Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Published: October 15, 2014 doi: 10.3791/51985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Быстрое бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови может быть использована в качестве образца для таких применений, как идентификации по MALDI-TOF, окрашивание по Граму, тестирование чувствительности к антибиотикам и тест на основе ПЦР. Полученные результаты могут быть быстро доведены до врачей, чтобы улучшить результаты лечения больных, страдающих от инфекций кровотока.

Abstract

Инфекций кровотока и сепсис являются одной из основных причин заболеваемости и смертности. Успешное завершение пациентов, страдающих от бактериемии зависит от быстрой идентификации инфекционного агента, чтобы вести оптимальное лечение антибиотиками. Анализ грамотрицательных пятна от положительной культуры крови может быть проведено быстро и уже существенно повлиять на режим антибиотиками. Тем не менее, точная идентификация возбудителя инфекции по-прежнему требуется, чтобы установить оптимальный целенаправленного лечения. Приведем здесь простой и быстрый бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови, которые могут быть использованы в качестве образца в течение нескольких существенных последовательных применений, таких как идентификация по MALDI-TOF MS, тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) на диск диффузии анализа или автоматизированных систем AST и автоматизированная основе ПЦР диагностическое тестирование. Производительность этих различных идентификационных и АСТ систем, применяемых непосредственно на посев крови бактериальных гранул очень сиMilar к производительности обычно получают из изолированных колоний, выросших на чашках с агаром. По сравнению с традиционными подходами, быстрое приобретение бактериальной гранул значительно снижает время, чтобы сообщать как идентификацию и АСТ. Таким образом, следующие культура положительность крови, идентификация MALDI-TOF может быть сообщено в течение менее 1 ч, тогда как результаты АСТ автоматизированными системами AST или диск диффузии анализов в пределах от 8 до 18 часов, соответственно. Точно так же результаты экспресс ПЦР-анализа могут быть доведены до сведения врачей менее 2 ч после доклада на карбункул. Вместе, эти результаты показывают, что быстрое приготовление питательной крови бактериальный осадок имеет значительное влияние на идентификации и АСТ выполнения заказа и, таким образом, на успешный исход пациентов, страдающих от инфекций кровотока.

Introduction

Инфекций кровотока и сепсис у госпитализированных пациентов являются основной причиной заболеваемости и смертности. Таким образом, смертность от инфекций кровотока наблюдается примерно в 14% до 37% госпитализированных пациента и может увеличиться до 35% в отделениях интенсивной терапии пациентов 1-3. Быстрое выявление инфекционного агента является ключевым для руководства оптимальное антимикробной терапии и увеличить успешный исход антимикробной 4,5 терапии. Экспресс-анализ по Граму от положительной культуры крови уже имеет значительное влияние на адаптацию антимикробной терапии 6,7, но точной идентификации инфекционного агента требуется обеспечить лучший адаптированный лечения антибиотиками для пациентов. Например, различные схемы лечения антибиотиками должны быть реализованы следующие бактериемии с энтерококков и стрептококков, которые трудно отличить от окрашивания Грама. Аналогично, идентификация на видовом ЛевEL требуется для обнаружения грамотрицательных энтеробактерий, кодирующий хромосомной AMPC ген, сообщающий повышенную устойчивость к β-лактамы 8.

С положительной культуры крови, обычный диагностический подход является субкультура инфекционного агента на разных чашках с агаром, который требует несколько часов дополнительного инкубационного предварительного идентификации с различными подходами в том числе биохимических тестов, роста на различных селективных средах и автоматизированных систем микробной идентификации. Время результатам обычного диагностического подхода является то, приблизительно от 1 до 3 дней.

Появление технологии матрица-лазерной десорбцией / ионизацией время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) для быстрой идентификации микроорганизмов предоставил новый инструмент для быстрого выявления микроорганизмов из колоний, выросших на чашках с агаром, но и непосредственно от положительной крови культуры (рис 1) 9-12. Чтэ использование MALDI-TOF для идентификации инфекционного агента из крови значительно сократила время к результатам до нескольких минут, а не часы и дни, требуемых традиционными методами. Как обсуждалось Croxatto соавт. 13, эффективность идентификации MALDI-TOF зависит от различных параметров, в том числе чистоты и количества микроорганизма в. Эти два критерия легко получаются из дискретных колоний, выросших на чашках с агаром, но требует предварительной аналитической лечение бактериального обогащения и очистки от сложных образцов, таких как культура крови, которые содержат несколько клеточных и белковых компонентов, которые могут помешать идентификации MALDI-TOF.

