Summary
비만 세포와 호염기구의 활성화를 특징으로 알레르기 반응은, IgE 항체의 가교 및 염증 매개 물질의 방출에 의해 구동된다. 알레르기 반응의 정량적 인 평가는 알레르겐 공격 후 혈관 투과성의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용함으로써 달성 될 수있다.
Abstract
알레르기 반응은 비만 세포 및 호염기구, 및 혈관 작용 및 염증 매개체의 후속 릴리스의 활성화의 결과이다. 감작 된 개인의 알레르기 항원에 노출되면 약간의 홍반에서 생명을 위협하는 아나필락시스까지 다양 임상 증상이 발생할 수 있습니다. 실험실에서, 다양한 동물 모델은 알레르기 반응을 구동 메커니즘을 이해하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 지역화 알레르기 반응을 정량화 혈관 투과성의 변화를 측정하기위한 자세한 방법을 설명합니다. 지역 아나필락시스 분석은 첫째 1920 년대에보고하고, 코지마 외 출판 기술에서 적응하고있다. 2007 년 한.이 분석에서, OVA로 감작 마우스는 차량 왼쪽 귀에 및 OVA와 오른쪽 귀에 도전한다. 이것은 에반스 블루 염료의 정맥 내 주사에 의해 이어진다. 텐 분 에반스 블루를 주입 한 후, 동물은 extravasated에있다 염료 안락사되고귀에 포름 아미드 하룻밤 추출된다. 추출 염료의 흡광도 후 분광 광도계 정량화된다. 이 방법은 확실하게 지역의 알레르기 반응의 시각 및 정량화 할 수있는 징후가 발생합니다.
Introduction
타입 I의 과민 반응은 비만 세포와 호염기구의 표면에 IgE 항체의 항원 - 유도 된 가교 결합에 의해 매개된다. 이 세포의 탈과립과 히스타민, 트립 타제 및 혈소판 활성화 인자 (2)와 같은 혈관 작용 및 염증 매개 물질의 방출에 발생합니다. 탈과립 동안 예비 성형 매개 물질의 방출에 이어, 비만 세포는 합성하고 또한 혈관 투과성 3을 증가하는 프로스타글란딘과 류코트리엔을 놓습니다. 초기 임상 반응이 급격히 발생하여 "즉각적인 반응"이라한다. 피부에, 피부 발진 및 플레어 반응은 항원 도전 분 이내에 쉽게 볼 수 있습니다. 도전 복용량에 따라, "늦은 위상 응답"몇 시간 후를 관찰하는 것이 가능하다. 후기의 부종은 조직이로 현지화 부종 및 백혈구 모집 때문이다. 히스타민, 일반적에 참여 주요 매개체로 간주즉각적인 알레르기 반응은, 한 (HR1)의 선박과 히스타민 수용체 2 (HR2) 평활근에 표현에 표현 된 히스타민 수용체에 작용한다. 결합 된 효과는 염증 넷의 사이트에서 혈액의 흐름과 혈관 투과성을 증가시킨다.
알레르기 동물 모델의 다양한 알레르기 성 천식, 전신성 아나필락시스, 지역 과민증의 모델을 포함한 알러지 염증과 관련된 기전을 연구하기 위해 개발되었다. 정맥 염료 관리는 출판물이 1920 년대 5로 다시이 기술 데이트를 기술로, 거의 한 세기에 대 한 동물 모델에서 지역화 된 알레르기 반응을 측정하는 데 사용되었다. 토끼, 기니피그 즉각적인 과민성 반응을 검사하는 데 사용되는 제 동물 모델이었으며, 가장 민감한 반응은 일반적으로 귀 5,6에서 발견되었다. 분석은 이후 래트 (7) 및 마우스 (8)에 사용하기 위해 유효 하였다.
역사적으로,실험 다양한 방법 전에 염료를 주입, 염료를 주입하기 전에 항원의 주입에 항원을 주입하고, 염료 및 항원의 동시 분사로 사용되었다. 알레르기 반응을 측정하기위한 수단으로서 염료 정맥 투여는 수동, 활성 측정에 사용하고, 수동적 반응 5,9 반전 될 수있는 다목적 분석이다. 수많은 염료 트리 판 블루, Pontamine 스카이 블루, 에반스 블루,이기 블루 536, 인도 잉크 5,6,9 포함 알레르기 반응을 평가하기 위해 사용되었다. 0.5 % 에반스 블루의 용액은 현재 피부에 알레르기 반응을 측정하기 위해 사용되는 표준 염료이다.
