Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

doi: 10.3791/51998 Published: October 27, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتقييم التحول الخلوي في المختبر. تاريخيا، تم استخدام فحص آخر، لفحص مولد الرمع، التي وصفها الصولجان وآخرون في عام 1956 لتقييم قدرة الخلايا على تكوين مستعمرات 1. في هذه التقنية، وفرقت الخلايا على لوحة الثقافة، وتنمو في وجود الخلايا المغذية "أو المتوسطة مكيفة لتوفير عوامل النمو اللازمة. كان الحد من هذه التقنية أنها قدمت فقط المعلومات المتعلقة تشكيل مستعمرة. يتم منع الخلايا الطبيعية من النمو مرسى مستقل، نظرا لنوع معين من الموت أفكارك، ودعا anoikis 2. ومع ذلك، تحولت الخلايا لديها القدرة على النمو والانقسام من دون ملزم لالركيزة. للاستفادة من هذا المفهوم، طور الباحثون لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. ومنذ ذلك الحين تم تعديل أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص، في السنوات الأخيرة، من أجل التصدي ليرة سوريةاحتياجات ecific. تباين واحد ينطوي على دمج صبغة فلوروميتريك للسماح الإنتاجية العالية مستعمرة العد. اختلاف آخر ينطوي استخدام الحل أجار متخصص للسماح للاسترجاع من خلايا قابلة للحياة بعد تشكيل مستعمرة عندما تكون هناك حاجة البروتين أو الحمض النووي العينات.

في أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص التقليدي، وتزرع الخلايا في طبقة من أجار لينة مختلطة مع خلية ثقافة المتوسط ​​الذي يرتكز على طبقة أخرى من أجار لينة، ويخلط أيضا مع خلية ثقافة المتوسط، ولكن تحتوي على تركيز أعلى من أجار. هذا يمنع الخلايا من الانضمام إلى لوحة الثقافة، ولكن يسمح تحول الخلايا لتشكل مستعمرات مرئية. الأساس المنطقي وراء هذه التقنية هو أن الخلايا الطبيعية تعتمد على الخلية إلى خارج الخلية اتصال مصفوفة لتكون قادرة على النمو والانقسام. على العكس، تحول الخلايا لديها القدرة على النمو والانقسام بغض النظر عن البيئة المحيطة بهم. وبالتالي، كانت خلايا قادرة على تشكيل مستعمرات بطريقة مستقلة ج-مرسىonsidered أن تتحول ومسرطنة. الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس هذه القدرة في الخلايا بطريقة شبه الكمية وصرامة.

إشارات الطريق WNT أمر بالغ الأهمية في التطور الجنيني، وغالبا ما ينظم دي في تكون الأورام 3-6. هناك مسارات متعددة ترتبط مع إشارات WNT. مسار قانوني ينطوي على إشارات WNT وتنظيم النسخ الجيني المصب من خلال آثاره على coactivator النسخي بيتا كاتينين. Wnts أيضا إشارة من خلال عدة مسارات غير متعارف عليها، على سبيل المثال، في مسار مستو قطبية الخلية، والذي ينظم العناصر المتورطة في بنية هيكل الخلية ومسار WNT الكالسيوم، الذي ينظم إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية 8. بروابط WNT تمارس أنشطتها من خلال ربط مستقبلات Frizzled. على الرغم من أن عدة Wnts وقد ثبت أن upregulated في سرطان الرئة، وقد تبين Wnt7a أن ينظم إلى أسفل في غير األصغرل خلية سرطان الرئة من خلال المروج مثيلة 9. Wnt7a تربط Fzd9 وبمثابة القامع الورم من خلال مسار غير متعارف عليه. استعادة WNT-7A وFZD-9 يمنع نمو خلايا غير صغيرة خلية سرطان الرئة 10. وتوسط آثار Wnt7a / Fzd9 من خلال تفعيل إرك-5، والذي بدوره، ينشط بيروكسية تنشيط مستقبلات ناشر γ (PPARγ) 11،12. هنا، وتبين لنا أن overexpression من Wnt7a وFzd9 النتائج في قمع النمو مرسى مستقل لسرطان الرئة خط الخلية الفئران. تم اشتقاق خلايا CMT167 الفئران من سرطان الرئة في C57BL / 13 الفئران lcrf وكانت ستابلي مع Wnt7A وFzd9. وقد أكد overexpression من Wnt7A وFzd9 بواسطة الكمي-PCR (Q-PCR) وظائف Wnt7A وFzd9 overexpression وأكد من خلال تفعيل المصب من PPARγ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد المواد والكواشف

