Introduction
Den mjukagar-kolonibildningsanalys är en teknik som används i stor utsträckning för att utvärdera celltransformation in vitro. Historiskt var en annan analys, den klonogena analysen, beskriven av Puck et al., I 1956 användes för att utvärdera förmågan hos celler att bilda kolonier 1. I denna teknik cellerna utspridda på en odlingsplatta och odlades i närvaro av "feeder" celler eller konditionerat medium för att ge nödvändiga tillväxtfaktorer. Begränsningen av denna teknik var att det bara lämnade uppgifter om kolonibildning. Normala celler hindras från förankringsoberoende tillväxt, på grund av en viss typ av apoptotisk död, kallad anoikis 2. Emellertid transformerade cellerna har förmåga att växa och dela sig utan att binda till ett substrat. För att dra nytta av detta koncept, forskare utvecklat den mjuka agar kolonibildningsanalys. Den mjuka agar kolonibildningsanalys har sedan ändrats, på senare år, för att ta itu med specific behov. En variant innebär införlivande av fluorometrisk färgämne för att möjliggöra hög genomströmning koloniräkning. En annan variation innefattar användning av specialiserad agarlösning för att möjliggöra hämtning av viabla celler efter kolonibildning när protein- eller DNA-prover behövs.
I den traditionella mjukagar-kolonibildningsanalys, odlas celler i ett skikt av mjuk agar blandades med cellodlingsmedium som vilar på ett annat skikt av mjuk agar, blandades också med cellodlingsmedium, men innehållande en högre koncentration av agar. Detta förhindrar celler från att vidhäfta till odlingsplattan, men ändå tillåter transformerade celler för bildning av synliga kolonier. Den logiska grunden bakom denna teknik är att normala celler är beroende av cell till extracellulär matris kontakt för att kunna växa och dela sig. Omvänt transformerade cellerna har förmåga att växa och dela sig, oberoende av den omgivande miljön. Därför celler som kan bilda kolonier på ett förankringsoberoende sätt var considered att omvandlas och cancerframkallande. Det övergripande målet med denna metod är att mäta denna förmåga i celler i en semi-kvantitativ och stringent sätt.
Wnt signalväg är kritisk i embryogenes och ofta avregleras i tumörbildning 3-6. Det finns flera vägar i samband med Wnt signalering. Den kanoniska vägen involverar Wnt signalering och reglering av nedströms gentranskription genom dess effekter på den transkription samaktivator beta-catenin. Wnts signalerar även via flera icke-kanoniska vägar, till exempel, den plana cellpolaritet reaktionsvägen, vilken reglerar element som ingår i cytoskelettala struktur 7, och det Wnt-kalcium-vägen, som reglerar frisättningen av kalcium från det endoplasmatiska nätverket 8. Wnt ligander utövar sin aktivitet genom att binda Frizzled receptorer. Även om flera Wnts har visat sig vara uppreglerad vid lungcancer har Wnt7a visats nedregleras i icke-small cell lung cancer genom promotor metylering 9. Wnt7a binder Fzd9 och fungerar som en tumörsuppressor genom en icke-kanoniska vägen. Restaurering av Wnt-7a och FZD-9 hämmar tillväxten av icke-småcellig lungcancer celler 10. Effekterna av Wnt7a / Fzd9 medieras genom aktivering av ERK-5, som i sin tur aktiverar peroxisom proliferator-aktiverad receptor-γ (PPARy) 11,12. Här visar vi att överuttryck av Wnt7a och Fzd9 resulterar i suppression av förankringsoberoende tillväxt av en mus lungcancer cellinje. Murina CMT167 celler härstammar från en lungcancer i C57BL / lcrf möss 13 och var stabilt med Wnt7A och Fzd9. Överuttryck av Wnt7A och Fzd9 bekräftades genom kvantitativ-PCR (Q-PCR) och funktionalitet Wnt7A och Fzd9 uttryck bekräftades genom nedströms aktivering av PPARy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Material och reagens
- Märk varje brunn i en vävnadsodlingsbehandlad 6-brunnar på lämpligt sätt för varje cellinje eller ett tillstånd som undersöks.