도전에 대한 아나필락시스 반응은 과도하다; 최대 강도 (10) 내에 도달 - 염료 주입 15 분, 염료에 관계없이 구에 사용되는 동물 종, 공격 후 30 분을 투여하는 경우에는 반응은 볼 수 없습니다. 염료의 혈관 외 유출의 정량화는 원래이었다LY 파란색 염료 7-9으로 표시된 바와 같이 팽진 크기를 측정하여 얻을 수 있습니다. 또한 degranulated 비만 세포의 수는 반응 부위에서 피부 조직을 절개하고 7 톨루이딘 블루 염색에 의해 정량화 될 수있다. 비만 세포는 높은 친화도의 IgE 수용체 FcεRI를 발현 주요 지방 세포 집단 마찬가지로 비만 세포 탈과립은 종종 피부, IgE 매개 알레르기 반응을위한 마커로서 사용된다. 조직 염색에 넘쳐 분광 광도 측정을위한 기술은 1990 년 10 래트 및 마우스 (11)의 수동적 피부 아나필락시스 (PCA)를 위해 개발되었다.
다음 지역 아나필락시스 분석 프로토콜. 코지마 외에서 1을 적용하고, 알레르기 반응을 이끌어 내기위한 항원으로 닭 계란 난백 알부민 (OVA)를 사용 하였다. 그러나, 원한다면 이외 OVA 항원을 사용할 수있다. 분석은 다음 permeabilit 혈관의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용세포의 IgE 가교 및 히스타민의 방출을 비만으로 인해 발생하는 y를 입력합니다.
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Protocol
1 민감 마우스
- 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 1X PBS에 희석하여 OVA OVA 스톡 용액을 준비한다. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 cryovials 및 저장소에 분주을 동결.
- 실온으로 20 ㎎ / ㎖ OVA 스톡 하나 이상의 분취 량을 준비한다. 모자 5 ㎖ 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 1X PBS에 희석 OVA. 소용돌이 간략하게 혼합한다.
- : 1 비율 중속 설정 와류에 1 ㎎ / ㎖ OVA 함유 폴리스티렌 튜브 채 하나를 생성하기 위해 상기 튜브를 와동 계속하면서, 완전히 균질 Imject 명반 (40 ㎎ / ㎖)을 적하의 동량을 추가 면역원에 명반.
- 소용돌이에 튜브 및 테이프 튜브에 뚜껑을 놓습니다. 낮은 설정에 소용돌이를 켜고 OVA가 30 분 동안 졸업생을 흡수 할 수 있습니다.
- 시간 많은 양의 OVA / 졸업생을 준비하고 쥐를 민감 사이를 통과하는 것을 허용하지 마십시오. 과민 반응은 OVA / 졸업생 후에는 준비를 직접 완료 할 수없는 경우상온에서 이온, 저장 OVA / 명반. 사용하기 전에 1 분 동안 소용돌이.
- OVA / 졸업생 혼합물과 함께 1 ml의 인슐린 주사기를로드합니다. 27 게이지 바늘과 주사기를 씌우고.
- OVA의 50 μg 및 졸업생의 2 mg을 마우스 당 복용량 BALB / c 마우스의 복막에 OVA / 졸업생의 100 μl를 주입한다.
- 음성 대조군의 경우, PBS에 쥐의 또 다른 그룹을 민감. OVA를 생략, 위에 나열된와 동일한 방식으로 졸업생과 PBS의 1 : 1 혼합물 일을 준비합니다.
- 3 주사 총 삼주에 대한 일주일에 한 번 모든 마우스 (OVA와 PBS 제어) 민감. 최종 주입 한 후, 지역 아나필락시스 분석을 수행하기 전에 적어도 이주를 기다립니다.
2 지역 아나필락시스 분석
- 실내 온도 OVA 원액을 가져와. (: 1X PBS에 희석 OVA 4 1) 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에, PBS 5 ㎎ / ㎖의 최종 농도 20 ㎎ / ㎖ OVA 스톡을 희석한다. 소용돌이 간략하게 혼합한다.
- RC 2 <사용하여 마우스를 마취/ SUP> 설치류 마취 시스템 (또는 동등한 기화 전달 시스템). 이소 플루 란과 저수지를 채우고 O 2 공기 흐름을 켭니다. 유도 챔버에 넣어 마우스와는 마취를 시작하는 5 % 이소 플루 란 조절 다이얼을 조절합니다. 생쥐가 완전히 마취되면, 이동성의 부족에 의해 지시 깊은 마취를 유지하도록 3 % 이소 플루 란으로 제어 다이얼을 조정한다. 이 절차에서 마취의 목적은 동물을 고정화하는 것이다. 귀와 꼬리 정맥 주사는 동물에 심각한 통증이나 고통을 유발하지 않습니다.