  1. تسمية كل بئر من زراعة الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا بشكل مناسب لكل خط الخلية أو حالة قيد التحقيق.
  2. إعداد 2X مستنبت الخلايا عن طريق إذابة 1 غرام من مسحوق المتوسطة و 0.2 غرام من بيكربونات الصوديوم في دي المتأينة المياه إلى الحجم النهائي من 50 مل.
  3. تمر هذه الوسيلة من خلال مرشح 0.2 ميكرون لتعقيم.
  4. إضافة مكونات إضافية لازمة لثقافة طبيعية للخط الخلوي من الفائدة. على سبيل المثال، تنمو CMT خط 167 خلية في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين حل. المتوسط ​​الدافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن قبل استخدامها.
  5. إعداد 1X خلية ثقافة المتوسط ​​بشكل منفصل كما تفعل لزراعة الخلايا العادية من خط خلية من الفائدة.
  6. إعداد 1٪ أجار النبيل بإضافة 1 غرام من أجار نبيلة إلى 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: سوف نوبل أجار لا تذوب تماما مع الانفعالات وحدها.
  7. إعداد0.6٪ نبيلة أجار عن طريق إضافة 0.6 غرام من أجار نبيلة إلى 100 مل من الماء دي المتأينة. كلا الحلول أجار ويمكن إجراء في 100 مل زجاجة الزجاج مع الأغطية محكمة السد للتخزين على المدى الطويل.
  8. الأوتوكلاف خلطات آغار النبيلة لتعقيم. هذه الخلطات يمكن إجراء في وقت مبكر وتخزينها في 4 درجات مئوية ولكن يجب أن يكون ساخنا مرة أخرى في وقت التجربة حتى يذوب تماما أجار.
  9. تحضير محلول كلوريد تترازوليوم نتروبلو بجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون في برنامج تلفزيوني 1X (8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 ز نا 2 هبو 4 و 0.24 غرام KH 2 PO 4 في H 2 O إلى الحجم النهائي من 1000 مل ). وسوف تستخدم هذه في نهاية التجربة وصمة عار على المستعمرات.

2. تصفيح من طبقة سفلية من آجار

  1. ترخي الغطاء على زجاجة من 1٪ أجار النبيل والميكروويف لمدة 1-2 دقيقة. في حين تسخين في الميكروويف، ومراقبة عن كثب الحل لتجنب غليان. مواصلة التدفئة، في حين خلط متقطع،حتى يذوب تماما أجار والحل واضح.
    ملاحظة: استخدم قفازات مقاومة للحرارة للتعامل مع قارورة بعد التسخين. الفشل في القيام بذلك قد يؤدي إلى حرق أو إصابة خطيرة.
  2. وضع ذاب حل أجار وقبل تحسنت مستنبت 2X في دلو الجليد مملوءة ماء الصنبور الساخن (42 درجة مئوية). وضع أيضا أنبوب مخروطي 50 مل في حامل أنبوب في دلو الثلج مع الماء الساخن. دلو لنقل ثقافة خلية غطاء للخطوات اللاحقة.
  3. للطبقة السفلية من أجار، سوف تحتاج 1.5 مل من مزيج من أجار والمتوسطة في بئر من لوحة 6 جيدا.
  4. لضمان وجود كمية كافية من هذا الخليط، وإعداد ما مجموعه 12 مل لكل لوحة 6 جيدا.
  5. نبدأ بإضافة 6 مل من مستنبت إلى 50 مل أنبوب مخروطي ثم 6 مل من 1٪ الحل أجار النبيل.
  6. عكس أنبوب مخروطي عدة مرات لخلط. سوف نعمل بخطى سريعة منع تصلب المبكر للأجار لينة.
  7. وضع ما يقرب من 5.5 مل من الخليط في 5 مل بي المصليةpette.
  8. السماح لفقاعات الهواء لترتفع إلى أعلى العمود ماصة قبل إيداع 1.5 مل من هذا الخليط في كل بئر. توخي الحذر لتجنب ترسب أي فقاعات الهواء في الآبار لوحة.
  9. تغطية لوحات والسماح خليط أجار ليصلب في درجة حرارة الغرفة، في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة، لمدة 30 دقيقة.