Методы изоляции различных микроорганизмов »от культуры крови были использованы в ряде исследований, включая сапонина или другим способом мягкие моющие средства для бактериального извлечения 9,14, метод сыворотки сепаратора 10, лизиса методы центрифугирования 12 (Рисунок 2) 15. Этот препарат крови культура окатышей также предоставить образец для других прямых последовательных применений, таких как окрашивание Грама, автоматизированные диагностические тесты, основанные на ПЦР, такие как POCT-ПЦР для быстрого обнаружения метициллин-устойчивый Staphyloccocus стафилококк (MRSA) и чувствительности к антибиотикам с автоматизированные системы АСТ и / или дисковыми диффузии анализов на чашках с агаром (Рисунок 3).

В этой работе мы описываем различные шаги для подготовки крови культуры бактерий крупинки, как объясняется Prod'hom соавт. 15 (Рисунок 4). Мы также деписец протоколы для трех основных приложений, которые могут выполняться на культуры крови пеллет: Идентификация по MALDI-TOF 15, идентификационный (ID) и тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) с автоматизированными системами 16 для энтеробактерий и стафилококков и автоматизированной ПЦР диагностический тест основан на обнаружении MRSA 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол был разработан и утвержден следующий процессы исследований и разработок, а также этические правила нашего заведения до начала ее осуществления в качестве обычного инструмента.

1 Подготовка Кровь культуры бактериальный осадок от аммония хлорид эритроцитов-лизирующим процедуры

  1. Получение положительной культуры крови для последующего центрифугирования.
    1. Стерилизовать культуры крови крышку. Добавить 70% этанола на крышке бутылки и записать его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте этот шаг под капотом ламинарного потока.
    2. Перемещение бутылку ламинаре. Собирают 5 мл культуры крови с 20 г шприца.
    3. Добавьте 5 мл культуры крови в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 45 мл стерильной воды (H 2 O) и перемешайте пробу.
  2. Приготовление питательной крови бактериальный осадок центрифугированием лизисом.
    1. Центрифуга образца при 1000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    2. Ремове супернатант (который содержит в основном H 2 O и клеток крови) с помощью лабораторного вакуумного насоса.
    3. Ресуспендируют гранул в 1 мл самодельного хлорида аммония лизирующих решение (0,15 М NH 4 Cl, 1 мМ КНСО3). Пробивное гранул путем соскабливания и при интенсивном перемешивании трубку и центрифуги образца при 140 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Удалите супернатант, который в основном содержит эритроцитов мусора.
      1. Если гранулы оставались геморрагический, ресуспендируют осадок в 2 мл стерильной дистиллированной воды и 2 0 дальнейшего лизиса остаточные красные клетки крови и промывать осадок. Центрифуга образца при 140 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, и отбросить супернатант.
    5. Ресуспендируют гранул в 200 мкл H 2 O
  3. Субкультура культуры крови на различных селективного и неселективного среде агара.
    1. Собирают 1 мл культуры крови с 20 г шприца.
    2. Привить 1 каплю культуры крови междунаро четыре квадранта на кровяной агар, шоколадный агар, McConkey агара и Schaedler агара.
    3. Инкубировать при 37 ° C в кровяной агар и шоколад агаром в 5% СО 2 атмосферы, агар Мак-Конки в нормальной атмосфере и агаром Schaedler в анаэробных условиях.
    4. Следуйте рост бактерий на различных средах.
    5. Проверьте бактериальной чистоты.