참고 : 아이소 플루 란 인간의 생식 시스템에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 배기 가스를 중화 환기가 잘되는 방에서 사용하고 유도 챔버에 청소 통을 첨부해야합니다. 이소 플루 란을 사용하는 동안 임신 한 경우 노출을 최소화하기 위해 카본 필터 마스크를 착용하십시오. - 로드 31 G 바늘로 덮인 10.3 cc의 인슐린 주사기로 5 ㎎ / ㎖ OVA의 10 μL. 10 μL와 또 다른 10.3 cc의 인슐린 주사기를로드의 1X PBS.
- 해부 현미경을 사용하여, OVA의 50 μg의 도전 복용량 마취 마우스 오른쪽 귀에 OVA의 10 μl를 주입. 기타 용량은 같은 20 μg으로도 허용됩니다.
- 15 ML 원뿔 튜브 주위에 스카치 테이프 (접착면을 위로) 포장, 사출에 귀를 안정화합니다. 테이프에 오른쪽 손잡이의 등 쪽을 고정합니다. 귀의 두 잎 사이에 바늘 베벨 쪽을 삽입합니다. 천천히 모든 혈관을 칠 않도록주의하면서 귀 조직의 중심으로 OVA를 주입.
- 상술 한 바와 같은 방법을 사용하여, 음성 대조군으로서 왼쪽 귀에 10 ㎕의 PBS를 주입.
- 3 분을 기다립니다.
- 이 시간 동안, 저 지부에 마우스를 위치시키고 1 분 혈관을 팽창하기위한 열 램프 하에서 나 온수 욕에서 꼬리를 잡아.
- 천천히 꼬리 V로 0.5 % 에반스 블루 염료의 200 μl를 주입, 27 G 바늘로 덮인 1 ml의 인슐린 주사기를 사용하여마우스의 EIN. 전체 200 μL 전에 용기 구조를 파괴 할 수있다 급속 주사 투여된다. 이 경우, 꼬리의 반대측에 정맥에 염료의 잔량을 주입하도록 시도한다.
- 10 분을 기다립니다.
- 마우스를 안락사와 집게 및 수술 가위를 사용하여 두 귀를 제거합니다.
- 어떠한 압력이 귀 중심에 주사 부위에 적용되지 않는 것을 확인하고, 겸자와 귀의 가장자리를 잡아. 주변 절단함으로써 최대한 귀 조직을 제거 아니지만 통해 귀 연골 기지 존재 릿지. 모피의 소량 절제 귀 존재할 수있다; 이 분석에 영향을 미치지 않습니다.
- 나누어지는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 포름 아미드 700 μL. 귀 당 하나의 튜브 (마우스 당 두 개의 튜브)를 준비합니다.
참고 : 포름 아미드가, 기형 돌연변이, 및 자극이다. 장갑, 보안경 및 안면 보호구를 착용 할 것. 취급시 임산부는주의해야합니다의 포름 아미드가 태아 독성이 될 수 있습니다. - , 포름 아미드 튜브를 모자, 그리고 63 ° C로 설정 건열 화장실에서 하룻밤 배양 귀를 추가합니다. 귀는 여전히 배양 후에 약간 푸른 나타날 수 있습니다; 그러나 염료의 대부분 포름으로 추출한다.
- 96 웰 플레이트에, 중복, 각 샘플의 300 μl를 추가합니다. 이 샘플에 존재하는 경우 모피 전사 피한다. 우물에 존재하는 기포가 없는지 그들은 흡광도 판독에 영향을 미칠 것으로 확인합니다.
- 96 웰 플레이트에, 중복, 포름 아미드 300 μl를 추가합니다. 이 우물은 공백으로 사용됩니다.
- 620 nm에서 흡광도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 각 샘플 독서에서 빼기 포름 아미드 우물.
참고 : 모든 실험 군인 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.
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Representative Results
성공적으로 분석을 시행 한 동물 피부와 푸른 눈을 표시해야합니다. PBS 감응 동물 따라서 양쪽 귀에 흰색 (그림 1A) 남아 있어야, PBS 또는 OVA 도전 중 하나에 반응하지 않아야합니다. OVA 감작 동물, PBS 챌린지를 수신하는 귀 (왼쪽)이 완전히 흰색 또는 주사 부위에서의 국소 방식으로 가볍게 푸른 여야한다. OVA 도전을 받고 귀 (오른쪽) 염료 관리 (그림 1B) 후 10 분 동안 점진적으로 어두운 파란색이 될 것이다.
