Summary
Аллергические реакции, характеризующиеся активации тучных клеток и базофилов, приводятся в действие сшивания IgE и выпуска провоспалительных медиаторов. Количественная оценка аллергических реакций может быть достигнуто с помощью Эванс синий краситель для мониторинга изменений в проницаемости сосудов после аллергена.
Abstract
Аллергические реакции являются результатом активации тучных клеток и базофилов, и последующее высвобождение вазоактивных и провоспалительных медиаторов. Воздействие на аллерген в сенсибилизированного лица может привести к клинической симптоматики, которые варьируются от незначительной эритемы, чтобы угрожающих жизни анафилаксии. В лаборатории, различные животные модели были разработаны для понимания механизмов вождения аллергические реакции. Здесь мы опишем подробно метод для измерения изменений в проницаемости сосудов количественно локализованные аллергические реакции. Местный анафилаксии анализ впервые сообщалось в 1920, и была адаптирована от техники, опубликованной Кодзима соавт. в 2007 году 1. В этом анализе, мыши, чувствительным к OVA оспариваются в левом ухе с автомобиля и в правом ухе с OVA. За этим следует внутривенной инъекции синий краситель Эванса. Десять мин после инъекции Evans Blue, животное забивали и краситель, который вырожденными вк ушам добывается на ночь в формамидом. Поглощение извлеченного красителя затем количественно с помощью спектрофотометра. Этот метод надежно приводит к визуальной и количественной проявление местной аллергической реакции.
Introduction
Тип I гиперчувствительности опосредовано антиген-индуцированного сшивки IgE на поверхности тучных клеток и базофилов. Это приводит к клеточной дегрануляции и освобождение вазоактивных и провоспалительных медиаторов, таких как гистамин, триптазы, и фактор активации тромбоцитов 2. После выпуска предварительно сформированных посредников во дегрануляции, тучные клетки синтезируют и отпустите простагландины и лейкотриены, которые в дальнейшем увеличить проницаемость сосудов 3. Начальное клинический ответ происходит быстро и упоминается как "немедленной реакции". В коже, ответ волдыри-и-вспышка хорошо видна в течение нескольких минут антигена. В зависимости от дозы вызов, можно наблюдать "поздно фазовую" несколько час спустя. Поздно фаза отек обусловлен локализованной отека и найма лейкоцитов в ткани 2. Гистамин, как правило, считается основным медиатором участие вНепосредственные аллергические реакции, действует на рецептором гистамина 1 (HR1) выразил на судах и рецептором гистамина 2 (HR2) выразил на гладкие мышцы. Комбинированный эффект увеличивает приток крови и проницаемость сосудов в участке воспаления 4.
Разнообразие моделей животных аллергии были разработаны с целью изучения механизмов, участвующих в аллергическом воспалении, в том числе моделей аллергической астмы, системной анафилаксии и местных анафилаксии. Администрация внутривенного краситель был использован для измерения локализованных аллергические реакции на животных моделях в течение почти столетия, с публикации описания этого технику, датируется 1920-х годов 5. Кролики и морские свинки были первые модели животного происхождения, используемые для тестирования реакции гиперчувствительности немедленного и наиболее чувствительные Ответы, как правило найти в ухо 5,6. Анализ впоследствии подтверждена для использования в крыс и мышей 7 8.
Исторически сложилось так,Различные экспериментальные методы были использованы, в том числе инъекции антигена перед инъекцией красителя, красителя инъекции до инъекции антигена, и одновременного введения красителя и антигена. Внутривенное введение краситель в качестве средства для измерения аллергические реакции является универсальным для анализа, как он может быть использован для измерения активный, пассивный, и обратный пассивные реакции 5,9. Многочисленные красители были использованы для оценки аллергические реакции, в том числе трипановым синим, пентамина голубой, Evans Blue, ГЕЙГИ Голубой 536, и тушь 5,6,9. Раствор 0,5% Evans Blue, в настоящее время стандарт краситель используется для измерения аллергических реакций в коже.
