Introduction
El ensayo de formación de colonias en agar blando es una técnica ampliamente utilizada para evaluar la transformación celular in vitro. Históricamente, se utilizó otro ensayo, el ensayo clonogénico, descrito por Puck et al. En 1956 para evaluar la capacidad de las células para formar colonias 1. En esta técnica, las células se dispersaron en una placa de cultivo y se cultivaron en la presencia de células alimentadoras '' o medio acondicionado para proporcionar factores de crecimiento necesarios. La limitación de esta técnica es que sólo se proporciona información con respecto a la formación de colonias. Las células normales se impide el crecimiento independiente de anclaje, debido a un tipo particular de muerte apoptótica, denominado anoikis 2. Sin embargo, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse sin unirse a un sustrato. Para sacar provecho de este concepto, los investigadores desarrollaron el ensayo de formación de colonias en agar blando. El ensayo de formación de colonias en agar blando desde entonces ha sido modificada, en años más recientes, para abordar specific necesidades. Una variación consiste en la incorporación de colorante fluorométrico para permitir de alto rendimiento recuento de colonias. Otra variación implica el uso de solución especializada agar para permitir la recuperación de células viables después de la formación de colonias cuando se necesitan muestras de proteínas o de ADN.
En el ensayo de formación de colonias en agar blando tradicional, las células se cultivan en una capa de agar blando mezclado con medio de cultivo celular que descansa sobre otra capa de agar blando, también mezclado con medio de cultivo celular, pero que contiene una mayor concentración de agar. Esto evita que las células se adhieran a la placa de cultivo, sin embargo, permite que las células transformadas para formar colonias visibles. El fundamento de esta técnica es que las células normales dependen de contacto célula a la matriz extracelular para ser capaz de crecer y dividirse. Por el contrario, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse independientemente de su entorno. Por lo tanto, las células capaces de formar colonias de una manera independiente de anclaje fueron considered a transformar y cancerígeno. El objetivo general de este método es medir esta capacidad en las células de una manera semi-cuantitativa y rigurosa.
La vía de señalización Wnt es esencial en la embriogénesis y, a menudo reguladas des en la tumorigénesis 3-6. Hay múltiples vías asociadas con la señalización de Wnt. La vía canónica implica la señalización y la regulación de la transcripción de genes Wnt aguas abajo a través de sus efectos sobre el coactivador transcripcional de beta-catenina. Wnts también la señal a través de varias vías no canónicos, por ejemplo, la vía de la polaridad celular planar, que regula los elementos involucrados en la estructura del citoesqueleto 7, y de la vía Wnt-calcio, que regula la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico 8. Ligandos Wnt ejercen su actividad a través de unirse a receptores Frizzled. Aunque varios Wnt han demostrado ser upregulated en el cáncer de pulmón, Wnt7a ha demostrado ser regulada en el no-Smalcáncer de pulmón l de células a través de la metilación del promotor 9. Wnt7a une Fzd9 y actúa como un supresor de tumor a través de una vía no canónica. Restauración de Wnt-7a y Fzd-9 inhibe el crecimiento de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células 10. Los efectos de la Wnt7a / Fzd9 están mediadas a través de la activación de ERK-5, que a su vez, activa los receptores γ proliferador de peroxisoma activados (PPAR) 11,12. Aquí, mostramos que la sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 se traduce en la supresión del crecimiento independiente de anclaje de una línea celular de carcinoma de pulmón murino. CMT167 células murinas se derivaron de un carcinoma de pulmón en ratones C57BL / LCRF 13 y fueron transfectadas establemente con Wnt7a y Fzd9. La sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 fueron confirmados por PCR cuantitativa (Q-PCR) y la funcionalidad de Wnt7a y Fzd9 sobreexpresión fue confirmada a través de la activación de aguas abajo de PPAR.
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Protocol
1. Preparación de Materiales y Reactivos
- Etiquetar cada pocillo de un cultivo de tejido tratado placa de 6 pocillos adecuada para cada línea celular o condición objeto de la investigación.
- Preparar medio de cultivo celular 2x disolviendo 1 g de medio en polvo y 0,2 g de bicarbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml.
- Pasar este medio a través de un filtro de 0,2 micras para esterilizar.
