Introduction
L'agar morbido dosaggio formazione di colonie è una tecnica largamente usata per valutare trasformazione cellulare in vitro. Storicamente, un kit, la clonogenica, descritto da Puck et al. Nel 1956 è stato utilizzato per valutare la capacità delle cellule di formare colonie 1. In questa tecnica, le cellule sono state disperse su una piastra di coltura e coltivate in presenza di cellule feeder o terreno condizionato per fornire fattori di crescita necessari. Il limite di questa tecnica è che è fornito solo informazioni riguardanti la formazione di colonie. Le cellule normali viene impedito di crescita ancoraggio-indipendente, a causa di un particolare tipo di morte apoptotica, chiamato anoikis 2. Tuttavia, cellule trasformate sono in grado di crescere e dividersi senza legarsi ad un substrato. Per capitalizzare questo concetto, i ricercatori hanno sviluppato il soft agar test formazione di colonie. La morbida agar test formazione di colonie da allora è stato modificato, in anni più recenti, per affrontare spesigenze ecific. Una variante prevede l'incorporazione di colorante fluorometrica per consentire high-throughput conteggio delle colonie. Un'altra variante prevede l'utilizzo di una soluzione di agar specializzata per consentire il recupero di cellule vitali dopo la formazione di colonie quando sono necessari campioni di proteine o di DNA.
Nel tradizionale morbido agar saggio formazione di colonie, le cellule sono coltivate in uno strato di agar morbido mescolato con mezzo di coltura cellulare che poggia su un altro strato di agar molle, anche mescolato con mezzo di coltura cellulare, ma che contengono una maggiore concentrazione di agar. Ciò impedisce alle cellule di aderire alla piastra di coltura, ma consente cellule trasformate per formare colonie visibili. La logica dietro questa tecnica è che le cellule normali dipendono da cellula a contatto della matrice extracellulare in grado di crescere e dividere. Al contrario, le cellule trasformate hanno la capacità di crescere e dividere a prescindere dal loro ambiente circostante. Pertanto, cellule capaci di formare colonie in modo di ancoraggio indipendente erano considered trasformare e cancerogene. L'obiettivo generale di questo metodo consiste nel misurare questa capacità nelle cellule in modo semi-quantitativo e rigoroso.
La via di segnalazione Wnt è fondamentale in embriogenesi e spesso de-regolato nella tumorigenesi 3-6. Ci sono diversi percorsi associati con segnalazione Wnt. Il percorso canonico prevede di segnalazione Wnt e regolazione della trascrizione genica a valle attraverso i suoi effetti sul coactivator trascrizionale beta-catenina. Wnts segnale anche attraverso diversi percorsi non canonici, per esempio, il percorso planare polarità cellulare, che regola gli elementi coinvolti nella struttura del citoscheletro 7, e la via di Wnt-calcio, che regola il rilascio del calcio dal reticolo endoplasmatico 8. Ligandi Wnt esercitano la loro attività attraverso il legame dei recettori Frizzled. Anche se diversi Wnts hanno dimostrato di essere sovraregolata nel cancro del polmone, Wnt7a ha dimostrato di essere down-regolato in non-smalcancro ai polmoni l cellulare attraverso metilazione del promotore 9. Wnt7a lega Fzd9 e agisce come un soppressore del tumore attraverso un percorso non canonico. Restauro di Wnt-7a e FZD-9 inibisce la crescita di non a piccole cellule di cancro polmonare delle cellule 10. Gli effetti di Wnt7a / Fzd9 sono mediati attraverso l'attivazione di ERK-5, che a sua volta, attiva perossisomi γ del recettore proliferator-activated (PPAR-gamma) 11,12. Qui, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di Wnt7a e Fzd9 traduce nella soppressione della crescita ancoraggio-indipendente di una linea cellulare di carcinoma del polmone murino. CMT167 cellule murine sono state derivate da un carcinoma polmonare nei topi C57BL / topi lcrf 13 e sono stati stabilmente trasfettate con Wnt7A e Fzd9. Sovraespressione di Wnt7A e Fzd9 sono stati confermati da-PCR quantitativa (Q-PCR) e la funzionalità di Wnt7A e Fzd9 sovraespressione è stata confermata attraverso l'attivazione a valle del PPAR.
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Protocol
1. Preparazione dei materiali e reagenti
- Etichettare ciascun pozzetto di una coltura di tessuti trattati 6 pozzetti in modo appropriato per ogni linea cellulare o condizione sotto inchiesta.
