Introduction
Assay יצירת מושבות אגר הרך הוא טכניקה המשמשת באופן נרחב על מנת להעריך שינוי סלולארי במבחנה. מבחינה הסטורית, assay אחר, assay clonogenic, שתואר על ידי אל פאק et. בשנת 1956 היה בשימוש כדי להעריך את יכולתם של תאים ליצור מושבות 1. בטכניקה זו, תאים היו מפוזרים על פני צלחת תרבות וגדלו בנוכחותם של תאים 'מזין' או בינוני מותנים לספק גורמי גדילה הכרחיים. המגבלה של שיטה זו הייתה שזה רק סיפק מידע בנוגע להקמת מושבה. תאים נורמלים מנועים מצמיחת מעגן-עצמאי, בשל סוג מסוים של מוות אפופטוטי, נקרא anoikis 2. עם זאת, יש לי תאים הפכו את היכולת גדלה ומתחלק ללא כריכה למצע. כדי לנצל את המושג הזה, חוקרים פיתחו assay יצירת מושבות אגר הרך. Assay יצירת מושבות אגר הרך מאז השתנה, בשנים האחרונות יותר, כדי לטפל בspצרכי ecific. וריאציה אחת כרוכה שילוב של צבע fluorometric כדי לאפשר ספירת מושבה תפוקה גבוהה. וריאציה נוספת כרוכה בשימוש בפתרון אגר מיוחד כדי לאפשר שליפה של תאי קיימא לאחר הקמת מושבה, כאשר יש צורך בדגימות חלבון או DNA.
ב assay אגר הרך המסורתי הקמת מושבה, תאים גדלים בשכבה אגר רך מעורבב עם מדיום תרבות תא הנשען על שכבה נוספת של אגר רך, גם מעורבב עם מדיום תרבות תא, אך המכילים ריכוז גבוה יותר של אגר. זה מונע מתאים מהקפדה על צלחת התרבות, עדיין מאפשר להפוך תאים ליצור מושבות גלויות. הרציונל מאחורי שיטה זו הוא שתאים נורמלים תלויים בתא למגע מטריצת חוץ-תאי כדי להיות מסוגל לגדול ולהתחלק. לעומת זאת, תאים הפכו את היכולת לגדול ולחלק בלי קשר לסביבתם. לכן, תאים מסוגלים ליצור מושבות באופן מעגן-עצמאי היו גonsidered להשתנות ומסרטן. המטרה הכללית של שיטה זו היא למדוד את היכולת הזו בתאים באופן חצי כמותית ומחמירה.
מסלול איתות Wnt הוא קריטי בהתפתחות עוברת ולעתים קרובות דה-מוסדר ביצירת הגידולים 3-6. יש מגוון רחב של מסלולים הקשורים לאיתות של Wnt. המסלול הקנונית כרוך איתות ורגולציה של שעתוק הגנים במורד הזרם Wnt דרך השפעתו על בטא-קטנין coactivator תעתיק. Wnts גם אות דרך כמה מסלולים הלא קנוניה, למשל, מסלול מישורי קוטביות תא, המסדיר גורמים מעורבים במבנה cytoskeletal 7, ומסלול ה- Wnt-סידן, המסדיר שחרור סידן מreticulum endoplasmic 8. הליגנדים Wnt להפעיל את פעילותם דרך קשירת הקולטנים מסולסלים. למרות שמספר Wnts הוכח להיות שהוגברה בסרטן הריאות, Wnt7a הוכח להיות למטה מוסדר שבאינו smalסרטן הריאות של תאי l דרך אמרגן מתילציה 9. Wnt7a נקשר Fzd9 ופועל כמדכא סרטן דרך מסלול הלא קנוניות. שיקום של Wnt-7 א וFzd-9 מעכב את הצמיחה של תאי סרטן הריאות של תאים הלא-קטנים 10. ההשפעות של Wnt7a / Fzd9 מתווכות באמצעות ההפעלה של ERK-5, אשר בתורו, מפעיל γ קולט מופעל proliferator peroxisome (PPARγ) 11,12. כאן, אנו מראים כי ביטוי יתר של Wnt7a וFzd9 תוצאות בדיכוי צמיחת מעגן-עצמאי של שורת תאי סרטן הריאות עכברית. תאי CMT167 עכבריים נגזרו מסרטן ריאות בC57BL / עכברי lcrf 13 והיו transfected ביציבות עם Wnt7A וFzd9. ביטוי יתר של Wnt7A וFzd9 אושרו על ידי כמותיים-PCR (Q-PCR) ואת הפונקציונליות של ביטוי יתר Wnt7A וFzd9 אושר באמצעות הפעלת זרם של PPARγ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומרים וריאגנטים
- תווית היטב בכל תרבית רקמה שטופלה צלחת 6-היטב כראוי עבור כל שורת תאים או מצב הנחקר.