2 Идентификация по MALDI-TOF MS

  1. Прямая идентификация из осадка крови.
    1. Передача 1 мкл осадка крови на MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы.
    2. Overlay образца с 1 мкл 70% муравьиной кислоты и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы.
    3. Наложение образца с 1 мкл MALDI матрицы (насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% ацетонитрил-2,5% трифторуксусной кислоты) и дать высохнуть на 42 ° C нагрева платформы.
    4. Перейдите к MALДИ-TOF МС анализ с помощью системы MALDI-TOF MS, как описано производителем.
    5. Если счет идентификации является недействительным на видовом уровне (например со счетом <2), выполнить извлечение белка в образце пеллет крови.
  2. Идентификация после экстракции белка из культуральной крови гранул.
    1. Смешать 20 мкл гранул с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 13000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
    2. Жидкость над осадком сливают и добавляют 25 мкл 70% муравьиной кислоты и 25 мкл 100% ацетонитрила в таблетки. Вихревой энергично ресуспендируют гранул. Ресуспендируют жесткие гранулы, разбивая их вниз с наконечников пипеток до встряхивания.
    3. Центрифуге при 13000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Передача 1 мкл супернатанта (которые содержат извлеченные белки) на MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы. Действуйте, как описано в 2.1.2.

3 Бактериальный IDENTIFication и чувствительности к антибиотикам с помощью автоматизированной системы микробной

  1. Приготовление бактериальной суспензии для идентификации бактерий и АСТ с автоматизированной системой микробного.
    1. Подготовить пластмассовую трубку, содержащую 3 мл стерильного 0,45% раствора NaCl, совместимого с автоматизированной системой микробного.
    2. Добавить достаточный объем питательной крови гранул в 0,45% растворе NaCl, чтобы получить бактериальной суспензии, соответствующей мутности McFarland 0,6 до 0,8. Измерьте мутности с помощью денситометра машину.
      Примечание: объем культуральной крови бактериальный осадок варьирует от 50 до 200 мкл для достижения мутности McFarland 0,6 до 0,8.
  2. Привить автоматизированные грамположительных (GP) или грамотрицательных (GN) карты для идентификации и автоматизированные AST карты для тестирования антимикробной восприимчивости грамположительных кокков и грамотрицательных бактерий, как описано производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Identificatioн с терапевтом или GN карт не применяется, если MALDI-TOF MS идентификация оценка значение> 2. Проверьте чистоту бактериальной суспензии путем пересева бактериальной суспензии на кровяной агар (GP и GN) и MacConkey агар (GN) пластин.

4 чувствительности к антибиотикам по диффузии диска Пробирной

Диск диффузии анализ описан Европейским комитетом по антимикробной восприимчивости (EUCAST, Версия 3.0, апрель 2013, www.eucast.org).

  1. Приготовление бактериальной суспензии для выполнения антимикробной чувствительности диском диффузии анализа.
    1. Приготовьте стеклянную трубку, содержащую 3 мл стерильного 0,9% раствора NaCl.
    2. Добавить достаточный объем питательной крови гранул в 0,9% растворе NaCl, чтобы получить бактериальной суспензии, соответствующий McFarland мутности 0,5. Измерьте мутности с помощью денситометра машину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем культуры кровиБактериальный осадок варьирует от 50 до 200 мкл для достижения мутности McFarland 0,6 до 0,8.
    3. Vortex бактериальной суспензии.
  2. Прививка бактериальной суспензии на Мюллера-Хинтона агар (MH) или Мюллера-Хинтона агар-агар требовательный организмов (MHF) (МН с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови, и 20 мг / л β-никотинамид-аденин-динуклеотид).
    1. Dip стерильного ватного тампона в бактериальной суспензии и осторожно удалить лишнюю жидкость, вращая тампон на внутренней стенке стеклянной трубки.
    2. Распространение бактериальной суспензии равномерно на всей поверхности агаровой пластины MH / минимального теплового потока моечные в трех направлениях, или с помощью автоматизированного пластины ротатор.
  3. Применение противомикробных дисков на привитых пластин агара.
    1. Применение внимательно диски на поверхности высушенных инокулированных чашках с агаром вручную или с помощью диска восприимчивость дозатор.
    2. Инкубировать на соответствующем Температура и атмосфера, как описано в тестирования антимикробной восприимчивости методом EUCAST диффузии диска (Версия 3.0, апрель 2013, www.eucast.org).