- Preparare 2x terreno di coltura cellulare sciogliendo 1 g di polvere media e 0,2 g di bicarbonato di sodio in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml.
- Passare questo mezzo attraverso un filtro da 0,2 micron per sterilizzare.
- Aggiungere componenti aggiuntivi necessari per il normale coltura della linea cellulare di interesse. Ad esempio, crescere CMT linea 167 cellule in terreno RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina soluzione. Medio Riscaldare a 37 ° C in bagno d'acqua calda prima dell'uso.
- Preparare 1x terreno di coltura cellulare a parte come si farebbe per la coltura delle cellule normali della linea di cellule di interesse.
- Preparare 1% nobile agar aggiungendo 1 g di agar nobile a 100 ml di acqua deionizzata.
NOTA: agar Noble non si dissolvono completamente con l'agitazione da solo. - Preparare0,6% nobile agar aggiungendo 0,6 g di agar nobile a 100 ml di acqua deionizzata. Entrambe le soluzioni agar possono essere realizzati in 100 ml bottiglie di vetro con coperchi richiudibili per la conservazione a lungo termine.
- Autoclave le miscele di agar nobili per sterilizzare. Queste miscele possono essere fatte in anticipo e conservati a 4 ° C, ma devono essere riscaldati nuovamente al momento dell'esperimento fino agar si è completamente dissolto.
- Preparare la soluzione di cloruro di tetrazolio nitroblue facendone / ml di soluzione 1 mg in PBS 1x (8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na 2 HPO 4, e KH 2 PO 4 0,24 g di H 2 O a volume finale di 1000 ml ). Questo verrà utilizzato alla fine dell'esperimento per colorare le colonie.
2. placcatura di strato inferiore di Agar
- Allentare il tappo sulla bottiglia del 1% nobile agar e forno a microonde per circa 1-2 min. Mentre il riscaldamento in un forno a microonde, monitorare attentamente la soluzione per evitare bollente. Si continua il riscaldamento, mentre la miscelazione in modo intermittente,fino agar è completamente sciolto e la soluzione è limpida.
NOTA: Usare guanti resistenti al calore per gestire pallone dopo il riscaldamento. In caso contrario si potrebbe provocare ustioni o lesioni gravi. - Posizionare soluzione agar fuso e pre-riscaldato terreno di coltura 2x in un secchio di ghiaccio riempito con acqua calda (42 ° C). Collocare anche una provetta conica da 50 ml in un portaprovette nel secchio di ghiaccio con acqua calda. Trasferimento secchio per cappa di coltura cellulare per le fasi successive.
- Per lo strato inferiore di agar, avrete bisogno di 1,5 ml di una miscela di agar e medie per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
- Per assicurare un'adeguata quantità di miscela, preparare un totale di 12 ml per ogni piastra da 6 pozzetti.
- Inizia con l'aggiunta di 6 ml di terreno di coltura per il tubo conico da 50 ml e poi 6 ml di soluzione di nobile agar 1%.
- Invertire il tubo conico più volte per mescolare. Lavorare a passo svelto si evita il rapido indurimento di agar molle.
- Elaborare circa 5,5 ml di composto in un 5 ml pi sierologicapipetta.
- Lasciare le bolle d'aria a salire al top della colonna pipetta prima di depositare 1,5 ml di questa miscela in ogni pozzetto. Usare cautela per evitare il deposito di eventuali bolle d'aria nei pozzetti della piastra.
- Coprire le piastre e lasciare la miscela agar per solidificare a temperatura ambiente, in cappuccio coltura cellulare, per 30 min.
3. Placcatura Lo strato superiore di cellule contenenti Agar
- Una volta che lo strato inferiore di agar è solidificato, iniziare la preparazione dello strato superiore.
- In primo luogo, le cellule raccolto mediante tripsinizzazione e diluire li 1: 5 in terreno di coltura (ad esempio per 1 ml di tripsina, aggiungere 4 ml di terreno) in una provetta conica da 15 ml.
- Contare le cellule e calcolare il numero di cellule necessarie per pozzetto per preparare una sospensione cellulare finale in questo momento. Questo numero può variare a seconda del tipo di cellula. Utilizzare 5.000 cellule / pozzetto come punto di partenza e regolare come necessario. Per questo numero di cellulare, si dovrebbe preparare una sospensione di cellule di 6667 cellule / ml (cioè ogni well riceverà 0,75 ml di questa sospensione e 0,75 ml di agar per un volume totale di 1,5 ml; la concentrazione di cellule sarà diluito 1: 2 per un conteggio finale di cellule totale di 5.000).