- להכין מדיום תרבות תא 2x ידי המסת 1 גרם של אבקה ובינונית 0.2 גרם של סודה לשתייה במי דה המיונן לנפח סופי של 50 מיליליטר.
- עובר מדיום זה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לעקר.
- הוספת רכיבים נוספים שנדרשו לתרבות הנורמלית של הקו הסלולרי של עניין. לדוגמא, לגדול קו 167 תא CMT ב1640 בינוני RPMI השלים עם FBS 10% לבין 1% פניצילין / סטרפטומיצין פתרון. מדיום חם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים לפני השימוש.
- להכין מדיום תרבית תאי 1x בנפרד כפי שהיית לתרבות תא נורמלית של הקו הסלולרי של עניין.
- הכן 1% אגר אציל על ידי הוספת 1 גרם של אגר לאצילי 100 מיליליטר של מים ללא יונים.
הערה: אגר נובל לא להתמוסס לחלוטין עם תסיסה לבד. - הכן0.6% אציליים אגר על ידי הוספת 0.6 גרם של אצילי אגר למי דה מיונן 100 מיליליטר. שני פתרונות אגר יכולים להתבצע ב100 בקבוקי זכוכית מיליליטר עם מכסי closable לאחסון לטווח ארוך.
- החיטוי התערובות אגר אציליות לעקר. תערובות אלה יכולות להתבצע מראש ולאחסן 4 ° C, אבל צריך להיות מחוממת שוב בזמן הניסוי עד אגר נמס לגמרי.
- הכן פתרון כלוריד tetrazolium nitroblue על ידי הפיכת 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות ב1x PBS (8 גרמו NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 g Na 2 4 HPO, ו0.24 g KH 2 PO 4 בH 2 O לנפח של 1,000 מיליליטר ). זה ישמש בסופו של הניסוי להכתים את המושבות.
2. ציפוי של שכבה התחתונה של אגר
- שחרר את המכסה שעל הבקבוק של 1% אגר ומיקרוגל אציליים כ 1-2 דקות. בחימום במיקרוגל, לפקח על הפתרון בשיתוף פעולה הדוק כדי למנוע רותח מעל. המשך חימום, תוך ערבוב מדי פעם,עד אגר נמס לחלוטין הפתרון הוא ברור.
הערה: השתמש בכפפות עמידה בחום לטפל בקבוק לאחר חימום. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לכוויות או לפציעה חמורה. - הנח פתרון נמס אגר ובינוני תרבות 2x מחוממת מראש בדלי קרח מלא במים חמים ברז (42 מעלות צלזיוס). גם למקם את צינור חרוטי 50 מיליליטר בבעל צינור בדלי הקרח עם מים חמים. העבר את הדלי למכסת מנוע תרבית תאים על הצעדים הבאים.
- לשכבה התחתונה של אגר, תצטרך 1.5 מיליליטר של תערובת של אגר ובינוני לכל טוב של צלחת 6-היטב.
- כדי להבטיח כמות מספקת של התערובת, להכין כולל של 12 מיליליטר לכל צלחת 6-היטב.
