Introduction
Le dosage de formation de colonies sur gélose molle est une technique largement utilisée pour évaluer la transformation cellulaire in vitro. Historiquement, un autre test, le test clonogénique, décrit par Puck et al., En 1956, a été utilisé pour évaluer la capacité des cellules à former des colonies 1. Dans cette technique, les cellules ont été dispersées sur une plaque de culture et cultivées en présence de cellules nourricières »ou« milieu conditionné pour fournir des facteurs de croissance nécessaires. La limitation de cette technique est qu'elle ne fourni des informations concernant la formation de colonies. Les cellules normales sont empêchés de croissance indépendante de l'ancrage, en raison d'un type particulier de la mort par apoptose, appelé anoïkis 2. Toutefois, les cellules transformées ont la capacité de croître et de se diviser sans se lier à un substrat. Pour capitaliser sur ce concept, les chercheurs ont développé le test de formation de colonies sur gélose molle. Le test de formation de colonies sur gélose molle a depuis été modifié, au cours des dernières années, pour répondre specific besoins. Une variante consiste incorporation de colorant fluorimétrique pour permettre à haut débit comptage de colonies. Une autre variante consiste à utiliser une solution d'agar spécialisé pour permettre la récupération de cellules viables après la formation de colonies lorsque les échantillons de protéines ou d'ADN sont nécessaires.
Dans le dosage souple classique de formation de colonies agar, les cellules sont cultivées dans une couche d'agar mou mélangé avec un milieu de culture cellulaire qui repose sur une couche de gélose molle, également mélangée avec du milieu de culture de cellules, mais contenant une concentration plus élevée de la gélose. Cela empêche les cellules d'adhérer à la plaque de culture, tout en permettant aux cellules transformées de former des colonies visibles. La raison de cette technique est que les cellules normales de la cellule dépendent de la matrice extracellulaire de contact pour être en mesure de croître et de se diviser. A l'inverse, les cellules transformées sont capables de croître et de se diviser sans tenir compte de leur environnement. Par conséquent, des cellules capables de former des colonies d'une manière indépendante de l'ancrage sont considered à transformer et cancérigènes. L'objectif global de cette méthode est de mesurer cette capacité dans les cellules d'une manière semi-quantitative et rigoureuse.
La voie de signalisation Wnt est critique dans l'embryogenèse et souvent dérégulé dans la tumorigenèse 6.3. Il existe de multiples voies impliquant la signalisation Wnt. La voie canonique implique la signalisation Wnt et régulation de la transcription du gène en aval par ses effets sur la co-activateur transcriptionnel beta-caténine. Le signal Wnt également à travers plusieurs voies non canoniques, par exemple, la voie plane de la polarité cellulaire, qui régule des éléments participant à la structure du cytosquelette 7, et la voie Wnt-calcium, qui régule la libération de calcium à partir du reticulum endoplasmique 8. Ligands Wnt exercent leur activité grâce à des récepteurs Frizzled contraignant. Bien que plusieurs Wnt ont été montré pour être régulés à la hausse dans le cancer du poumon, Wnt7a a été montré pour être régulé à la baisse en non-Smalle cancer du poumon de cellules L à travers la méthylation du promoteur 9. Wnt7a lie Fzd9 et agit comme un suppresseur de tumeur par l'intermédiaire d'une voie non-canonique. La restauration de Wnt-7a et FZD-9 inhibe la croissance de non-petites cellules du cancer du poumon à grandes cellules 10. Les effets de Wnt7a / Fzd9 sont médiés par l'activation de ERK-5, ce qui, à son tour, active peroxisome γ du récepteur activé par les proliférateurs de (PPARy) 11,12. Ici, nous montrons que la surexpression de Wnt7a Fzd9 et se traduit par la suppression de la croissance indépendante de l'ancrage d'une lignée de cellules de carcinome pulmonaire murin. Cellules CMT167 murins ont été dérivées d'un carcinome du poumon chez les souris C57BL / souris LCRF 13 et ont été transfectées de manière stable avec Wnt7a et Fzd9. La surexpression de Wnt7a Fzd9 et ont été confirmés par PCR quantitative (Q-PCR) et la fonctionnalité de Wnt7a et Fzd9 surexpression a été confirmé par l'activation en aval de PPARy.
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Protocol
1. Préparation des matériaux et réactifs
- Étiqueter chaque puits d'une culture de tissu traité plaque de 6 puits appropriée pour chaque ligne ou état cellule objet d'une enquête.
- Préparer 2x milieu de culture cellulaire en dissolvant 1 g de produit de poudre et 0,2 g de bicarbonate de sodium dans de l'eau désionisée à un volume final de 50 ml.