- Il volume di sospensione cellulare necessaria per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti sarà nuovamente 1,5 ml. Preparare sospensione cellulare supplementare per un totale di 12 ml per piastra da 6 pozzetti.
- Sciogliere soluzione agar 0,6% in un forno a microonde come sopra e riporre in secchiello per il ghiaccio contenente acqua calda con un tubo da 50 ml in un supporto tubo e la sospensione cellulare finale dal punto 3.3.
- Trasferire il secchiello del ghiaccio con il fuso 0,6% agar per cappa di coltura cellulare per le fasi successive.
- Mescolare 0,6% agar e sospensione di cellule in un rapporto 1: 1, la preparazione di un volume totale di 12 ml per piastra da 6 pozzetti. 1,5 ml saranno necessari per bene, ma in più devono essere effettuate come sopra.
- Pipettare 6 ml di sospensione cellulare nel tubo conico da 50 ml.
- Poi aggiungere 6 ml di 0,6% agar al tubo.
NOTA: La temperatura di questa miscela deve esseretenuto circa 42 ° C per evitare il rapido indurimento e per massimizzare la sopravvivenza cellulare. - Lavorando in fretta, pipetta questa miscela 2-3x per distribuire le cellule, poi elaborare 5,5 ml di composto in un 5 ml pipetta sierologica.
- Consenti eventuali bolle d'aria a salire a cima della colonna pipetta prima di depositare 1,5 ml di questa miscela in ogni pozzetto. Usare cautela per evitare il deposito di eventuali bolle d'aria nei pozzetti della piastra.
- Lasciare miscela cellulare / agar per solidificare a temperatura ambiente, in cappuccio coltura cellulare, per 30 minuti prima di mettere in un 37 ° C coltura cellulare incubatore umidificato.
- Il tempo necessario per un'adeguata formazione di colonie varia per ogni linea cellulare, tipicamente circa 21 giorni.
- Uno strato di terreno di coltura deve essere mantenuta al di sopra dello strato superiore di agar per prevenire l'essiccamento. 100 pl di mezzo aggiunto due volte a settimana è sufficiente per questo scopo.
4. Colorazione le piastre e il conteggio delle colonie
- Cellule Macchia con l'aggiunta di 200 _6; l di soluzione di cloruro nitroblu tetrazolio per pozzetto e incubando le piastre per una notte a 37 ° C.
- Una volta che le colonie sono macchiati, scattare fotografie di pozzi con un imager e contare le colonie utilizzando il software di analisi delle immagini.
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Representative Results
L'espressione di Wnt7A e Fzd9 in CMT167 cellule è efficace nella soppressione del tumore, come illustrato dal nostro morbido agar test formazione di colonie. In via preliminare, abbiamo utilizzato Q-PCR per dimostrare che Wnt7A e Fzd9 mRNA sono espressi in livelli bassi in CMT167 cellule. Cellule CMT167 mostrato bassi livelli di endogena Wnt7A e Fzd9 rispetto a MLE-12 celle, un murino linea cellulare epiteliale polmonare SV40-trasformato (Figura 1). Abbiamo poi trasfettato CMT167 cellule con due vettori retrovirali iperespressione esprimere costrutti umani di Wnt7A (LNCX-Wnt7A) e Fzd9 (LPCX-Fzd9) per creare una linea cellulare stabile che esprime sia Wnt7A e Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Abbiamo confermato espressione di Wnt7A e Fzd9 da Q-PCR in questa linea cellulare (Figura 2). Come il nostro lavoro precedente ha dimostrato, PPAR-gamma è un effettore a valle di segnalazione Wnt7A / Fzd9. Vie di segnalazione Wnt sono diversi. Pertanto, la corretta espressione e l'attivazione di una particolare Wnt e del suo recettore FZD devono essere asinised utilizzando un effettore a valle che è noto per essere attivato dalla coppia Wnt / FZD di interesse. Per Wnt7A e Fzd9, PPAR-gamma è stato scelto per questo motivo. Abbiamo trasfettato CMT167 cellule overexpressing vettori vuote (LNCX / LPCX) o Wnt7A / Fzd9 con un costrutto reporter di luciferasi contenente un elemento di risposta PPAR. Abbiamo dimostrato che la nostra linea di cellule / Fzd9 CMT167 LL Wnt7A aveva quasi sei volte maggiore attività di PPAR-RE (Figura 3). Infine, come accennato in precedenza, per confermare l'attività di soppressore del tumore di Wnt7A e Fzd9 in vitro, abbiamo eseguito un morbido agar test formazione di colonie. CMT167 vettore che esprime e Wnt7A / Fzd9 esprimere linee cellulari stabili sono stati piastrati su piastre di agar molle e ha permesso di formare colonie per due o tre settimane. Cellule CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 formano colonie meno significativo rispetto alle cellule trasfettate con vettori, che illustra la funzione di soppressore tumorale Wnt7A e Fzd9 (Figura 4). Le foto sono state scattate di tutti i piatti, e colonies sono state contate utilizzando un software di imaging e di imaging.