- התחל על ידי הוספת 6 מיליליטר של מדיום תרבות צינור חרוטי 50 מיליליטר ולאחר מכן 6 מיליליטר של הפתרון אגר אצילי 1%.
- להפוך את צינור חרוטי כמה פעמים כדי לערבב. עבודה בקצב מהיר תמנע את התקשות מוקדמת של אגר הרך.
- צייר את כ 5.5 מיליליטר של תערובת לתוך pi סרולוגיות 5 מיליליטרpette.
- לאפשר בועות האוויר לעלות לחלק העליון של עמודת פיפטה לפני הפקדת 1.5 מיליליטר של תערובת זו לתוך כל טוב. השתמש בזהירות כדי להימנע מתצהיר של כל בועות אוויר לתוך בארות הצלחת.
- מכסה את הצלחות ולאפשר תערובת אגר לבסס בטמפרטורת חדר, במכסת מנוע תרבית תאים, למשך 30 דקות.
3. ציפוי השכבה העליונה של תאים המכילים אגר
- ברגע שהשכבה התחתונה של אגר יש הקרושה, להתחיל בהכנה של השכבה העליונה.
- ראשית, תאי קציר על ידי trypsinization ולדלל אותם 1: 5 במדיום התרבות (לדוגמא עבור 1 מיליליטר של טריפסין, להוסיף 4 מיליליטר של מדיום) לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר.
- ספירת תאים ולחשב את מספר התאים הדרושים לכל טוב להכין השעיה תא סופית בשלב זה. מספר זה עשוי להשתנות בהתאם לסוג תא. השתמש 5,000 תאים / היטב כנקודת התחלה ולהתאים לפי צורך. מספר תא זה, היית להכין השעיה תא של 6667 תאים / מיליליטר (כלומר כל well יקבל 0.75 מיליליטר של השעיה זו ו0.75 מיליליטר של אגר להיקף כולל של 1.5 מיליליטר; הריכוז של תאים יהיה גם בדילול 1: 2 לספירה סופית כוללת תא של 5,000).
- הנפח של ההשעיה תא הדרושה לכל טוב של צלחת 6-היטב שוב יהיה 1.5 מיליליטר. הכן השעיה תא נוספת בהיקף של 12 מיליליטר לכל צלחת 6-היטב.
- ממסים 0.6% פתרון אגר במיקרוגל כאמור לעיל ואת המקום לתוך דלי קרח המכיל מים חמים יחד עם צינור 50 מיליליטר חרוטי בבעל צינור והשעית התא הסופי משלב 3.3.
- העבר את דלי הקרח עם אגר 0.6% מומסים למכסת מנוע תרבית תאים על הצעדים הבאים.
- לערבב אגר 0.6% והשעית תא 1: 1, הכנה בנפח כולל של 12 מיליליטר לכל צלחת 6-היטב. 1.5 מיליליטר יידרש לכל טוב, אבל נוסף צריכים להיעשות כאמור לעיל.
- פיפטה 6 מיליליטר של השעיה תא לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
- לאחר מכן, להוסיף 6 מיליליטר של אגר 0.6% לצינור.
הערה: הטמפרטורה של תערובת זו צריכה להיותהמשיך סביב 42 מעלות צלזיוס, כדי למנוע התקשות מוקדמת ועל מנת למקסם את הישרדות תא. - העבודה במהירות, פיפטה תערובת זו 2-3x להפיץ תאים, ולאחר מכן לצייר את 5.5 מיליליטר של תערובת לתוך פיפטה סרולוגית 5 מיליליטר.
- לאפשר לכל בועות אוויר לעלות לחלק העליון של עמודת פיפטה לפני הפקדת 1.5 מיליליטר של תערובת זו לתוך כל טוב. השתמש בזהירות כדי להימנע מתצהיר של כל בועות אוויר לתוך בארות הצלחת.