3. طلاء الطبقة العليا من الخلايا التي تحتوي على آجار

  1. مرة واحدة وقد عززت الطبقة السفلى من أجار، يبدأ التحضير للطبقة العليا.
  2. أولا، من قبل خلايا الحصاد trypsinization وتمييع لهم 1: 5 في مستنبت (مثلا 1 مل من التربسين، إضافة 4 مل من المتوسط) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  3. عد الخلايا وحساب عدد الخلايا اللازمة لكل بئر لإعداد تعليق خلية النهائي في هذا الوقت. وهذا العدد تختلف تبعا لنوع الخلية. استخدام 5000 خلية / كذلك نقطة انطلاق وتعديل حسب الحاجة. لذلك عدد الخلايا، وكنت إعداد تعليق خلية من 6667 خلية / مل (أي كل أهلا وسهلاسوف يحصل ل 0.75 مل من هذا التعليق و 0.75 مل من أجار لإجمالي حجم 1.5 مل. وسيتم أيضا تركيز خلايا تخفيفه 1: 2 لعدد الخلايا الكلي للنهائي 5000).
  4. فإن حجم التعليق الخلية اللازمة لكل بئر من لوحة 6 جيدا مرة أخرى تكون 1.5 مل. إعداد تعليق خلية إضافي بقيمة 12 مل لكل لوحة 6 جيدا.
  5. تذوب 0.6٪ محلول أجار في الميكروويف على النحو الوارد أعلاه ووضعها في دلو الثلج التي تحتوي على الماء الساخن مع 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في حامل أنبوب وتعليق خلية النهائي من الخطوة 3.3.
  6. نقل دلو الثلج ذاب مع 0.6٪ أجار لغطاء محرك السيارة زراعة الخلايا لخطوات لاحقة.
  7. مزيج 0.6٪ أجار وتعليق خلية في نسبة 1: 1، وإعداد إجمالي حجم 12 مل لكل لوحة 6 جيدا. سيطلب 1.5 مل لكل بئر ولكن خارج ينبغي أن تدلي على النحو الوارد أعلاه.
  8. ماصة 6 مل من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل.
  9. ثم، تضاف 6 مل من 0.6٪ أجار للأنبوب.
    ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة هذا الخليطأبقى حوالي 42 درجة مئوية لتفادي تصلب سابق لأوانه وتعظيم بقاء الخلية.
  10. العمل بسرعة، ماصة هذا الخليط 2-3x لتوزيع الخلايا، ثم وضع 5.5 مل من الخليط في 5 مل ماصة المصلية.
  11. يسمح أي فقاعات الهواء لترتفع إلى أعلى العمود ماصة قبل إيداع 1.5 مل من هذا الخليط في كل بئر. توخي الحذر لتجنب ترسب أي فقاعات الهواء في الآبار لوحة.
  12. السماح للخليط خلية / أجار ليصلب في درجة حرارة الغرفة، في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة، لمدة 30 دقيقة قبل ان يضع الى 37 درجة مئوية الثقافة ترطيب الخلية الحاضنة.
  13. الوقت اللازم لتشكيل مستعمرة يختلف كاف لكل خط الخلية، عادة حوالي 21 يوما.
  14. ينبغي الحفاظ على طبقة المتوسطة من النمو خلال الطبقة العليا من أجار لمنع جفاف. 100 ميكرولتر من المتوسط ​​أضاف مرتين أسبوعيا كافية لهذا الغرض.