- Añadir componentes adicionales necesarios para el cultivo normal de la línea celular de interés. Por ejemplo, crecer CMT línea 167 de células en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina solución. Medio caliente a 37 ° C en baño de agua caliente antes de su uso.
- Preparar medio de cultivo celular 1x por separado como si se tratara de la cultura normal de las células de la línea celular de interés.
- Preparar 1% de agar noble mediante la adición de 1 g de agar noble a 100 ml de agua desionizada.
NOTA: agar Noble no se disolverá por completo con agitación por sí sola. - Preparar0,6% de agar noble mediante la adición de 0,6 g de agar noble a 100 ml de agua desionizada. Ambas soluciones de agar se pueden hacer en botellas de 100 ml de vidrio con tapas de cierre, para su almacenamiento a largo plazo.
- Autoclave las mezclas de agar nobles para esterilizar. Estas mezclas se pueden hacer de antemano y se almacenan a 4 ° C, pero deben ser calentados de nuevo en el momento del experimento hasta el agar se haya disuelto completamente.
- Preparar una solución de cloruro de tetrazolio nitroazul haciendo una solución madre de 1 mg / ml en 1X PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, y 0,24 g KH 2 PO 4 en H 2 O hasta un volumen final de 1000 ml ). Esto se utiliza al final del experimento para teñir las colonias.
2. Revestimiento del de la capa inferior de Agar
- Afloje el tapón de la botella de 1% de agar noble y microondas durante unos 1-2 minutos. Mientras que el calentamiento en un microondas, un seguimiento de la solución cuidadosamente para evitar desborde. Continuar calentando, mientras se mezcla de forma intermitente,agar hasta que se haya disuelto completamente y la solución es clara.
NOTA: Utilice guantes resistentes al calor para manejar frasco después del calentamiento. Si no lo hace puede provocar quemaduras o lesiones graves. - Coloque solución de agar fundido y medio de cultivo 2x pre-calentado en un cubo de hielo llena de agua caliente de la llave (42 ° C). También colocar un tubo cónico de 50 ml en un soporte de tubo en el cubo de hielo con agua caliente. Traslado cubo para campana de cultivo de células para las etapas subsiguientes.
- Para la capa inferior de agar, necesitará 1,5 ml de una mezcla de agar y medio por pocillo de una placa de 6 pocillos.
- Para asegurar una cantidad adecuada de la mezcla, preparar un total de 12 ml para cada placa de 6 pocillos.
- Iniciar mediante la adición de 6 ml de medio de cultivo al tubo cónico de 50 ml y luego 6 ml de la solución de agar noble 1%.
- Invierta el tubo cónico varias veces para mezclar. Trabajando a un ritmo acelerado impedirá el endurecimiento prematuro del agar blando.
- Elaborar aproximadamente 5,5 ml de la mezcla en un 5 ml pi serológicapette.
- Permitir que las burbujas de aire a la altura de la parte superior de la columna de pipeta antes de depositar 1,5 ml de esta mezcla en cada pocillo. Tenga cuidado para evitar la deposición de las burbujas de aire en los pocillos de la placa.
- Cubrir las placas de agar y permitir que la mezcla se solidifique a temperatura ambiente, en campana de cultivo celular, durante 30 min.
3. Chapado de la capa superior de células que contienen Agar
- Una vez que la capa inferior de agar se ha solidificado, comenzar la preparación de la capa superior.
- Primero, las células de la cosecha mediante tripsinización y se les diluyen 1: 5 en medio de cultivo (por ejemplo, para 1 ml de tripsina, añadir 4 ml de medio) en un tubo cónico de 15 ml.
- Contar las células y calcular el número de células por pocillo necesarios para preparar una suspensión celular final en este momento. Este número variará dependiendo del tipo de célula. Utilice 5.000 células / así como un punto de partida y ajustar según sea necesario. Para este número de células, que le prepare una suspensión celular de 6.667 células / ml (es decir, cada well recibirá 0,75 ml de esta suspensión y 0,75 ml de agar para un volumen total de 1,5 ml; la concentración de células también se diluyó 1: 2 para un recuento final de células total de 5000).
- El volumen de la suspensión celular necesaria por pocillo de una placa de 6 pocillos será de nuevo 1,5 ml. Preparar suspensión celular adicional por un total de 12 ml por placa de 6 pocillos.