Анафилактический ответ на вызов преходяще; Максимальная интенсивность достигается в течение 10 - 15 мин после инъекции красителя, и никакой реакции не видно, если краситель вводят больше чем 30 минут после вызова, независимо от вида животного, используемых 9. Количественная оценка экстравазации красителя был оригиналенлы получают путем измерения волдырь размер, как указано синего красителя 7-9. Кроме того, на счету дегранулированных тучных клеток может быть определена количественно путем вырезания кожной ткани от места реакции и окрашивания толуидиновым синим 7. Мачты дегрануляции клеток часто используется в качестве маркера для кожного, IgE-опосредованные аллергические реакции, как тучные клетки являются основным местным населением клетки, экспрессирующей высокое сродство рецептора IgE FcεRI. Спектрофотометрические методы измерения красителя экстравазацию в ткань были разработаны для пассивных кожной анафилаксии (СПС) у крыс 10 и мыши 11 в 1990-х годах.
Следующий протокол местной анафилаксии анализ был адаптирован из Kojima соавт. 1, и использует куриные яйца яичный альбумин (OVA) в качестве антигена для выявления аллергических реакций. Тем не менее, другие, чем OVA антигены могут быть использованы, если это необходимо. Анализ затем использует синий краситель Эванса отслеживать изменения в сосудистой permeabilitу, что происходит в связи с тучных клеток IgE сшивание и высвобождение гистамина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. привлечь внимание Мыши
- Подготовка исходного раствора OVA OVA путем разбавления в 1х PBS до конечной концентрации 20 мг / мл. Замораживание вниз аликвоты в криопробирки и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.
- Доведите один или несколько аликвот 20 мг / мл OVA складе до комнатной температуры. Развести OVA в 1х PBS до конечной концентрации 1 мг / мл в 5 мл полистирола с круглым дном трубки с крышкой. Кратко Vortex перемешать.
- Удерживая полистирола трубки, содержащей 1 мг / мл OVA на вихрь, установленного на средней скорости, добавить равный объем тщательно гомогенизировали Imject Alum (40 мг / мл) по каплям при продолжении вихрь трубку, чтобы произвести 1: 1 соотношение квасцы в иммуногену.
- Поместите крышку на трубки и ленты трубки вихря. Включите вихрь на минимальное значение и позволяют OVA адсорбироваться на алюминиевых квасцов в течение 30 мин.
- Не допускать большое количество времени, чтобы пройти между подготовки OVA / алюминиевыми квасцами и сенсибилизации мышей. Если сенсибилизация не может быть завершена сразу после OVA / Alum подготовка трионный, магазин OVA / квасцы при комнатной температуре. Vortex в течение 1 мин перед использованием.
- Загрузите 1 мл инсулиновый шприц с OVA / Alum смеси. Закрывают шприц с 27 иглы.
- Введите 100 мкл OVA / квасцов в брюшину линии BALB / C мышей при дозе на мышь 50 мкг OVA и 2 мг квасцов.
- Для отрицательного контроля, внимания другую группу мышей в PBS. Подготовка 1: 1 смесь алюминиевыми квасцами и PBS в таким же образом, как указано выше, опуская OVA.
- Внимание всех мышей (OVA и PBS управления) один раз в неделю в течение 3 недель в общей сложности 3 инъекции. После последней инъекции, ждать по крайней мере за 2 недели до проведения местного анафилаксии анализа.
2 Часовой Анафилаксия Анализ
- Доведите OVA маточного раствора до комнатной температуры. В 1,5 мл микроцентрифужных трубки, разбавленной 20 мг / мл OVA запас до конечной концентрации 5 мг / мл с PBS (1: 4 разбавление OVA в 1X PBS). Кратко Vortex перемешать.
- Обезболить мышей, используя RC 2 </ SUP> грызунов Анестезия система (или сравнимы испаряется система доставки). Заполните резервуар изофлураном, и включите O 2 воздуха. Место мышей в индукции камеры и настроить ИФ диск управления до 5%, чтобы инициировать обезболивания. После того, как мыши полностью под наркозом, указывает отсутствие мобильности, настроить ИФ диск управления до 3%, чтобы поддерживать глубокую обезболивания. Цель анестезии в этой процедуре для иммобилизации животных. Уха и хвост вены инъекции не вызывают сильную боль или страдания животному.