- Förbered 2x cellodlingsmedium genom upplösning av 1 g pulver medium och 0,2 g natriumvätekarbonat i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 50 ml.
- Passera detta medium genom ett 0,2 pm filter för att sterilisera.
- Lägga till ytterligare komponenter som behövs för normal odling av cellinjen av intresse. Exempelvis växer CMT 167 cellinjen i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin-lösning. Varmt medium till 37 ° C i varmvattenbad före användning.
- Förbered 1x cellodlingsmedium separat som du skulle för normal cellkultur av cellinje av intresse.
- Bered en% ädelagar genom tillsättning av 1 g av ädel agar till 100 ml avjoniserat vatten.
OBS: Noble agar löses inte upp helt med agitation ensam. - Förbered0,6% ädel agar genom att tillsätta 0,6 g av ädel agar till 100 ml avjoniserat vatten. Båda agar lösningar kan göras i 100 ml glasflaskor med stängbara lock för långtidslagring.
- Autoklav de ädla agar blandningar för att sterilisera. Dessa blandningar kan framställas i förväg och lagras vid 4 ° C, men bör upphettas på nytt vid tidpunkten för experimentet tills ägarn har löst sig fullständigt.
- Förbered nitroblå tetrazoliumklorid lösning genom att göra en 1 mg / ml stamlösning i 1 x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, och 0,24 g KH 2 PO 4 i H2O till en slutlig volym av 1000 ml ). Detta kommer att användas i slutet av experimentet för att färga kolonierna.
2. Plätering av bottenskikt av Agar
- Lossa locket på flaskan med 1% ädelagar och mikrovågsugn i ca 1-2 min. Även uppvärmning i en mikrovågsugn, övervaka lösningen noga för att undvika att koka över. Fortsätt upphettningen under blandning intermittent,tills agarn är helt löst och lösningen är klar.
OBS! Använd grytvantar för att hantera kolv efter uppvärmning. Om du inte gör det kan det orsaka bränn allvarlig skada. - Placera smält agarlösning och förvärmda 2x odlingsmedium i en ishink fylld med varmt kranvatten (42 ° C). Placera också en 50 ml koniskt rör i en rörhållare i ishink med hett vatten. Överför hink till cellodling huva för efterföljande steg.
- För bottenskiktet av agar, behöver du 1,5 ml av en blandning av agar och medium per brunn i en 6-brunnar.
- För att säkerställa en tillräcklig mängd av blandningen, framställa en totalt 12 ml för varje 6-brunnars platta.
- Starta genom att tillsätta 6 ml av odlingsmediet till 50 ml koniska rör och sedan 6 ml av en% ädelagar lösning.
- Vänd koniska röret flera gånger för att blanda. Att arbeta i rask takt kommer att förhindra för tidig härdning av mjuk agar.
- Rita upp ca 5,5 ml av blandningen i en 5 ml serologisk piPette.
- Låt luftbubblorna att stiga till toppen av pipett kolumnen innan de deponerar 1,5 ml av denna blandning i varje brunn. Var försiktig för att undvika avsättning av eventuella luftbubblor in i plattbrunnar.
- Täck plattorna och tillåta agar blandningen stelna vid rumstemperatur i cellodling huv, för 30 min.
3. Plating det övre skiktet av agar innehållande celler
- När det nedre skiktet av agar har stelnat, börjar framställningen av det övre skiktet.
- Först skörd celler genom trypsinering och späda ut dem 1: 5 i odlingsmedium (t ex för 1 ml trypsin, tillsätt 4 ml medium) i en 15 ml koniska rör.
- Räkna celler och beräkna antal celler som behövs per brunn för att framställa en slutlig cellsuspension vid denna tidpunkt. Detta antal varierar beroende på celltyp. Använd 5.000 celler / brunn som utgångspunkt och justera efter behov. För denna cell nummer, skulle du förbereda en cellsuspension av 6667 celler / ml (dvs. varje well erhåller 0,75 ml av denna suspension och 0,75 ml av agar för en total volym av 1,5 ml; koncentrationen av celler kommer också att spädas 1: 2 till en slutlig total cellräkning av 5000).