- Passer ce milieu à travers un filtre de 0,2 pm pour stériliser.
- Ajouter des composants supplémentaires nécessaires pour la culture normale de la lignée cellulaire d'intérêt. Par exemple, la ligne 167 CMT croître des cellules dans un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et de la pénicilline / streptomycine solution à 1%. Milieu chaud à 37 ° C dans un bain d'eau chaude avant de les utiliser.
- Préparer 1x milieu de culture cellulaire séparément comme vous le feriez pour la culture cellulaire normale de la lignée cellulaire d'intérêt.
- Préparer la gélose noble à 1% par addition de 1 g de gélose noble à 100 ml d'eau désionisée.
REMARQUE: agar Noble ne se dissout pas complètement avec agitation seul. - Préparer0,6% d'agar noble en ajoutant 0,6 g de gélose noble à 100 ml d'eau désionisée. Les deux solutions d'agar peuvent être réalisées dans des bouteilles de 100 ml en verre avec des couvercles pouvant être fermés pour le stockage à long terme.
- Autoclave les mélanges agar nobles à stériliser. Ces mélanges peuvent être effectués à l'avance et stockées à 4 ° C, mais doivent être chauffées à nouveau au moment de l'expérience jusqu'à dissolution complète de l'agar.
- Préparer une solution de chlorure de tétrazolium nitrobleu en faisant un / ml de solution mère à 1 mg dans 1 x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,24 g de KH 2 PO 4 dans H 2 O à un volume final de 1000 ml ). Elle sera utilisée à la fin de l'expérience pour colorer les colonies.
2. Dépôt de couche de fond de Agar
- Desserrer le bouchon sur la bouteille de 1% d'agar noble et micro-ondes pendant environ 1-2 min. Tout en chauffant dans un four micro-ondes, surveiller étroitement la solution pour éviter de déborder. Continuer à chauffer, tout en mélangeant de façon intermittente,jusqu'à ce que l'agar soit complètement dissous et la solution est claire.
REMARQUE: Utiliser des gants résistant à la chaleur pour traiter ballon après le chauffage. Ne pas le faire peut causer des brûlures ou des blessures graves. - Placez solution d'agar fondu et milieu de culture 2x préchauffé dans un seau à glace rempli avec de l'eau chaude du robinet (42 ° C). Également placer un tube conique de 50 ml dans un support de tube dans le seau à glace avec de l'eau chaude. Transfert seau à la culture cellulaire capot pour les étapes suivantes.
- Pour la couche inférieure de l'agar, vous aurez besoin de 1,5 ml d'un mélange d'agar et milieu par puits d'une plaque à 6 puits.
- Afin d'assurer une quantité suffisante du mélange, préparer un total de 12 ml pour chaque plaque de 6 puits.
- Lancer en ajoutant 6 ml de milieu de culture à 50 ml le tube conique et ensuite 6 ml de la solution de gélose noble à 1%.
- Inverser le tube conique plusieurs fois pour mélanger. Travailler à un rythme soutenu permettra d'éviter un durcissement prématuré de la gélose molle.
- Dresser environ 5,5 ml de mélange dans un 5 ml pi sérologiquepipette.
- Laissez les bulles d'air de remonter en haut de la colonne de la pipette avant de déposer 1,5 ml de ce mélange dans chaque puits. Faites preuve de prudence pour éviter le dépôt de toutes les bulles d'air dans les puits de la plaque.
- Couvrir les plaques et laisser reposer le mélange de la gélose se solidifier à la température ambiante, dans une culture de cellules d'aération, pendant 30 min.
3. Dépôt de la couche supérieure de gélose cellules contenant
- Une fois que la couche inférieure de la gélose est solidifiée, commencer la préparation de la couche supérieure.
- Tout d'abord, les cellules de récolte par traitement à la trypsine et les diluent 1: 5 dans un milieu de culture (par exemple, pour 1 ml de trypsine, ajouter 4 ml de milieu) dans un tube conique de 15 ml.
- Compter les cellules et calculer le nombre de cellules par puits nécessaires pour préparer une suspension de cellules finale à ce stade. Ce nombre peut varier en fonction du type de cellule. Utilisez 5.000 cellules / puits comme un point de départ et ajuster si nécessaire. Pour ce numéro de cellule, vous préparer une suspension cellulaire de 6667 cellules / ml (soit chaque well recevra 0,75 ml de cette suspension et 0,75 ml de gélose pour un volume total de 1,5 ml; la concentration de cellules est également dilué à 1: 2 pour un nombre total de cellules finale de 5000).