- לאפשר תערובת תא / אגר לבסס בטמפרטורת חדר, במכסת מנוע תרבית תאים, למשך 30 דקות לפני הנחת לתוך תרבית תאי חממת humidified 37 ° C.
- הזמן הנדרש להקמת מושבה נאותה משתנה עבור כל קו תא, בדרך כלל סביב 21 ימים.
- שכבה של מדיום גידול יש לשמור על השכבה העליונה של אגר כדי למנוע התייבשות. של מדיום הוסיף פעמיים בשבוע 100 μl מספיק למטרה זו.
4. מושבות מכתימות את צלחות וספירה
- תאי כתם על ידי הוספת 200 _6; l של פתרון כלוריד tetrazolium nitroblue לכל טוב ודוגרי צלחות לילה בשעה 37 ° C.
- ברגע שמושבות מוכתמות, לצלם בארות באמצעות תרמי ולספור מושבות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הביטוי של Wnt7A וFzd9 בCMT167 תאים יעיל בדיכוי גידול כפי שמודגם על ידי assay אגר הרך שלנו הקמת מושבה. באופן ראשוני, היינו Q-PCR כדי להראות שWnt7A וFzd9 mRNA באים לידי ביטוי ברמות נמוכות בCMT167 תאים. תאי CMT167 הראו רמות נמוכות של Wnt7A אנדוגני וFzd9 בהשוואה לMLE-12 תאים, תא קו-שינה SV40 עכברי אפיתל הריאה (איור 1). לאחר מכן, אנו transfected CMT167 תאים עם שני וקטורי ביטוי יתר retroviral להביע מבנים אנושיים של Wnt7A (LNCX-Wnt7A) וFzd9 (LPCX-Fzd9) כדי ליצור שורת תאים יציבה שמבטאת שני Wnt7A וFzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). אנו מאשרים ביטוי של Wnt7A וFzd9 על ידי Q-PCR בשורות התאים (איור 2). ככל שהעבודה הקודמת שלנו הראתה, PPARγ הוא מפעיל במורד הזרם של איתות Wnt7A / Fzd9. מסלולי איתות Wnt הם מגוונים. לכן, ביטוי והפעלה נכונים של Wnt מסוים וקולט Fzd צריך להיות חמורsed באמצעות מפעיל במורד הזרם, כי ידועה שיופעל על ידי הצמד של עניין Wnt / Fzd. לWnt7A וFzd9, PPARγ נבחר מסיבה זו. אנו transfected CMT167 תאים ביתר וקטורים ריקים (LNCX / LPCX) או Wnt7A / Fzd9 עם כתב לבנות בלוציפראז מכיל אלמנט תגובת PPARγ. הראינו כי היה קו התא / Fzd9 CMT167 LL Wnt7A כמעט פעילות פי שישה PPAR-רי המוגבר (איור 3). לבסוף, כאמור, על מנת לאשר את הפעילות מדכאת גידול של Wnt7A וFzd9 במבחנה, ביצענו assay יצירת מושבות אגר רך. וקטור CMT167 להביע וWnt7A / Fzd9 להביע שורות תאי יציבות היו מצופות על גבי צלחות אגר רכות ואפשרו ליצור מושבות לשבועות עד שלושה שבועות. תאי CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 נוצרו באופן משמעותי פחות מושבות בהשוואה לתאים-transfected וקטור, הממחיש את התפקיד מדכא גידול של Wnt7A וFzd9 (איור 4). תמונות צולמו מכל הצלחות, וColonieשל נספרו באמצעות תוכנת תרמי והדמיה.
איור 1: ירידה ברמות של Wnt7A וFzd9 mRNA בתאי CMT167 לעומת MLE-12 תאי ניתוח Q-PCR בוצע על מנת לקבוע את רמות ה- mRNA של Wnt7a וFzd9 מנורמלות GAPDH.. רמות בתאי סרטן ריאות עכבריות CME167 הושוו לאלה בMLE-12 תאי אפיתל ריאה עכברית-שינה SV40, שהיו מנורמל 1.0. תאי CMT167 הראו רמות נמוכות יותר של Wnt7a () וFzd9 mRNA (ב ') בהשוואה לMLE-12 תאים.