ПРИМЕЧАНИЕ: Isoflurane может оказать негативное воздействие на репродуктивную систему человека. Обязательно используйте в хорошо проветриваемом помещении и приложите поглощать канистру с индукционной камеры для нейтрализации отработанных газов. Если вы беременны, используя изофлуран, носить маску угольного фильтра, чтобы свести к минимуму воздействие. - Нагрузка 10 мкл 5 мг / мл OVA в 3/10 см инсулиновый шприц колпачком с иглой 31 G. Загрузить другой 3/10 куб.см инсулиновый шприц с 10 мклиз 1x PBS.
- Использование рассекает микроскоп, привнести 10 мкл OVA в правое ухо наркозом мыши для вызова дозе 50 мкг OVA. Другие дозы, такие как 20 мкг, также являются приемлемыми.
- Для стабилизации ухо для инъекций, обернуть скотчем (липкой стороной вверх) вокруг 15 мл коническую трубку. Закрепите спинной стороны правого уха к ленте. Вставьте иглу конической стороной вверх между двумя листьями уха. Медленно введите OVA в центр ушной ткани, заботясь, чтобы не ударить любого кровеносные сосуды.
- Используя ту же самую методику, описанную выше, вводят 10 мкл PBS в левое ухо в качестве отрицательного контроля.
- Подождите 3 мин.
- В течение этого времени, поместите курсор в фиксатор и удерживайте хвост под инфракрасной лампой или в теплой ванне воды в течение 1 мин, чтобы расширить кровеносные сосуды.
- Использование 1 мл инсулиновый шприц колпачком с иглой 27 G, медленно вдохнуть 200 мкл 0,5% синего красителя Эванса в хвостовую противЭйн мыши. Быстрое введение может разрушить структуру сосудов до целых 200 мкл вводят. Если это происходит, попытка ввести оставшиеся объем красителя в вену на противоположной стороне хвоста.
- Подождите 10 минут.
- Усыпить мыши и удалить оба уха, используя щипцы и хирургические ножницы.
- Захват края уха щипцами, чтобы убедиться, что давление не применяется в месте инъекции в центре уха. Удалить столько ушной ткани, как это возможно за счет сокращения близко к, но не до конца, гребень настоящее хряща у основания уха. Небольшие количества меха могут присутствовать на вырезанной уха; это не повлияет на анализ.
- Алиготе 700 мкл формамида в 1,5 мл микропробирок. Подготовьте одну трубку за ухо (две трубки на мышь).
ПРИМЕЧАНИЕ: Формамид является тератогенным, мутагенным, и раздражителем. Носите защитные перчатки, очки и маску. Беременные женщины должны соблюдать осторожность при обращении сс формамид может быть эмбриотоксическое. - Добавить уши формамида, крышка трубы, и инкубировать в течение ночи в сухом тепла бане до 63 ° C. Уши могут появляться слегка синий после инкубации; Однако большинство красителя будут извлечены в формамиде.
- Добавить 300 мкл каждого образца в двух экземплярах, в 96-луночный планшет. Избежать переноса мех, если он присутствует в образце. Убедитесь, что нет никаких пузырьки, присутствующие в скважинах, так как они влияют на чтение абсорбции.
- Добавить 300 мкл формамида, в двух экземплярах, в 96-луночный планшет. Эти скважины будут использоваться в качестве заготовок.
- С помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности при 620 нм. Вычитание формамидные скважин от каждого чтения образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились под протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использованию силовых структур университета по.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Животные, которые успешно прошли на анализ будет иметь кожу и глаза, которые появляются синие. PBS сенсибилизированных животных не должны реагировать на любой PBS или OVA вызов, поэтому оба уха должна оставаться белой (1А). В OVA сенсибилизированных животных, ухо приема вызов PBS (слева) должна быть либо полностью белый или слегка синий в локализованной образом в месте инъекции. Ухо получения вызов OVA (справа) должна постепенно становятся темнее синего в течение 10 мин после приема красителя (Рисунок 1В).