5 Автоматизированная основе ПЦР диагностической проверки для обнаружения MRSA

  1. Использование микропипетки, передать 50 мкл культуральной крови гранул во флакон реагента образца, снабженного MRSA автоматизированной ПЦР-диагностики на основе тест-комплект и вихрь в течение 20 сек.
  2. Использование 1 мл микропипетки, обойтись образец в образце порт картриджа. Вставьте картридж в автоматизированной системе ПЦР и начать испытание, как описано производителем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В исследовании, проведенном Prod'hom соавт. 15, бактериальные осадки, полученные хлорида аммония для лизиса центрифугирования 122 положительной культуры крови от 78 пациентов были проанализированы с помощью MALDI-TOF MS. Из 122 положительных культуры крови, 95 (77,9%) были правильно определены на уровне видов и одного (0,8%) на уровне рода. Остальные 26 (21,3%) культуры крови гранулы не дал надежную идентификацию по MALDI-TOF. Среди тех, 21 были грамположительных бактерий, включая 13 стрептококков и 5 коагулазонегативных стафилококков. Важно отметить, что 10 из 13 неопознанных стрептококков были пневмококк, который часто обладают трудное к лизируют капсулу и вряд ли отличается от видов S. группа тШз помощью MALDI-TOF MS. Пять грамотрицательные бактерии не были определены MALDI-TOF, среди которых четыре трудных для лизировать инкапсулируются видов бактерий, включая два Klebsiella пневмонии и двух Haemopворотах гриппа. Таким образом, точное определение с помощью MALDI-TOF был получен в 78,7% от культуры гранул крови, которая представляет собой эффективную работу по сравнению с 84,1% идентификации, полученной из обычной идентификации бактериальных колоний, выросших на чашках с агаром 11.

Производительность автоматизированной микробной системы идентификации бактерий (ID) и для АСТ был протестирован на 278 бактериальных гранул положительной культуры крови для грамположительных кокков в кластере и грамотрицательных бактерий. Эти результаты были по сравнению с обычными результатами, полученными с автоматизированными микробных системных карт от колоний, выросших на чашках с агаром следующих субкультуры положительной культуры крови на соответствующих средствах массовой информации 16. Прямая идентификации с использованием микробных идентификационных карт системы идентификации могут быть использованы при идентификации бактерий с помощью гранул MALDI-TOF MS не удалось. По сравнению с окончательной идентификации по MALDI-TOF MS, правильной идентификации смикробные ID карты системы идентификации наблюдалось в 99% энтеробактерий, 74% стафилококков, 71% не ферментативных грамотрицательных бактерий и 33% другой грамположительных кокков. Ошибочное определение наблюдалось в 11% от общего числа случаев, тогда как 8% от бактериальных гранул не дал идентификацию. В общей сложности 220 бактериальных гранул в том числе 87 Enterobacteriaceae и 133 стафилококки были проанализированы на AST с автоматизированной микробной системы AST GN26 и АСТ 580 карт 16. Полученные результаты были проанализированы в соответствии с определениями, приведенными в США продуктов питания и лекарствами (FDA) для толкования результатов соглашения, которое определенных ложное восприимчивы как очень серьезной ошибки (VME) и ложный устойчивы как серьезной ошибки (ME). АСТ получены из прямой инокуляции культуры крови гранул по сравнению с прививки от колоний, выросших на чашках с агаром показал 0,1% VME и 0,3% меня за энтеробактерий, и 0,7% VME и 0,1% меня за стафилококков. Таким образом, эффективность ASTкарты Инокулированные непосредственно с культурой гранул крови находятся в согласии с критериями эффективности принятых FDA.

Производительность ПЦР-технологии амплификации нуклеиновых кислот MRSA теста таргетирования спа, Мека и гены SCC непосредственно нанесли на посев крови золотистого стафилококка бактериальных гранул определенных MALDI-TOF MS 17. На основании 106 случаях, обнаружение устойчивости к метициллину выставлены чувствительность 99% и 100% специфичностью. Интересно, что среднее время сообщить нуклеиновых результатов технологии усиления кислоты из культуральной крови положительности был равен 201 мин (диапазон 100-430), тогда как среднее время от идентификации MALDI-TOF сообщать подобные результаты равнялась 97 мин (диапазон 25- 250).