4. تلطيخ لوحات وعد المستعمرات

  1. خلايا صمة عار وذلك بإضافة 200 _6؛ لتر من محلول كلوريد تترازوليوم نتروبلو لكل بئر واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. مرة واحدة هي ملطخة المستعمرات، والتقاط صور فوتوغرافية من الآبار باستخدام تصوير والاعتماد المستعمرات باستخدام برمجيات تحليل الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التعبير عن Wnt7A وFzd9 في CMT167 خلايا فعال في قمع الورم كما هو موضح لدينا أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص. مبدئيا، استخدمنا Q-PCR لإظهار أن يتم التعبير عن Wnt7A وFzd9 مرنا في مستويات منخفضة في CMT167 الخلايا. أظهرت خلايا CMT167 مستويات منخفضة من الذاتية Wnt7A وFzd9 بالمقارنة مع MLE 12 الخلايا، والفئران الظهارية الرئة خط الخلية تتحول SV40 (الشكل 1). ثم نحن transfected CMT167 الخلايا مع اثنين من ناقلات overexpression فيروسات معربا عن يبني الإنسان من Wnt7A (LNCX-Wnt7A) وFzd9 (LPCX-Fzd9) لإنشاء خط الخلية مستقرة التي تعبر عن كل من Wnt7A وFzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). أكدنا التعبير عن Wnt7A وFzd9 التي كتبها Q-PCR في هذا الخط الخلية (الشكل 2). كما أظهرت عملنا السابق، PPARγ هو المستجيب المصب Wnt7A / Fzd9 الإشارات. مسارات الإشارات WNT متنوعة. لذا، يجب أن يكون التعبير السليم وتفعيل معين WNT والمستقبلة لها FZD الحميرالحوار الاقتصادي الاستراتيجي باستخدام المستجيب المصب ما هو معروف لتفعيلها من قبل الزوج WNT / FZD من الفائدة. لWnt7A وFzd9، تم اختيار PPARγ لهذا السبب. نحن transfected CMT167 خلايا overexpressing ناقلات الفارغة (LNCX / LPCX) أو Wnt7A / Fzd9 مع مراسل بناء luciferase المراسل تحتوي على عنصر استجابة PPARγ. أظهرنا أن لدينا / Fzd9 خط الخلية CMT167 LL Wnt7A كان تقريبا ستة أضعاف زيادة النشاط PPAR-RE (الشكل 3). أخيرا، وكما ذكرنا سابقا، لتأكيد النشاط ورم القامع للWnt7A وFzd9 في المختبر، أجرينا لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. يعبرون عن CMT167 النواقل وWnt7A / Fzd9 معربا تم مطلي خطوط الخلايا مستقرة على لوحات أجار لينة وسمح لتشكيل المستعمرات لمدة يومين أو ثلاثة أسابيع. خلايا CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 شكلت أقل بكثير المستعمرات بالمقارنة مع خلايا transfected ناقلات، مما يدل على وظيفة ورم القامع للWnt7A وFzd9 (الشكل 4). تم التقاط الصور من كل لوحات، وcolonieاحصي S باستخدام تصوير والتصوير البرامج.

الشكل 1
الشكل 1: انخفض مستويات Wnt7A وFzd9 مرنا في الخلايا CMT167 مقارنة MLE 12 خلايا تم إجراء تحليل Q-PCR لتحديد مستويات مرنا من Wnt7a وFzd9 لتطبيع GAPDH. وتمت مقارنة مستويات في CME167 خلايا سرطان الرئة الفئران لتلك الموجودة في MLE 12 رئة الفئران الخلايا الظهارية، تحولت SV40، والتي كانت تطبيع 1.0. أظهرت خلايا CMT167 مستويات أقل من Wnt7a (A) وFzd9 (ب) مرنا مقارنة MLE 12 الخلايا.

الرقم 2
الشكل 2: قدمت Wnt7A / Fzd9 overexpression مستقر يبني الإنسان overexpression من Wnt7a / Fzd9 في CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 خط الخلية مستقرة باستخدام LN. CX ناقلات فيروسات. تم تنفيذ Q-PCR لWnt7A وFzd9، وكانت مستويات مرنا لتطبيع GAPDH في خالي ناقلات الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وWnt7A / Fzd9 خلايا overexpressing. خلايا CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 أعربت مستويات عالية من Wnt7a (A) وFzd9 (ب) مرنا.