- Derretir solución de agar 0,6% en un horno de microondas como anteriormente y colocar en el cubo de hielo que contiene agua caliente junto con un tubo cónico de 50 ml en un soporte de tubo y la suspensión celular final de la Etapa 3.3.
- Transferir el cubo de hielo derretido con 0,6% de agar para campana de cultivo de células para las etapas subsiguientes.
- Mezclar 0,6% de agar y la suspensión celular en una relación 1: 1, la preparación de un volumen total de 12 ml por placa de 6 pocillos. Se requerirá 1,5 ml por pocillo, pero adicional deben hacerse como anteriormente.
- Pipetear 6 ml de la suspensión celular en el tubo cónico de 50 ml.
- A continuación, añadir 6 ml de agar al 0,6% al tubo.
NOTA: La temperatura de esta mezcla debe sermantenido en torno a los 42 ° C para evitar el endurecimiento prematuro y para maximizar la supervivencia celular. - Trabajando rápidamente, pipeta esta mezcla 2-3x para distribuir las células, a continuación, dibuje un 5,5 ml de la mezcla en un 5 ml pipeta serológica.
- Permita que las burbujas de aire suban a la parte superior de la columna de la pipeta antes de depositar 1,5 ml de esta mezcla en cada pocillo. Tenga cuidado para evitar la deposición de las burbujas de aire en los pocillos de la placa.
- Deje que la mezcla de células / agar para solidificar a temperatura ambiente, en campana de cultivo celular, durante 30 min antes de colocar en un 37 ° C humidificado incubadora de cultivo celular.
- El tiempo requerido para la formación de colonias adecuada varía para cada línea celular, típicamente alrededor de 21 días.
- Una capa de medio de crecimiento debe mantenerse sobre la capa superior de agar para evitar la desecación. 100 l de medio añadido dos veces por semana es suficiente para este propósito.
4. tinción de las placas y contando Colonias
- Las células de la mancha mediante la adición de 200 _6; l de solución de cloruro de tetrazolio nitroazul por pocillo e incubando las placas durante la noche a 37 ° C.
- Una vez que las colonias se tiñen, tome fotografías de pozos utilizando un generador de imágenes y cuente las colonias utilizando el software de análisis de imágenes.
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Representative Results
La expresión de Wnt7a y Fzd9 en CMT167 células es eficaz en la supresión de tumores, como se ilustra por nuestro ensayo de formación de colonias en agar blando. Preliminarmente, se utilizó Q-PCR para demostrar que Wnt7a y Fzd9 ARNm se expresan en niveles bajos en CMT167 células. CMT167 células mostraron bajos niveles de endógeno Wnt7a y Fzd9 cuando se compara con MLE-12 células, un murino línea de células epiteliales de pulmón transformada con SV40 (Figura 1). A continuación, las células transfectadas CMT167 con dos vectores retrovirales que expresan constructos de sobreexpresión humanos de Wnt7a (LNCX-Wnt7a) y Fzd9 (LPCX-Fzd9) para crear una línea celular estable que expresa tanto Wnt7a y Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Se confirmó la expresión de Wnt7a y Fzd9 por Q-PCR en esta línea celular (Figura 2). A medida que nuestro trabajo previo ha demostrado, PPAR es un efector corriente abajo de la señalización Wnt7a / Fzd9. Vías de señalización Wnt son diversas. Por lo tanto, la expresión apropiada y la activación de un Wnt en particular y su receptor Fzd deben ser asnossed utilizando un efector aguas abajo que se sabe que ser activado por el par Wnt / Fzd de interés. Para Wnt7a y Fzd9, PPAR fue elegido por esta razón. Estamos transfectadas CMT167 células que sobreexpresan vectores vacíos (LNCX / LPCX) o Wnt7a / Fzd9 con un constructo reportero de luciferasa que contiene un elemento de respuesta a PPAR. Nos mostró que nuestra línea de células / Fzd9 CMT167 LL Wnt7a tenía casi actividad aumentado PPAR-RE de seis veces (Figura 3). Por último, como se mencionó anteriormente, para confirmar la actividad supresora de tumores de Wnt7a y Fzd9 in vitro, se realizó un ensayo de formación de colonias en agar blando. CMT167 vector que expresa y Wnt7a / Fzd9 expresando líneas celulares estables se cultivaron en placa sobre placas de agar blando y se dejaron formar colonias durante dos a tres semanas. Células CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 formaron significativamente menos colonias en comparación con las células transfectadas con el vector, que ilustra la función supresora de tumores de Wnt7a y Fzd9 (Figura 4). Se tomaron fotos de todos los platos, y colonies se contaron usando un software de imágenes y creación de imágenes.