- Le volume de suspension cellulaire nécessaire par puits d'une plaque à 6 puits sera à nouveau 1,5 ml. Préparer supplémentaire suspension cellulaire total de 12 ml par plaque de 6 puits.
- Faire fondre solution de gélose à 0,6% dans un four micro-ondes comme ci-dessus et le placer dans un seau à glace contenant de l'eau chaude avec un tube conique de 50 ml dans un support de tube et la suspension de cellules finale de l'étape 3.3.
- Transférer le seau à glace avec 0,6% de gélose fondue de hotte de culture cellulaire pour les étapes ultérieures.
- Mélanger 0,6% d'agar et de la suspension cellulaire dans un rapport de 1: 1, la préparation d'un volume total de 12 ml par plaque à 6 puits. 1,5 ml seront nécessaires pour bien mais en plus doivent être faites comme ci-dessus.
- Pipette 6 ml de suspension cellulaire dans le tube conique de 50 ml.
- Ensuite, ajouter 6 ml d'agar à 0,6% dans le tube.
REMARQUE: La température de ce mélange doit êtremaintenu autour de 42 ° C pour éviter un durcissement prématuré et à maximiser la survie des cellules. - En travaillant rapidement, pipette ce mélange 2-3x à distribuer des cellules, puis dessinez une hausse de 5,5 ml de mélange dans une pipette de 5 ml sérologique.
- Autoriser les bulles d'air de remonter en haut de la colonne de la pipette avant de déposer 1,5 ml de ce mélange dans chaque puits. Faites preuve de prudence pour éviter le dépôt de toutes les bulles d'air dans les puits de la plaque.
- Laisser le mélange de cellules / gélose se solidifier à la température ambiante, dans une culture de cellules d'aération, pendant 30 minutes avant de les placer dans un 37 ° C culture cellulaire incubateur humidifié.
- Le temps nécessaire à la formation de colonies adéquate varie pour chaque lignée cellulaire, typiquement environ 21 jours.
- Une couche de milieu de croissance doit être maintenue au-dessus de la couche supérieure de gélose pour éviter la dessiccation. 100 pi de milieu ajoutée deux fois par semaine est suffisant à cet effet.
4. la coloration des plaques et comptage des colonies
- cellules de tache en ajoutant 200 _6, l d'une solution de chlorure de nitrobleu de tétrazolium par puits et en incubant les plaques pendant une nuit à 37 ° C.
- Une fois que les colonies sont colorées, prendre des photographies des puits à l'aide d'un imageur et compter les colonies en utilisant un logiciel d'analyse d'images.
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Representative Results
L'expression de Wnt7a et Fzd9 dans CMT167 cellules est efficace dans la suppression des tumeurs, comme illustré par notre essai de formation de colonies sur gélose molle. Préalablement, nous avons utilisé Q-PCR pour montrer que WNT7A et Fzd9 ARNm sont exprimés dans de faibles niveaux dans CMT167 cellules. CMT167 cellules ont montré de faibles niveaux de Wnt7a endogène et Fzd9 par rapport aux cellules MLE-12, une lignée de cellules épithéliales pulmonaires murines transformées par SV40 (figure 1). Nous avons ensuite transfecté CMT167 cellules avec deux vecteurs rétroviraux exprimant la surexpression de constructions humaines de WNT7A (LNCX-WNT7A) et Fzd9 (LPCX-Fzd9) pour créer une lignée cellulaire stable qui exprime à la fois WNT7A et Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Nous avons confirmé l'expression de WNT7A et Fzd9 par Q-PCR dans cette lignée cellulaire (Figure 2). Comme notre travail précédent a montré, PPAR est un effecteur en aval de la signalisation WNT7A / Fzd9. Voies de signalisation Wnt sont diverses. Par conséquent, l'expression correcte et l'activation d'un Wnt particulier et son récepteur FZD doivent être des ânessed l'aide d'un effecteur en aval qui est connu pour être activés par la paire Wnt / FZD d'intérêt. Pour Wnt7a et Fzd9, PPARy a été choisi pour cette raison. Nous avons transfecté des cellules surexprimant CMT167 vecteurs vides (LNCX / LPCX) ou Wnt7a / Fzd9 avec une construction de rapporteur de luciférase contenant un élément de réponse de PPAR. Nous avons montré que notre lignée cellulaire / Fzd9 CMT167 LL WNT7A avait presque augmentation de l'activité PPAR-RE six fois (Figure 3). Enfin, comme mentionné précédemment, afin de confirmer l'activité de suppresseur de tumeur de Wnt7a Fzd9 et in vitro, nous avons effectué un essai de formation de colonies sur gélose molle. CMT167 vecteur exprimant Wnt7a et / Fzd9 exprimant des lignées cellulaires stables ont été étalées sur des plaques de gélose molle et on les laisse former des colonies pendant deux à trois semaines. Cellules CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 beaucoup moins colonies formées par rapport à des cellules transfectées par des vecteurs, illustrant la fonction de suppresseur de tumeur et de Wnt7a Fzd9 (figure 4). Les photos ont été prises de toutes les plaques, et colonies ont été comptées en utilisant un logiciel d'imagerie et d'imagerie.