- Volymen av cellsuspension som behövs per brunn i en 6-brunnars platta kommer återigen att vara 1,5 ml. Bered ytterligare cellsuspension på totalt 12 ml per 6-brunnar.
- Smält 0,6% agar lösning i en mikrovågsugn som ovan och lägg i is hink med varmt vatten tillsammans med en 50 ml koniskt rör i ett rör hållare och den slutliga cellsuspensionen från steg 3.3.
- Överför ishink med smält 0,6% agar till cellodling huva för efterföljande steg.
- Blanda 0,6% agar och cellsuspension i en 1: 1-förhållande, framställning av en total volym av 12 ml per 6-brunnar. 1,5 ml kommer att krävas per brunn utan extra bör göras enligt ovan.
- Pipett 6 ml cellsuspension till 50 ml koniska rör.
- Därefter, tillsätt 6 ml av 0,6% agar till röret.
OBS: Temperaturen i denna blandning måste varahålls runt 42 ° C för att undvika för tidig härdning och för att maximera cellöverlevnad. - Arbeta snabbt, pipett denna blandning 2-3x att distribuera celler, sedan dra upp 5,5 ml av blandningen i en 5 ml serologisk pipett.
- Låt eventuella luftbubblor att stiga till toppen av pipett kolumnen innan de deponerar 1,5 ml av denna blandning i varje brunn. Var försiktig för att undvika avsättning av eventuella luftbubblor in i plattbrunnar.
- Tillåt cell / agar blandningen stelna vid rumstemperatur i cellodling huv, för 30 minuter innan de placeras i en 37 ° C befuktad cellodlingsinkubator.
- Den tid som krävs för adekvat kolonibildning varierar för varje cellinje, typiskt i närheten av 21 dagar.
- Ett skikt av odlingsmedium bör bibehållas under det övre skiktet av agar för att förhindra uttorkning. 100 ul av mediet tillsätts två gånger per vecka är tillräckligt för detta ändamål.
4. färga Tallrikar och räkningen av kolonier
- Stain-celler genom tillsats av 200 _6, l av nitroblå tetrazoliumklorid lösning per brunn och inkubering av plattorna över natten vid 37 ° C.
- När kolonierna färgas, ta fotografier av brunnarna med en avbildnings och räkna kolonier som använder mjukvara för bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Expressionen av Wnt7A och Fzd9 i CMT167 celler är effektiv i tumörundertryckning, såsom illustreras genom vårt mjukagar-kolonibildningsanalys. Preliminärt använde vi Q-PCR för att visa att Wnt7A och Fzd9 mRNA uttrycks i låga halter i CMT167 celler. CMT167 celler uppvisade låga nivåer av endogen Wnt7A och Fzd9 jämfört med MLE-12-celler, en SV40-transformerad murin lung- epitelceller linje (figur 1). Vi transfekterades sedan CMT167 celler med två retrovirala överuttryck vektorer som uttrycker mänskliga konstruktioner av Wnt7A (LNCX-Wnt7A) och Fzd9 (LPCX-Fzd9) för att skapa en stabil cellinje som uttrycker både Wnt7A och Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Vi bekräftade expression av Wnt7A och Fzd9 av Q-PCR i denna cellinje (Figur 2). Som vår tidigare arbete har visat, är PPARy en nedströms effektor av Wnt7A / Fzd9 signalering. Wnt signalvägar är olika. Därför måste korrekt uttryck och aktivering av en särskild Wnt och dess FZD receptorn vara åsnorsed att använda en nedströmseffekt känd för att aktiveras av Wnt / FZD par intresse. För Wnt7A och Fzd9 blev PPARy valdes av denna anledning. Vi transfekterade CMT167 celler som överuttrycker tomma vektorer (LNCX / LPCX) eller Wnt7A / Fzd9 med ett luciferasrapportör-konstrukt innehållande en PPARy-svarselement. Vi visade att vår CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 cellinje hade nästan sexfaldigt ökad PPAR-RE-aktivitet (Figur 3). Slutligen, såsom nämnts tidigare, för att bekräfta tumörsuppressoraktivitet av Wnt7A och Fzd9 in vitro, utförde vi en mjukagar-kolonibildningsanalys. CMT167 vektor som uttrycker och Wnt7A / Fzd9 uttryckande stabila cellinjer ströks ut på mjuk agar-plattor och tilläts bilda kolonier under 2-3 veckor. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 celler bildade betydligt färre kolonier jämfört med vektor-transfekterade celler, som illustrerar tumörsuppressorfunktion av Wnt7A och Fzd9 (Figur 4). Bilder togs av alla plattor och Colonies räknades med hjälp av en värmekameran och bildprogram.