Рисунок 1
Рисунок 1 до и после MALDI-TOF эра. По сравнению с обычными диагностических подходов, которые включают O / N субкультуру образца, идентификация MALDI-TOF MS могут быть выполнены в течение нескольких минут после предоставления образцов на диагностической лаборатории. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2 Технологическая схема обработки культуры крови от пробовать к идентификации MALDI-TOF MS. Если посев крови положительны, бактериальный осадок подготовлен хлорида аммония для лизиса центрифугирования. Этот бактериальный осадок затем используется для прямого идентификации по MALDI-TOF MS. Идентификация MALDI-TOF MS можно получить в течение 30 до 60 минут FO llowing посев крови положительность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 Многие вниз по течению приложений, включая Грама, MALDI-TOF MS идентификации, АСТ, используя автоматизированные системы и / или диск диффузии анализы и быстрое ПЦР-тестирования, такие как точки тестирования уход ПЦР (POCT-ПЦР) для обнаружения MRSA может выполняться непосредственно на культуры крови бактериальный осадок. Прямое тестирование из бактериальных культур крови гранул значительно уменьшить время оборота, чтобы сообщить ID и AST результаты которых имеет решающее значение для улучшения результатов пациентов, страдающих от инфекций кровотока. 5fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 Протокол лизис центрифугирования хлорида аммония позволяет получать обогащенный и очищенный бактериальный осадок от положительных культуральных бульонах крови. Грама положительной культуры крови кишечной палочки, коагулазонегативные Staphylococcus волосистой части головы и Streptococcus dysgalactiae выполняется до и после приготовления посев крови бактериальный осадок. Классические морфологии стафилококков в кластерах и стрептококков в цепях легче наблюдается в родной культуры крови бульона, чем в культуральной крови бактериальный осадок. Шкала бар = 25 мкм.= "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По сравнению с обычными положительной культуры крови диагностических подходов, быстрое приобретение бактериальной гранулы с помощью аммония хлорида лизиса центрифугирования подход сократить время, чтобы сообщать идентификацию на 16 до 24 часов, и время, чтобы сообщить AST на 24 до 48 часов (рисунки 1 и 3).

Быстрое внедрение соответствующей антибиотикотерапии имеет решающее значение для улучшения результатов пациентов, страдающих от инфекций кровотока. Таким образом, раннее выявление инфекционных агентов в течение 1 ч с последующим быстрым АСТ, полученной в примерно от 8 до 16 часов представляет собой существенное влияние на клиническом лечении пациентов с сепсисом. Быстрое отчетности окрашивания Грама уже был связан с большим влиянием на антимикробной терапии и, таким образом, с уменьшением заболеваемости пациентов и смертности 6,7. Грама культуральной крови бактериальный осадок может быть сделано для повышения чувствительности при Грама из мкрOOD культуральный бульон отрицательный или слабо положительной (фиг.4). Однако Грама осуществляется на родном культуры крови бульона рекомендуется соблюдать типичные морфологии, таких как стафилококки в кластерах или стрептококков в цепях. В недавнем проспективном исследовании, проведенном на 202 случаев инфекции кровотока, идентификация MALDI-TOF MS от культуры гранул крови показал влияние в антибактериальной терапии в 35,1% случаев, тогда как Граму была только дополнительное воздействие в 20% случаев 8. Интересно, что максимальная разница влияния между Грама и MALDI-TOF MS отчетности идентификации на клиническом лечении наблюдалось, когда бактерии, связанные с повышением устойчивости к антибиотикам, такие как AmpC продуцирующих энтеробактерий были определены MALDI-TOF MS. Аналогично, Martiny др. Показали, что MALDI-TOF MS быстрая идентификация может закрепить адаптацию антибиотикотерапии в 13,4% случаев, тогда как ретроспективном шпилькиу выполняться Стоункинга соавт. предположили, что быстрая идентификация микроорганизмов, вызывающих бактериемию может помочь регулировать эмпирическую терапию в 77% случаев либо путем введения дополнительного антибиотик не распространяется на начальном режиме или путем уменьшения спектр антибиотиков 18,19 . Кроме того, использование быстрой ПЦР-анализа, основанного, например, в технологии амплификации нуклеиновой кислоты MRSA следующие S. выявление стафилококка на MALDI-TOF MS от культуры крови гранул позволило обеспечить наиболее подходящий антибактериальной терапии менее 4 часов для пациентов, страдающих от S. стафилококк бактериемия 17. При исключении пациентов с аллергией на пенициллин, использование технологии амплификации нуклеиновых кислот MRSA разрешено значительное снижение анти-MRSA антибиотиков злоупотребления, такие как гликопептидами с 26,1% до 8,1%. Вместе, эти данные свидетельствуют о том, что быстрое последовательное отчетность Грама, идентификации MALDI-TOF MS и быстрое основе ПЦРДни рождения Ssay от культуры крови гранул значительно улучшает антибактериальную терапию и, следовательно, клиническое управление, а также результаты лечения больных, страдающих от инфекций кровотока.