Figura 1: diminuzione dei livelli di Wnt7A e Fzd9 mRNA nelle cellule CMT167 rispetto a MLE-12 celle analisi Q-PCR è stata effettuata per determinare i livelli di mRNA di Wnt7a e Fzd9 normalizzati per GAPDH.. Livelli in CME167 cellule di carcinoma del polmone murino sono stati confrontati con quelli di MLE-12 polmone di topo le cellule epiteliali SV40-trasformati, che sono stati normalizzati a 1,0. CMT167 cellule mostravano livelli inferiori di Wnt7a (A) e Fzd9 (B) mRNA rispetto a MLE-12 cellule.
Figura 2:. Sovraespressione di Wnt7a / Fzd9 in CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 linea cellulare stabile Wnt7A / Fzd9 iperespressione stabile costrutti umani sono stati realizzati con un LN CX vettore retrovirale. Q-PCR è stata effettuata per Wnt7A e Fzd9, e livelli di mRNA sono stati normalizzati per GAPDH in cellule trasfettate vuoto-vettoriali e nelle cellule overexpressing Wnt7A / Fzd9. Cellule CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 espressi alti livelli di Wnt7a (A) e Fzd9 (B) mRNA.
Figura 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 iperespressione stabile mostre linea cellulare un aumento dell'attività del promotore PPAR-RE cellule overexpressing stabili CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 o vettore vuoto CMT167 LNCX / LPCX sono state transfettate con una risposta PPAR elemento promotore della luciferasi plasmide utilizzando Lipofectamine reagente.. Attività del promotore è stato quantificato rispetto alle cellule trasfettate vettori, dove l'attività del promotore è stato normalizzato a 1,0. CMT167 LL Wnt7a / cellule overexpressing stabili Fzd9 ha mostrato un circa sei volte maggiore attività del promotore PPAR.
Figura 4:. Morbido Agar colonia saggio Formazione di CMT167 LNCX / LPCX cellule che esprimono-vettoriale e CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 overexpressing cellule che esprimono Vector CMT167 LNCX / LPCX cellule e CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 overexpressing cellule sono state piastrate in un morbido formazione di colonie agar test per protocollo sopra descritto. CMT167 LL Wnt7A / cellule Fzd9 ha mostrato una marcata riduzione della formazione di colonie. Pozzi rappresentativi che mostrano colonie per ogni linea cellulare. Immagine di pozzi sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.
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Discussion
A conferma vitro della funzione soppressiva tumorale di proteine di segnalazione è difficile. Uno dei test più rigorosi a disposizione per indagare questa proprietà è il soft agar saggio di formazione di colonie. Qui, abbiamo illustrato il morbido test formazione di colonie agar utilizzando una linea cellulare di carcinoma del polmone murino stabile sovraespressione Wnt7a e Fzd9 rispetto alla sua linea cellulare CMT167 dei genitori.
Ci sono diversi punti importanti da considerare per quanto riguarda il test agar molle. La fase più critica in questo saggio è placcatura delle cellule. Conta delle cellule deve essere accurata, e la soluzione di agar non deve essere troppo caldo. Ove non vengano costituite le colonie, le cellule potrebbero essere stati danneggiati a causa di stress da calore. In questa situazione, il test deve essere ripetuto, prendendo precauzioni per mantenere la temperatura agar come vicino a 42 ° C come possibile. In alternativa, un maggior numero di cellule può essere placcato.
Ci sono alcune limitazioni al dosaggio soft agar.Una tale limitazione è che ci vogliono due o tre settimane per il completamento. Un altro è che non consente il recupero delle cellule dopo il completamento. Modifiche di questa tecnica impiegano soluzioni agar specializzate per consentire alle cellule di essere raccolte per DNA o proteine al termine del test. Metodi alternativi utilizzano anche colorante fluorometrica per consentire l'analisi ad alto rendimento. Tuttavia, il tradizionale morbido agar saggio formazione di colonie rimane uno dei test più rigorosi per la conferma della crescita cellulare ancoraggio-indipendente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
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