Figur 1: Minskade nivåer av Wnt7A och Fzd9 mRNA i CMT167 celler jämfört med MLE-12-celler Q-PCR-analys utfördes för att bestämma mRNA-nivåer av Wnt7a och Fzd9 normaliserade till GAPDH.. Nivåer i CME167 murint lung-karcinom-celler jämfört med dem i MLE-12 SV40-transformerade murina lungepitelceller, vilka normaliserades till 1,0. CMT167 celler visade lägre nivåer av Wnt7a (A) och Fzd9 (B) mRNA vid jämförelse med MLE-12-celler.
Figur 2:. Överuttryck av Wnt7a / Fzd9 i CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabil cellinje Wnt7A / Fzd9 stabil överuttryck mänskliga konstruktioner gjordes med hjälp av en LN CX retroviral vektor. Q-PCR utfördes för Wnt7A och Fzd9 och mRNA-nivåer normaliserades till GAPDH i tomma vektor transfekterade celler och i Wnt7A / Fzd9 överuttryckande celler. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 celler uttryckte höga nivåer av Wnt7a (A) och Fzd9 (B) mRNA.
Figur 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 stabil överuttryckande cellinje uppvisar ökad PPAR-RE promotoraktivitet CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 eller tom vektor CMT167 LNCX / LPCX stabila överuttryckande celler transfekterades med en PPAR-responselement promotor-luciferas-plasmid med användning av Lipofectamine-reagens.. Promotoraktiviteten kvantifierades i förhållande till vektor-transfekterade celler, där promotorn aktivitet normaliserades till 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabila överuttryckande celler visade en ungefär sex-faldig ökning av PPAR-promotoraktivitet.
Figur 4:. Soft Agar kolonibildningsanalys av vektoruttryck CMT167 LNCX / LPCX celler och CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 överuttryckande celler Vector-uttryck CMT167 LNCX / LPCX celler och CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 överuttryckande celler ströks ut i en mjuk agar kolonibildning analys per protokoll som beskrivits ovan. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 celler visade en markant minskning av kolonibildning. Representativa brunnar som visar kolonier för varje cellinje. Bild av brunnar är representativa för tre oberoende experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro bekräftelse av tumör undertryckande funktion signalproteiner är svårt. En av de mest rigorösa analyser tillgängliga för att undersöka denna egenskap är den mjuka agar kolonibildningsanalys. Här har vi illustrerat mjukagar-kolonibildningsanalys med användning av ett murint lungkarcinom-cellinje som stabilt överuttrycker Wnt7a och Fzd9 jämfört med dess föräldra CMT167 cellinje.
Det finns flera viktiga saker att tänka på när det gäller mjuk agar analysen. Det mest kritiska steget i denna analys är plätering av cellerna. Cellräkningar ska vara korrekt, och agar lösningen får inte vara för varmt. Om inga kolonier bildas, kan de celler som har skadats på grund av värmestress. I denna situation bör analysen upprepas, vidta försiktighetsåtgärder för att hålla agar temperatur så nära 42 ° C som möjligt. Alternativt kan ett större antal celler skall pläteras.
Det finns några begränsningar för mjuk agar analysen.En sådan begränsning är att det tar två till tre veckor för slutförande. En annan är att den inte tillåter cell hämtning vid färdig. Modifikationer av denna teknik använder specialiserade agar lösningar för att göra det möjligt för celler som skördas för DNA eller protein vid analys avslutad. Alternativa metoder använder också fluorometrisk färgämne för att möjliggöra hög genomströmning analyser. Icke desto mindre är den traditionella mjukagar-kolonibildningsanalys som en av de mest rigorösa tester för bekräftelse av förankringsoberoende celltillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H.
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