PBS 감응 동물은 PBS와 OVA 도전 (그림 2A) 모두 무시할 수 흡광도 측정을해야합니다. OVA 감작 동물을, PBS 주사는 일반적으로 0.13의 평균 흡광도 판독과 0.04의 표준 편차를 초래한다. 반대로, 0.58의 평균 흡광도 판독과 0.18의 표준 편차를 50 μg OVA 챌린지 결과 (FIgure 2B). 필요한 경우에 사용 OVA 챌린지의 양은 각각의 실험을 위해 조정될 수있다. 예를 들어, 0.30의 평균 흡광도와 0.10 (그림 2C)의 표준 편차의 20 μg의 OVA 도전 결과는 20 μg 이하 그러나 문제는 신뢰성있는 결과를 제공하지 않을 수 있습니다. OVA 농도의 변화는 최적화 사용하기 전에 확인해야합니다.
PBS의 흡광도 OVA 흡광도 비교로 결과를 그래픽으로 페어링을 할 수 있습니다. 대안 적으로, 결과는 각 동물에 대한 OVA 흡광도로부터 감산 PBS 흡광도와, 단일 값으로 나타내 어질 수있다.
그림 1 : PBS 및 OVA 감작 된 동물의 귀 색소 침착. (A). PBS에 이어 색소 침착은 동물을 증감. 오와 도전 (PBS와 도전) 왼쪽 귀와 오른쪽 귀 (0 μg OVA)가 더 염료 넘쳐 거의 보여줍니다. (B). OVA 감작 된 동물의 귀 색소 침착. 파란색 염료의 혈관 외 유출의 부재로 표시된 바와 같이 (PBS와 도전) 왼쪽 귀에는 알레르기 반응이 없다. (50 μg OVA와 도전) 오른쪽 귀는 증가 된 혈관 투과성, 귀 조직에서 세포 활성화의 직접적인 결과를 나타내는 밝은 파란색 색상을 보여줍니다.
그림 2 : OVA 감작 된 동물 용 대표 OD 값을 620 nm에서 찍은 분광 광도 측정에서 파생 된 OD 값 (A)... PBS 감응 동물에서 50 μg OVA 도전. 모두 PBS 및 OVA의 반칙으로 OD 값은 무시할 수 있습니다. (B). OVA 감작 된 동물에서 50 μg OVA 도전. OD 값의 PBS 도전 결과 <0.2 OVA 도전 resuOD 값에서 LTS> 0.3. (C). 20 μg OVA 도전. OD 값의 PBS 도전 결과 <0.2. 오른쪽 귀는 약간 사용 OVA의 작은 도전의 투여에 의한 OD 값을 감소시켰다.
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Discussion
알레르기 질환의 많은 마커기도 도전의 설정에서 기관지 유체에 순환 히스타민의 Th2 사이토 카인의 생산, 세포 모집의 수준의 변화를 포함하여 알레르기 항원의 반칙으로 알레르기 반응의 강도를 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 매개 변수에 변화를 모니터링하는 알레르기 반응을 연구하는 것도 중요하지만, 생물학적 마커는 항상 임상 알레르기 질환과 상관 관계가 없습니다. 이 프로토콜에 설명 된 지역 아나필락시스 분석은 현지화 된 알레르기 질환에 대한 상관 관계를 지역화 된 혈관 투과성의 재생 가능한 측정을 제공합니다. 파란색 염료의 혈관 외 유출을 사용하여,이 프로토콜은 시각화 및 지역화 알레르기 반응의 상대 정량을 모두 할 수 있습니다. 임상 스코어링에 의존 알레르기 분석법 달리 (분광 광도계로 측정 한 흡광도 청색 염료 넘쳐)이 분석의 일차 결과 쉽게 관찰자 편의를 실시하지 않는다. 또 다른 ADVAntage 동물이 잠재적으로 알레르기 항원의 도전과 염료 관리로 인한 불편을 제한, 곧 공격 후 안락사된다는 것입니다. 아키야마 외. (10)에 의해 설명 된 휴대용 분광 광도계의 사용 대안은 혈관 투과성의 변화의 연속 측정을 허용한다. 그러나 에반스 블루 염료는 독성 및 주입은 궁극적으로 동물이 안락사 할 필요가 이어질 것입니다.