PBS сенсибилизированных животных будет иметь незначительные оптической плотности как для PBS и OVA вызов (Рисунок 2A). Для OVA сенсибилизированных животных, PBS инъекции обычно приводит к средней абсорбции чтении 0,13 и стандартным отклонением 0,04. И наоборот, в 50 мкг OVA вызов приводит к средней абсорбции чтении 0,58 и стандартным отклонением 0,18 (Fiфигура 2В). Количество OVA используется для вызова могут быть приспособлены для отдельных экспериментов, если это необходимо. Например, 20 мкг OVA вызов приводит к средней оптической плотности 0,30 и стандартным отклонением 0,10 (фиг.2С), однако проблемой менее 20 мкг не могут давать надежные результаты. Изменения в концентрации OVA должны быть оптимизированы и проверены перед использованием.
Результаты могут быть графически в паре, с PBS поглощения по сравнению с OVA поглощения. Кроме того, результаты могут быть нанесены в виде одного значения, при этом оптическая плотность PBS вычитается из оптической плотности OVA для каждого отдельного животного.
Рисунок 1: Ухо пигментация в PBS и OVA сенсибилизированных животных. (А). Ухо пигментация в PBS сенсибилизированных животных. Левое ухо (вызов с PBS) и правое ухо (заражали 50 мкг OVA) показывают, практически не экстравазации красителя. (В). Ухо пигментация в OVA сенсибилизированных животных. Там нет аллергической реакции в левое ухо (заражали PBS), как показано на отсутствие экстравазации синий краситель. Правое ухо (вызов с 50 мкг OVA) показывает ярко-синий окраску, указывающую повышенной проницаемостью сосудов, является прямым результатом активации клеток в слуховом ткани.
Рисунок 2: Типичные значения ОП для OVA сенсибилизированных животных OD ценности, вытекающие из спектрофотометрических измерений при 620 нм (А)... 50 мкг OVA проблемой в PBS, чувствительным животных. OD значения для обоих PBS и OVA вызов можно пренебречь. (В). 50 мкг OVA проблемой в OVA сенсибилизированных животных. PBS вызов приводит значения ОП <0,2 и OVA задача RESULTS в значений ОП> 0,3. (C). 20 мкг OVA проблемой. PBS вызов приводит значения ОП <0,2. Правильные уши слегка уменьшается значения ОП в связи с меньшим вызов дозы OVA используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многочисленные маркеры аллергических заболеваний используются для оценки силы аллергических реакций следующих аллергена, включая изменения в уровнях циркулирующего гистамина, Th2 продукции цитокинов, а также набора клеток в бронхоальвеолярном жидкости в проточных частях вызов дыхательных путей. В процессе мониторинга изменений в параметры важны для изучения аллергических реакций, биологические маркеры не всегда коррелируют с клинической аллергических заболеваний. Местный анафилаксии анализа, описанного в этом протоколе предоставляет воспроизводимую измерение локализованной проницаемости сосудов как коррелят локализованного аллергических заболеваний. Используя экстравазацию синий краситель, этот протокол позволяет как визуализация и относительную количественную оценку локализованной аллергической реакции. В отличие от аллергии анализов, которые полагаются на клинической скоринга, основной результат этого анализа (экстравазации голубого красителя, измеренная спектрофотометрическим поглощения) не легко подвергается смещения наблюдателя. Другой продвинутыйntage является то, что животные подвергаются эвтаназии вскоре после заражения, ограничивая никакого дискомфорта потенциально вызванного вызов аллергена и администрации красителя. Альтернативное использование ручного спектрофотометра, описанной Akiyama и др. 10 дает возможность непрерывного измерения изменений в проницаемости сосудов. Тем не менее, синий краситель Эванса является токсичным, и инъекции, в конечном счете привести к животное необходимости быть умерщвлены.