Figure 1: niveaux de WNT7A et Fzd9 ARNm dans les cellules CMT167 Diminution par rapport à MLE-12 cellules analyse Q-PCR a été effectuée pour déterminer les niveaux d'ARNm de Wnt7a et Fzd9 normalisées de GAPDH.. Les niveaux dans CME167 cellules de carcinome de poumon de souris ont été comparés à ceux de MLE-12 des cellules épithéliales pulmonaires murines transformées par SV40, qui ont été normalisées à 1,0. CMT167 cellules ont montré des niveaux inférieurs de Wnt7a (A) et Fzd9 (B) par rapport à l'ARNm de MLE-12 des cellules.
Figure 2:. La surexpression de Wnt7a / Fzd9 dans CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 lignée cellulaire stable WNT7A / Fzd9 surexpression stable des constructions humaines ont été effectuées en utilisant un LN CX vecteur rétroviral. Q-PCR a été réalisée pour WNT7A et Fzd9, et les niveaux d'ARNm ont été normalisées à GAPDH dans les cellules transfectées vide-vecteur et dans les cellules surexprimant WNT7A / Fzd9. Cellules CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 exprimé des niveaux élevés de Wnt7a (A) et Fzd9 (B) de l'ARNm.
Figure 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 surexprimant stable présente une ligne de cellules a augmenté l'activité du promoteur de PPAR-RE des cellules surexprimant stables CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 ou un vecteur vide CMT167 LNCX / LPCX ont été transfectées avec un élément promoteur plasmide de luciférase de réponse de PPAR en utilisant le réactif Lipofectamine.. L'activité du promoteur a été quantifiée par rapport aux cellules transfectées par un vecteur, où l'activité du promoteur a été normalisée à 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 cellules surexprimant stables a montré une augmentation d'environ six fois de l'activité de promoteur PPAR.
Figure 4:. Gélose molle formation de colonies de dosage de CMT167 LNCX / LPCX cellules de vecteurs exprimant et CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 surexprimant les cellules vecteur exprimant CMT167 LNCX / LPCX cellules et CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 surexprimant les cellules ont été étalées dans une formation de colonies sur gélose molle analyse par protocole décrit ci-dessus. CMT167 Wnt7a LL / Fzd9 cellules a montré une diminution marquée de la formation de colonies. Puits représentatifs montrant colonies pour chaque lignée cellulaire. Photo de puits sont représentatifs de trois expériences indépendantes.
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Discussion
En confirmation in vitro de la fonction de suppresseur de tumeur de protéines de signalisation est difficile. L'un des tests les plus rigoureux disponibles pour enquêter sur cette propriété est le dosage de formation de colonies sur gélose molle. Ici, nous avons représenté le dosage de formation de colonies sur gélose molle en utilisant une lignée cellulaire de carcinome du poumon de souris surexprimant de manière stable et Wnt7a Fzd9 par rapport à sa lignée cellulaire parentale CMT167.
Il ya plusieurs points importants à considérer en ce qui concerne le dosage de l'agar mou. L'étape la plus critique de ce test est placage de la cellules. Les comptages cellulaires doivent être exactes, et la solution de gélose ne doit pas être trop chaud. Si aucun colonies sont formées, les cellules peuvent avoir été endommagés en raison de stress thermique. Dans ce cas, le test doit être répété, en prenant des précautions pour maintenir la température au plus près de la gélose à 42 ° C que possible. En variante, un plus grand nombre de cellules peut être plaqué.
Il ya quelques limitations à l'essai de l'agar mou.Une telle limitation est que cela prend deux à trois semaines pour la réalisation. Une autre est qu'il ne permet pas la récupération de la cellule lors de l'achèvement. Modifications de cette technique utilisent des solutions de gélose spécialisés pour permettre aux cellules de récolter de l'ADN ou de protéines à dosage fin. D'autres méthodes utilisent également colorant fluorimétrique pour permettre des analyses à haut débit. Néanmoins, le dosage souple traditionnel de formation de colonies agar reste que l'un des tests les plus sévères pour la confirmation de la croissance cellulaire indépendante de l'ancrage.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
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- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
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