이 분석은 장점을 가지고 있지만, 어느 정도 기술적 인 도전의 한계를 가지고있다. 신뢰할 수있는 결과는 일관되고 성공적인 귀와 꼬리 정맥 주사에 의존한다. 전체 도전 도즈가 귀에 투여되지 않으면 에반스 블루 정맥 주사가 완료되지 않은 경우, 혈관의 명백한 천자 귀 주입의 결과는, 또는, 동물은 분석에서 제외해야하는지 여부. 우리 연구실에서 연구자들은 세비에 대한 피내 귀 주사를 연습해야했다능력을 개발하기 전에 RAL 주. 또한,이 분석을위한 적절한 제어를 실행하는 것이 중요하다. 동물 바늘 삽입으로 인한 손상에 약간 다르게 반응하는 것 구체적으로, PBS 주입은 정기적으로 내부 대조군으로 사용되어야한다. PBS 독서는 분사 자체에 의해 유도 된 혈관 투과성의 변화에 대한 기준선 측정을 제공합니다. 귀에 피내 주사를 사용하는 대신에, 분석은 또한 마우스의 뒤쪽 피부에 도포 될 수있다. 조사자는 또한, 동시에 여러 항원 테스트를 허용,이 경로는 덜 기술적으로 어려운 것으로 발견하고있다.
도전 도즈가 실험에 따라 조작 될 수있는 로컬 아나필락시스 분석은, 매우 다재다능하다. 이 알레르기 반응의 변화를보고 할 필요가있는 경우, 이러한 20 μg 같은 저급 OVA 챌린지 도즈를 사용하는 것이 유리할 수있다. 이 같은 흡광도 변화를 모니터링의 감도를 증가 수 있습니다그것은 세포 활성화에 대한 포화 점에 도달 될 것임을 거의 없을 것이다.
또한,이 분석은 수동적 피부 아나필락시스 (PCA)를 연구하기 위해 사용될 수있다. 이 설정에서, 항원 특이 IgE은 다른에 한쪽 귀를 차량에 주입된다. 24 시간 후, 동물 항원 에반스 블루 염료의 정맥 도전을 주어집니다. PCA 모델은 실험 동물의 사용 개수를 완료하는 데 걸리는 시간을 단축하고, 연구자들은 IgE의 가교 결합의 특정 효과를 볼 수 있도록 할 수있다.
이상을 복용 수행에도 불구하고,이 문서에 설명 된 활성 피부 아나필락시스 (ACA) 모델을 사용하는 몇 가지 이점이 있습니다. 과민성은 보통 전신이고 사람들은 일반적으로 순환 알레르겐 - 특이 IgE 및 IgG를 모두 가지고 주간 노출되면 과민 반응은 모방 개인에게 알레르기 질환을 개발하는 과정을 항원. IgE의 가교는 MA의 기본 수단이지만성 세포 탈과립, 비만 세포는 또한 IgG의 가교 반응한다. 연구자 만의 IgE가 매개 질환 외에도 알러지 반응의 메커니즘을 조사하기 때문에, ACA 모델을 허용한다. 사용 감작 방법은 연구자의 판단 동안 결론적으로, 로컬 아나필락시스 분석은 다목적이고 감작 다양한 방법론 함께 사용될 수있다.
귀 부종, 알레르기 반응을 평가하기위한 일반적으로 사용되는 마커는 또한 OVA의 공격 후 측정 할 수있다. 우리는 OVA로 도전 귀를 1 시간 후 분사에 PBS와 도전 귀보다 훨씬 더 붓기가 있음을 발견 하였다. 에반스 블루 시험 대조적으로, 우리는 측정이 넘쳐 염료 및 측정 장치를 사용할 때 귀 두께 귀의 압축에 의해 변경 될 수 있기 때문에 연구자들 사이에 큰 변동을 나타내고보다 덜 민감하다 그 귀 두께를 관찰했다.
마우스가 아닌 다른 균주BALB / C는 로컬 아나필락시스 분석에 사용될 수있다; 그러나 흡광도 판독에 사용되는 균주에 따라 다소 차이가 있습니다. 강한은 Th2 반응을 개발하기 위해 자신의 성향 때문에, BALB / c 마우스는 일반적으로이 분석과 신뢰성, 재현성 측정을 생산하고 있습니다.
이 분석은 다양한 항원에 감작 동물에서 국소 알레르기 반응의 정량을 허용한다. 분석은 성공적으로 OVA와 키홀 삿갓 조개 헤 모시 아닌 (KLH)과 같은 일반적인 알레르겐, 수행 된 항원으로서 선택은, 유연하다. 또한, 감작 대신에, 로컬 알레르기 반응은 항체를 주입함으로써 순진한 동물에서 유도 할 수 호염기구와 비만 세포에 가교 IgE 항체 또는 IgE의 수용체 또는 CD200R3 한 이들 세포에 비 - 면역 글로불린 활성화 수용체를 결찰에 의하여 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
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- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
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