В то время как этот анализ имеет ряд сильных сторон, у него есть ограничение, хотя и несколько технически сложным. Надежные результаты зависят от последовательных и успешных уха и хвост вены инъекций. Если весь доза задача не вводили в ухо, если результаты впрыска уха в явной пункции кровеносного сосуда, или если синий Эванс внутривенной инъекции не завершена, то животное должны быть исключены из анализа. В нашей лаборатории, исследователи должны были практиковать внутрикожные инъекции уха для SeveRAL недель до развития знания. Кроме того, важно, чтобы запустить соответствующие элементы управления для анализа. В частности, инъекции PBS, обычно следует использовать в качестве внутреннего контроля, а животные-видимому, реагируют несколько иначе, чтобы повреждений, вызванных введением иглы. Чтение PBS, дает исходного показателя для изменений в сосудистой проницаемости, вызванные самой инъекции. Вместо использования внутрикожных инъекций уха, анализ также может быть применено к задней кожи мышей. Исследователи могут найти этот маршрут, чтобы быть меньше, технически сложной задачей, и, кроме того, это позволяет проводить тестирование нескольких антигенов одновременно.
Местный анафилаксии анализ является чрезвычайно универсальным, поскольку доза проблемой можно манипулировать в зависимости от эксперимента. Если это необходимо обратить внимание на изменения в аллергических реакций, может быть выгодно использовать более низкую дозу вызов OVA, такие как 20 мкг. Это позволяет увеличить чувствительность для мониторинга изменений оптической плотности, какон будет менее вероятно, что точка насыщения для активации клеток будет достигнута.
Кроме того, этот анализ может быть использован для изучения пассивной кожной анафилаксии (РСА). В этих условиях, антиген-специфичный IgE вводится в одно ухо и автомобиля в другой. 24 час спустя, животное дается внутривенного вызов антигена и синего красителя Эванса. Модель PCA может уменьшить время, необходимое для завершения эксперимента, количество животных, используемых, и позволяют следователи смотреть на специфических эффектов IgE сшивания.
Несмотря занимает больше времени для выполнения, есть некоторые преимущества в использовании активного кожной анафилаксии (ACA) модели, описанной в этой статье. Сенсибилизация через еженедельной воздействия антигена имитирует процесс, посредством которого люди развивают аллергические заболевания, как сенсибилизация, как правило, системный и люди, как правило, как аллергенспецифический IgE и IgG в обращении. В то время как IgE сшивание является основным средством маул клеток дегрануляция, тучные клетки также реагируют на IgG сшивания. Таким образом, модель ACA позволяет исследователям изучить механизмы аллергических реакций в дополнение к только IgE-опосредованной болезни. В заключение, в то время как метод сенсибилизации используется по усмотрению исследователя, местный анафилаксии анализ является универсальным и может быть использован с различными сенсибилизации методик.
Ухо опухоль, обычно используемый маркер для оценки аллергические реакции, также может быть измерено после того, как вызов OVA. Мы обнаружили, что уши возможностями с OVA, имеют значительно больше, чем отек уха, зараженных PBS после инъекции в 1 час. В отличие от теста голубого Эванса, мы обнаружили, что толщину уха измерения менее чувствительны, чем краситель экстравазации и обладают большей изменчивости между исследователями, как толщина уха может быть изменена путем сжатия уха при использовании измерительных приборов.
Мышь напрягает кромеМыши линии BALB / C, может быть использован для местного анафилаксии анализа; Однако считывание абсорбции будет отличаться в зависимости от используемого штамма. Из их склонность к развитию сильные реакции Th2, BALB / с мышей обычно производят надежные, воспроизводимые показания с этого анализа.
Этот анализ дает возможность количественной оценки локализованных аллергических реакций у животных, чувствительным к различным антигенам. Выбор антигена является гибким, а тест был успешно выполнен с аллергенов, таких как OVA и гемоцианин лимфы улитки (KLH). Кроме того, вместо сенсибилизации, местные аллергические реакции могут быть выявлены в наивным животного путем введения антител, которые кросс-ссылками IgE или IgE рецепторов на базофилов и тучных клеток или путем лигирования не-IgE рецепторы активации этих клеток, таких как CD200R3 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z.
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