Figura 1: Los niveles de Wnt7a y Fzd9 ARNm Disminución en las células CMT167 comparación con MLE-12 células se llevó a cabo el análisis de Q-PCR para determinar los niveles de mRNA de Wnt7a y Fzd9 normalizaron a GAPDH.. Los niveles en células de carcinoma de pulmón murino CME167 se compararon con los de MLE-12 de pulmón murino células epiteliales transformadas con SV40, que se normalizaron a 1,0. CMT167 células mostraron niveles más bajos de Wnt7a (A) y Fzd9 (B) mRNA en comparación con MLE-12 células.
Figura 2:. La sobreexpresión de Wnt7a / Fzd9 en CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 línea celular estable Wnt7a / Fzd9 sobreexpresión estable construcciones humanas se hicieron utilizando un LN CX vector retroviral. Q-PCR se realizó durante Wnt7a y Fzd9, y los niveles de mRNA se normalizaron a GAPDH en células transfectadas vacío en vectores y en las células que sobreexpresan Wnt7a / Fzd9. Células CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 expresaron altos niveles de Wnt7a (A) y Fzd9 (B) mRNA.
Figura 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 sobreexpresan línea celular estable exposiciones aumentaron la actividad del promotor de PPAR-RE células que sobreexpresan estables CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 o vector vacío CMT167 LNCX / LPCX fueron transfectadas con un elemento promotor plásmido luciferasa respuesta PPAR usando reactivo Lipofectamine.. La actividad del promotor se cuantificó comparación con las células transfectadas con el vector, en donde la actividad del promotor se normalizó a 1,0. CMT167 LL Wnt7a / células que sobreexpresan estables Fzd9 mostró un aumento de aproximadamente seis veces en la actividad promotora de PPAR.
Figura 4: Ensayo de Formación. Soft Agar Colonia de CMT167 LNCX / LPCX células por vectores que expresan y CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 sobreexpresan las células CMT167 LNCX / LPCX células que expresan vectoriales y CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 sobreexpresan las células se sembraron en una formación de colonias en agar blando ensayo según el protocolo descrito anteriormente. CMT167 LL Wnt7a / células Fzd9 mostró una marcada disminución en la formación de colonias. Pozos representativo que muestra colonias para cada línea celular. Imagen de pozos son representativos de tres experimentos independientes.
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Discussion
En confirmación vitro de la función supresora de tumor de las proteínas de señalización es difícil. Uno de los ensayos más rigurosos disponibles para investigar esta propiedad es el ensayo de formación de colonias en agar blando. Aquí, hemos ilustrado el ensayo de formación de colonias en agar suave utilizando una línea celular de carcinoma de pulmón murino de forma estable y que sobreexpresan Wnt7a Fzd9 comparación con su padres línea celular CMT167.
Hay varios puntos importantes a tener en cuenta en relación con el ensayo de agar blando. El paso más crítico en este ensayo se galvanoplastia de las células. Los recuentos de células deben ser precisos, y la solución de agar no debe ser demasiado caliente. Si no se forman colonias, las células se pueden haber dañado debido al estrés por calor. En esta situación, el ensayo debe repetirse, tomando las precauciones necesarias para mantener la temperatura lo más cerca de agar a 42 ° C como sea posible. Alternativamente, un mayor número de células puede ser plateado.
Hay algunas limitaciones para el ensayo de agar blando.Una de estas limitaciones es que toma dos a tres semanas para su conclusión. Otra es que no permite la recuperación de células sobre la terminación. Las modificaciones de esta técnica emplean soluciones de agar especializados para permitir que las células se pueden cosechar para el ADN o la proteína tras la finalización del ensayo. Los métodos alternativos también utilizan colorante fluorométrico para permitir ensayos de alto rendimiento. Sin embargo, el ensayo de formación de colonias en agar blando tradicional permanece como una de las pruebas más rigurosas para la confirmación del crecimiento celular independiente del anclaje.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
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