الرقم 3
ارتفعت CMT167 Wnt7a / Fzd9 overexpressing مستقر المعارض خط الخلية PPAR-RE نشاط المروج و transfected CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 أو ناقلات الفارغة CMT167 LNCX / LPCX خلايا overexpressing مستقرة مع استجابة PPAR عنصر المروج luciferase المراسل البلازميد باستخدام كاشف Lipofectamine: الرقم 3. وكان كميا النشاط المروج مقارنة مع خلايا transfected ناقلات، حيث تم تطبيع نشاط المروج إلى 1.0. CMT167 LL Wnt7a / أظهرت Fzd9 خلايا overexpressing مستقرة بزيادة حوالي ستة أضعاف في PPAR نشاط المروج.

_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 4
تم مطلي ينة آجار مستعمرة تشكيل الفحص لل، معربا عن ناقلات CMT167 LNCX / LPCX الخلايا وCMT167 LL Wnt7a / Fzd9 overexpressing خلايا CMT167 LNCX / LPCX الخلايا، معربا عن المتجهات وCMT167 LL Wnt7A / Fzd9 overexpressing الخلايا في الناعمة تشكيل مستعمرة أجار: الرقم 4. فحص في بروتوكول المذكورة أعلاه. CMT167 LL Wnt7A / أظهرت خلايا Fzd9 انخفاض ملحوظ في تشكيل مستعمرة. آبار تمثيلية تظهر المستعمرات لكل خط الخلية. الصورة الآبار هي تمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تأكيدا من المختبر وظيفة الورم القمعية من البروتينات مما يشير أمر صعب. واحدة من فحوصات أكثر صرامة المتاحة لتحقيق هذه الخاصية هي لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. هنا، ونحن قد يتضح لينة أجار الفحص تشكيل مستعمرة باستخدام سرطان الرئة خط الخلية الفئران overexpressing مستقر Wnt7a وFzd9 مقارنة الوالدين خط الخلية CMT167 لها.

هناك العديد من النقاط الهامة التي يجب مراعاتها فيما يتعلق الفحص أجار لينة. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الاختبار يتم طلاء الخلايا. يجب أن يكون عدد خلايا دقيقة، ويجب ألا يكون الحل أجار حار جدا. إذا لم يتم تشكيل المستعمرات، قد تعرض للتلف الخلايا بسبب إجهاد الحراري. في هذه الحالة، ينبغي تكرار الفحص، وأخذ الاحتياطات اللازمة للحفاظ على درجة حرارة أجار أقرب إلى 42 درجة مئوية وقت ممكن. بدلا من ذلك، يمكن مطلي عدد أكبر من الخلايا.

وهناك قيود قليلة على فحص أجار لينة.واحد مثل هذا التقييد هو ان الامر يستغرق أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع لاستكمالها. آخر هو أنه لا يسمح لاسترجاع الخلايا عند الانتهاء. إدخال تعديلات على هذه التقنية توظف الحلول المتخصصة أجار للسماح للخلايا أن تحصد لالحمض النووي أو البروتين عند اكتمال الفحص. طرق بديلة تستخدم أيضا صبغة فلوروميتريك للسماح لفحوصات إنتاجية عالية. مع ذلك، يبقى لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص التقليدي واحدا من أكثر الاختبارات صرامة لتأكيد نمو الخلايا مرسى مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cancer Cell Line of Interest Sigma-Aldrich 10032302 CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium Gibco 31800-089 Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium Cellgro 10-040-CV Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum HyClone SH30910.03 Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin CellGro 30-002-Cl Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar BD Biosciences 214230 Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate Fisher BP-328-1 Used in 2x cell culture medium.
Trypsin Cellgro 25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters Fisher 09-761-126 Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent Invitrogen 18324-020 Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager Bio-Rad Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software Bio-Rad Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
  2. Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
  3. Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
  4. Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
  5. Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
  6. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
  7. Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
  8. De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
  9. Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
  10. Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
  11. Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
  12. Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
  13. Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borowicz, S., Van Scoyk, M., Avasarala, S., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Bikkavilli, R. K., Winn, R. A. The Soft Agar Colony Formation Assay. J. Vis. Exp. (92), e51998, doi:10.3791/51998 (2014).More

Borowicz, S., Van Scoyk, M., Avasarala, S., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Bikkavilli, R. K., Winn, R. A. The Soft Agar Colony Formation Assay. J. Vis. Exp. (92), e51998, doi:10.3791/51998 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter