Introduction
软琼脂集落形成测定是广泛用于评估体外细胞转化的技术。在历史上，另一个试验中，集落形成试验，通过冰球等人在1956年描述。用于评价细胞形成集落1的能力。在该技术中，将细胞分散到培养板中，在“进料器”细胞或条件培养基的存在下，以提供必要的生长因子生长。这种技术的局限性是，它仅对于集落形成提供信息。正常细胞是从锚定非依赖性生长抑制，由于特定类型的凋亡性死亡，称为失巢2。然而，转化细胞有能力生长和分裂，而不结合到基片上。利用这一概念，研究人员开发出了软琼脂克隆形成实验。软琼脂集落形成测定法进行了修改，在最近几年，为解决藻ecific需求。一个变化涉及到荧光染料的掺入，允许高通量菌落计数。另一种变型涉及使用专门的琼脂溶液中，以允许集落形成后检索的活细胞时，需要的蛋白质或DNA样本。
在传统的软琼脂集落形成测定法，细胞生长在一层软琼脂与搁置在软琼脂中，还混有细胞培养基的另外一个层细胞培养基混合的，但含有琼脂的浓度较高。这可以防止细胞粘附到培养板上，还允许转化的细胞形成可见的菌落。该技术背后的基本原理是，正常细胞依赖于细胞外基质接触，以便能够生长和分裂。相反，转化细胞具有生长和分化而不论其周围环境的能力。因此，细胞能够形成菌落在锚地无关的方式为Considered待转化和致癌性。该方法的总体目标是测量在一个半定量的和严格的方式在细胞中这种能力。
Wnt信号通路是在胚胎发育的关键和经常去调节肿瘤发生3-6。有与Wnt信号相关联的多种途径。规范的途径，通过对转录共激活因子的β-catenin的影响涉及Wnt信号和下游基因的转录调控。 Wnts还通过几个非经典途径的信号，例如，在平面细胞极性通路，它调节参与细胞骨架结构7的元素，并且所述的Wnt-钙通路，调节钙的释放从内质网8。的Wnt配体通过结合型卷曲受体发挥其活性。虽然几个Wnts已被证明在肺癌中上调，WNT7A已显示被下调非SMaL公司通过启动子甲基化9升细胞肺癌。 WNT7A结合Fzd9并作为通过非经典途径中的肿瘤抑制基因。的Wnt-7a和FZD-9的恢复抑制非小细胞肺癌细胞10的生长。 WNT7A / Fzd9的作用是通过ERK-5，这反过来，激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）11,12的激活介导的。在这里，我们表明WNT7A和Fzd9的过度表达导致的小鼠肺癌细胞株的锚定非依赖性生长的抑制。鼠CMT167细胞来自于C57BL / lcrf小鼠13个肺腺癌和稳定转染WNT7A和Fzd9。 WNT7A和Fzd9的过表达通过定量PCR（Q-PCR）和WNT7A和Fzd9过表达的功能性被证实是通过PPARγ的下游激活确认。
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Protocol
1.准备材料和试剂
- 标记的组织培养的各孔处理的6孔板适当地对每个细胞系或状况进行调查。
- 通过将1g粉末介质和0.2g碳酸氢钠在去离子水至50ml的终体积制备2倍的细胞培养基。
- 通过0.2微米的过滤器进行消毒过此介质。
- 添加所需的感兴趣的细胞系的正常培养的额外组件。例如，生长在RPMI 1640培养基中补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素溶液的CMT 167细胞系。温暖的培养基至37℃，在热水浴中在使用之前。
- 另外准备1个细胞培养液中，你会感兴趣的细胞系正常的细胞培养。
- 制备1％的贵金属琼脂中加入1克贵金属琼脂至100毫升的去离子水中。
注：带搅拌贵族琼脂不会完全溶解孤单。 - 准备0.6％贵金属琼脂，加入将0.6克贵金属琼脂至100毫升的去离子水。既琼脂溶液可以在100毫升玻璃瓶闭自如的盖用于长期存储制成。
- 高压灭菌高贵的琼脂混合消毒。这些混合物可以制成事先并保存于4℃，但应在实验的时间再次加热至琼脂完全溶解。
- 制备氮蓝四唑氯化物溶液通过制备1mg / ml的储备液中的1×PBS（8克NaCl，0.2克氯化钾，1.44克的Na 2 HPO 4，及0.24g的KH 2 PO 4的H 2 O操作1000 ml终体积）。这将用于在实验结束时进行染色的菌落。
2.电镀琼脂底层的
- 松开瓶的1％贵金属琼脂和微波盖约1-2分钟。而加热的微波炉，监控解决方案紧密，以避免沸腾了。继续加热，同时混合间歇直到琼脂完全溶解，溶液澄清。
注：使用耐热手套加热后处理烧瓶中。如果不这样做可能会造成烧伤或严重伤害。 - 放置熔化的琼脂溶液和预热的2×培养基中冰桶充满热自来水（42℃）。也放置在50ml锥形管中，在冰桶用热水的管座。转斗细胞培养罩的后续步骤。
- 对于琼脂的底层，则需要1.5毫升琼脂的混合和中每一个6孔板的孔的。
- 以确保混合物的足够量，制备总共12毫升每6孔板中。
- 开始通过加入6毫升培养介质向50ml锥形管中，然后6毫升1％贵金属琼脂溶液中。
- 倒置的锥形管几次以混合。工作在轻快的步伐将防止软琼脂过早硬化。
- 制定约5.5毫升混合物到5ml的血清学圆周率佩特。
- 使气泡上升到移液管塔的顶部以及沉积1.5ml该混合物到每个前。请小心，以避免任何气泡沉积到板孔。
- 覆盖板并允许琼脂混合物固化在室温下，在细胞培养罩，30分钟。
3.电镀琼脂含细胞的上层
- 一旦琼脂的下层已经凝固，开始制备上层的。
- 首先，收获的细胞用胰酶消化并稀释它们1:5的培养基（ 例如，1 ml胰蛋白酶的，加入4毫升培养基）入15ml锥形管中。
- 计数细胞，并计算出每孔在这个时候制备的最终细胞悬浮液所需要的细胞数量。这个数目将取决于细胞类型而有所不同。使用5000细胞/孔为起点，并根据需要进行调整。对于这个手机号码，您将编写的6667个细胞/ ml的细胞悬液（ 即每个WEL升将接收0.75毫升此悬浮液加入0.75ml琼脂为1.5毫升总体积;细胞的浓度也将1:2稀释为5000的最终总细胞计数）。
- 每一个6孔板的所需要的细胞悬浮液的体积将再次为1.5毫升制备额外的细胞悬浮液共计每6孔板12毫升
- 熔体在微波如上0.6％琼脂溶液中，并放入冰桶含热水连同50ml锥形管中的管保持器和来自步骤3.3的最终细胞悬浮液。
- 转让融化的0.6％琼脂细胞培养罩的后续步骤的冰桶。
- 混合0.6％的琼脂和细胞悬浮液以1：1的比例，制备12毫升每6孔板的总体积。 1.5毫升将被要求每孔加，但应作出以上。
- 吸管6毫升细胞悬浮到50ml锥形管中。
- 然后，添加6毫升0.6％琼脂的在管。
注：该混合物的温度必须保持在42℃，以避免过早硬化，并最大限度细胞的存活。 - 工作迅速，吸这种混合物2-3倍分发细胞，然后制定5.5毫升混合成5毫升血清吸管。
- 允许任何气泡上升到移液管塔的顶部以及沉积1.5ml该混合物到每个前。请小心，以避免任何气泡沉积到板孔。
- 允许细胞/琼脂混合物放置到37℃的湿润的细胞培养箱中之前，在室温下固化，在细胞培养罩，30分钟。
- 所需的足够的集落形成的时间而变化的每个细胞系，通常约21天。
- 应维持在琼脂上以防止干燥的上层培养基中的层。将100μl加入每周两次培养基足以用于此目的。
4.染色板和菌落计数
- 染色的细胞中加入200 _6;微升每孔并过夜孵育板在37℃，氮蓝四唑氯化物溶液。
- 一旦菌落染色，采取使用成像井的照片，并使用计数图像分析软件的殖民地。
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Representative Results
如由我们的软琼脂集落形成测定WNT7A和Fzd9在CMT167细胞中的表达是有效的肿瘤抑制。预先，我们用Q-PCR表明，WNT7A和Fzd9 mRNA的表达在低的水平在CMT167细胞。 CMT167细胞表现出内源性WNT7A和Fzd9水平低时相比，MLE-12细胞中，SV40转化的小鼠肺上皮细胞系（ 图1）。然后，我们转CMT167细胞2的逆转录病毒表达载体表达WNT7A（LNCX-WNT7A）和Fzd9（LPCX-Fzd9）的人构建体来创建表示既WNT7A和Fzd9（CMT LL WNT7A / Fzd9）的稳定细胞系。我们在此细胞系（ 图2）确认WNT7A和Fzd9的通过Q-PCR表达。如同我们之前的工作已经表明，PPARγ是WNT7A / Fzd9信令的下游效应。 Wnt信号途径是多种多样的。因此，一个特定的Wnt和FZD受体的适当表达和活化必须驴sed的使用是已知的Wnt基因/ FZD对感兴趣的被激活的下游效应。对于WNT7A和Fzd9，PPARγ被选为这个原因。我们转CMT167细胞过度空载体（LNCX / LPCX）或WNT7A / Fzd9与含有PPARγ响应元件的荧光素酶报道构建体。我们发现，我们的CMT167 LL WNT7A / Fzd9细胞系具有几乎6倍的增加PPAR-RE的活性（ 图3）。最后，如前面提到的，为了确认WNT7A和Fzd9的体外肿瘤抑制活性，我们进行了软琼脂集落形成测定。 CMT167载体表达和WNT7A / Fzd9表达稳定细胞株接种在软琼脂平板上，使之形成菌落为两到三周。相比载体转染的细胞，示WNT7A和Fzd9（ 图4）的肿瘤抑制功能CMT167 LL WNT7A / Fzd9细胞形成显著更少菌落。照片拍摄所有板块，与科勒尼s采用的成像和图像处理软件计数。
图1：减少WNT7A和Fzd9 mRNA的水平在CMT167细胞相比MLE-12细胞中进行Q-PCR分析，以确定表达水平WNT7A和Fzd9的标准化为GAPDH。在CME167小鼠肺癌细胞水平相比，这些在MLE-12的SV40转化的小鼠肺上皮细胞，其归一化为1.0。 CMT167细胞显示WNT7A（A）和Fzd9（B）中的mRNA水平较低时相比，MLE-12细胞。
图2：WNT7A / Fzd9在CMT167 LL WNT7A / Fzd9的稳定细胞系的过度表达 WNT7A / Fzd9稳定过表达人构建体使用的LN制成 CX逆转录病毒载体。 Q-PCR方法对WNT7A和Fzd9进行，mRNA水平标准化为GAPDH空载体转染的细胞和WNT7A / Fzd9过表达细胞。 CMT167 LL WNT7A / Fzd9细胞表达高水平的WNT7A（A）和Fzd9（B）的mRNA。
图3：CMT167 WNT7A / Fzd9稳定过表达细胞系表现出增加的PPAR-RE的启动子活性 CMT167 LL WNT7A / Fzd9或空载体CMT167 LNCX / LPCX稳定过表达细胞，转染使用Lipofectamine试剂的PPAR反应元件的启动子荧光素酶质粒。启动子的活性进行定量比较，载体转染的细胞，其中的启动子活性被标准化为1.0。 CMT167 LL WNT7A / Fzd9稳定过度表达细胞表现出PPAR的启动子活性的约6倍的增加。
图4：载体表达CMT167 LNCX / LPCX细胞和CMT167 LL WNT7A / Fzd9过度表达细胞的软琼脂集落形成分析向量表达CMT167 LNCX / LPCX细胞和CMT167 LL WNT7A / Fzd9过度表达细胞铺板在软琼脂集落形成每个协议分析如上所述。 CMT167 LL WNT7A / Fzd9细胞在集落形成的显着降低。代表井示出对于每种细胞系集落。图象井代表三次独立的实验。
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Discussion
中的信号蛋白的肿瘤抑制功能的体外确认是困难的。一个可用来调查该属性的最严格的测定法是软琼脂集落形成测定。这里，我们已经说明了利用鼠肺癌细胞稳定过表达WNT7A和Fzd9相比其亲CMT167细胞系的软琼脂集落形成测定。
有考虑有关软琼脂法的几个要点。在此测定法中最关键的步骤是电镀的细胞。细胞计数必须是准确的，并将琼脂溶液不能是太热了。如果没有集落形成，细胞可能已被损坏由于热应力。在这种情况下，该测定应反复，采取预防措施，以保持琼脂温度接近42℃成为可能。可选地，更大数目的细胞可以被电镀。
有一些局限性的软琼脂测定法。这样的一个限制是，它需要两到三个星期完成。另一个原因是，它不允许小区的检索完成时。这种技术的变型采用专门的琼脂溶液，以允许将收获的细胞用于DNA或蛋白质测定完成时。可供选择的方法也利用荧光染料，以允许高通量测定。然而，传统的软琼脂集落形成测定法仍然是最严格的测试，以确认不依赖贴壁细胞生长中的一个。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
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