איור 2:. ביטוי יתר של Wnt7a / Fzd9 בCMT167 LL Wnt7a / Fzd9 שורת תאים יציב Wnt7A / מבנים אנושיים ביטוי יתר היציב Fzd9 נעשו באמצעות LN וקטור retroviral CX. Q-PCR בוצע עבור Wnt7A וFzd9, ורמות ה- mRNA היו מנורמלות GAPDH בתאי transfected ריק וקטור ובתאים ביתר Wnt7A / Fzd9. תאי CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 הביעו רמות גבוהות של Wnt7a () וFzd9 (B) mRNA.
איור 3: מוצגי שורת תאים יציבים ביתר CMT167 Wnt7a / Fzd9 פעילות מוגברת אמרגן PPAR-רי התאים ביתר יציבים CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 או וקטור ריק CMT167 LNCX / LPCX היו transfected עם פלסמיד בלוציפראז אמרגן אלמנט תגובת PPAR באמצעות מגיב Lipofectamine.. פעילות יזם הייתה לכמת בהשוואה לתאים-transfected וקטור, שבו פעילות אמרגן הייתה מנורמלת 1.0. CMT167 LL Wnt7a / תאים ביתר יציבים Fzd9 הראו עלייה של כ פי שש בפעילות אמרגן PPAR.
איור 4:. Assay גיבוש אגר מושבה רכה של CMT167 LNCX / להביע תאי וקטור LPCX וCMT167 LL Wnt7a / Fzd9 ביתר תאי CMT167 LNCX / להביע תאי וקטור LPCX וCMT167 LL Wnt7A / Fzd9 ביתר תאים היו מצופים ביצירת מושבות אגר רכה assay לכל פרוטוקול שתואר לעיל. CMT167 LL Wnt7A / תאי Fzd9 הראו ירידה משמעותית בהקמת מושבה. בארות נציג מראים מושבות לכל שורת תא. תמונה של בארות הן נציג של שלושה ניסויים בלתי תלויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באישור מבחנה של פונקציה מדכאת גידול של חלבוני איתות קשה. אחד מהמבחנים הקפדניים ביותר העומדים לרשות לחקור נכס זה הוא assay יצירת מושבות אגר הרך. הנה, יש לנו מאויר assay היווצרות מושבה הרך אגר באמצעות שורת תאי סרטן הריאות עכברית ביציבות ביתר Wnt7a וFzd9 בהשוואה לשורת תאי CMT167 ההורים שלה.
ישנן מספר נקודות חשובות שיש לשקול בעניין assay אגר הרך. השלב הקריטי ביותר בassay זה ציפוי של התאים. ספירת תאים חייבת להיות מדויקת, והפתרון אגר לא חייב להיות חם מדי. אם לא מושבות נוצרות, גוף האדם התאים שניזוקו עקב חום לחץ. במצב זה, assay יש לחזור, נקיטת אמצעי זהירות כדי לשמור על טמפרטורה אגר קרובה ל -42 מעלות צלזיוס ככל האפשר. לחלופין, מספר גדול יותר של תאים יכול להיות מצופה.
יש כמה מגבלות לassay אגר הרך.מגבלה אחת כזו היא שזה לוקח שבועות עד שלושה שבועות להשלמה. נוסף הוא שהוא אינו מאפשר לתא אחזור עם השלמתו. שינויים בטכניקה זו משתמשים בפתרונות אגר מיוחדים כדי לאפשר לתאים להיות שנקטפו לדנ"א או חלבונים עם השלמת assay. שיטות אלטרנטיביות גם לנצל צבע fluorometric כדי לאפשר למבחני תפוקה גבוהים. אף על פי כן, assay אגר הרך המסורתי הקמת מושבה נשאר כאחד מהמבחנים הקפדניים ביותר לאישור של צמיחת תאי מעגן-עצמאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H.
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
