anaeróbicas é devido principalmente a uma representação incompleta e deficiente de estas bactérias na base de dados de MALDI-TOF.
A pequena redução do desempenho de identificação de MALDI-TOF MS a partir de sedimentos de cultura de sangue em comparação com a identificação de colónias puras convencional pode ser devido a proteína residual do sangue componentes ou a uma quantidade insuficiente de bactérias obtidas após lise-centrifugação. Do mesmo modo, as diferenças observadas com os cartões do sistema automatizado microbianas inoculados directamente com peletes de cultura de sangue, em comparação com os que foram inoculados com as colónias isoladas podem ser causadas pelos componentes de cultura de sangue residual, tais como proteínas, células do sangue e compostos médias de sangue que pode interferir com o crescimento de bactérias na automatizado cartões do sistema microbiano e pode ter um impacto significativo sobre a identificação e AST. Além disso, os resultados obtidos por AST sistemas microbianos automatizados precisam ser verificados por difusão em disco também realizados diretamente na cultura de sangue pelotas bacterianas para validar os resultados de alguns antibióticos conhecidos para apresentar discrepâncias significativas em relação a abordagens convencionais. No entanto, a inoculação direta dos cartões do sistema microbianas automatizadas com pelotas de hemocultura apresenta uma excelente ID e AST desempenho tanto para Enterobacteriaceae e staphylococci.
Assim, o pellet bacteriano obtido por cloreto de amônio lise centrifugação de hemoculturas positivas foi validado para executar diretamente várias aplicações a jusante, permitindo uma comunicação rápida dos resultados essenciais, como ID e AST em um TAT significativamente reduzida em comparação com as abordagens convencionais. Além disso, as aplicações adicionais, tais como de espectro alargado β-lactamases (BLEEs) testes foram validados semelhante centrifugação de lise de cultura de sangue positiva metodologias 20 sugerindo que eles podem também ser aplicados sobre o sedimento de bactérias obtido com o protocolo descrito no presente trabalho.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos técnicos do laboratório de bacteriologia do Hospital Central de Lausanne University por sua ajuda para implementar as técnicas no laboratório.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
References
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