MALDI-TOF MS позволило 78,7% правильную идентификацию культуры гранул крови, которая очень хорошие показатели по сравнению с скоростью идентификации 84,1%, полученной с помощью обычного MALDI-TOF MS выполнены на чистых колоний, выросших на чашках с агаром. Более, что 50% инфекций кровотока обусловлены видов бактерий, таких как энтеробактерий, золотистого стафилококка, синегнойной палочки и энтерококков. Эти бактерии эффективно идентифицируется MALDI-TOF MS, которые, скорее всего положительно повлиять на хорошие показатели идентификации MALDI-TOF MS выполненной непосредственно на культуры крови бактериальных гранул. Низкая производительность для идентификации некоторых видов бактерий по MALDI-TOF MS осуществляется на культуры гранул крови в основном за счет подобных факторовчем те, которые наблюдались в обычной идентификации из чистого колоний, выросших на чашках с агаром. Например, несколько микробные виды, такие как стрептококки, принадлежащих к Mitis группы и коагулазонегативных стафилококков тесно связаны и отождествляется с низкой точностью MALDI-TOF MS. Кроме того, конкретный состав бактериальной клеточной стенки грам-положительных бактерий или наличие плотной капсулы, наблюдаемой в бактериальных видов, таких как Klebsiella пневмонии значительно снизить эффективность лизиса и, следовательно, производительность идентификации MALDI-TOF MS. Наконец, низкая производительность MALDI-TOF MS для идентификации анаэробных бактерий, в основном, вследствие неполного и плохого представления этих бактерий в базе данных MALDI-TOF.

Небольшое уменьшение производительности идентификации MALDI-TOF MS от культуры гранул в крови по сравнению с обычной идентификации из чистого колоний может быть связано с остаточной белка в крови Components или недостаточного количества бактерий, полученных после лизиса-центрифугирования. Аналогично, наблюдаемые различия с автоматизированными микробных системных карт привитых непосредственно с культурой крови гранул по сравнению с теми, засевают изолированных колоний может быть вызвано компонентов культуры остаточной крови, таких как белки, клетки крови и средних крови соединений, которые могут мешают росту бактерий в Автоматизированная микробная система карт и может оказать существенное влияние как на идентификации и АСТ. Кроме того, результаты АСТ, полученные с помощью автоматизированных систем микробных должны быть проверены на диск диффузии анализов также выполняемых непосредственно на культуры крови бактериальных гранул для проверки результаты некоторых антибиотиков, известных представить значительные расхождения по сравнению с традиционными подходами. Тем не менее, прямой посев автоматизированных микробных системных карт с культурой крови гранул представляет собой прекрасную ID и AST производительность как для энтеробактерий и Staphylococci.

Таким образом, бактериальный осадок получен хлорида аммония для лизиса центрифугирования положительных культур крови была подтверждена непосредственно выполнять несколько ниже по течению приложений, позволяющих быстро отчетности существенных результатов, таких как ID и АСТ в значительно меньшей ТАТ по сравнению с традиционными подходами. Кроме того, дополнительные приложения, такие как расширенного спектра β-лактамаз (ESBLs) тестирования были проверены на аналогичной лизиса центрифугирования положительной культуры крови методологий 20 предполагая, что они могут также применяться на бактериальной осадка, полученного с протоколом, описанным в этой работе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы благодарим техников бактериологической лаборатории Университетского больничного центра Лозанны за помощь в реализации методы в лаборатории.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).

Tags

Иммунологии выпуск 92 посев крови бактериологические идентификация тестирование чувствительности к антибиотикам MALDI-TOF MS.
Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G.,… More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter