Summary
मस्तूल कोशिकाओं और basophils के सक्रियण द्वारा विशेषता एलर्जी प्रतिक्रियाओं, आईजीई के पार से जोड़ने और proinflammatory मध्यस्थों की रिहाई से प्रेरित हैं. एलर्जी प्रतिक्रियाओं का एक मात्रात्मक आकलन allergen चुनौती के बाद संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इवांस नीले डाई का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.
Abstract
एलर्जी प्रतिक्रियाओं मस्तूल कोशिकाओं और basophils, और vasoactive और proinflammatory मध्यस्थों के बाद रिलीज की सक्रियता का परिणाम है. एक अवगत व्यक्ति में एक allergen के संपर्क में मामूली पर्विल से जीवन धमकी तीव्रग्राहिता के लिए अलग अलग है कि नैदानिक लक्षणों में परिणाम कर सकते हैं. प्रयोगशाला में, विभिन्न पशु मॉडल एलर्जी प्रतिक्रियाओं ड्राइविंग तंत्र को समझने के लिए विकसित किया गया है. इस के साथ साथ, हम स्थानीय एलर्जी प्रतिक्रियाओं यों संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन को मापने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन. स्थानीय तीव्रग्राहिता परख पहले 1920 के दशक में सूचना मिली थी, और कोजिमा एट अल द्वारा प्रकाशित तकनीक से अनुकूलित किया गया है. 2007 में 1. इस परख में, ओवीए को अवगत चूहों वाहन के साथ बाएं कान में और ओवीए साथ सही कान में चुनौती दी है. इस इवांस नीले रंग की एक अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा पीछा किया जाता है. दस मिनट इवांस ब्लू इंजेक्शन लगाने के बाद, पशु में extravasated गया है कि डाई euthanized और हैकानों में formamide में रात भर निकाला जाता है. निकाले डाई के absorbance तो एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ मात्रा निर्धारित है. इस विधि मज़बूती से एक स्थानीय एलर्जी की प्रतिक्रिया का एक दृश्य और quantifiable अभिव्यक्ति में यह परिणाम है.
Introduction
प्रकार मैं अतिसंवेदनशीलता मस्तूल कोशिकाओं और basophils की सतह पर आईजीई के प्रतिजन प्रेरित पार से जोड़ने द्वारा मध्यस्थता है. इस सेलुलर degranulation और ऐसे हिस्टामिन, tryptase, और प्लेटलेट सक्रिय कारक के रूप में 2 vasoactive और proinflammatory मध्यस्थों के रिलीज में यह परिणाम है. Degranulation दौरान preformed मध्यस्थों के रिलीज के बाद, मस्तूल कोशिकाओं synthesize और आगे संवहनी पारगम्यता 3 में वृद्धि, जो prostaglandins और leukotrienes जारी. प्रारंभिक नैदानिक प्रतिक्रिया तेजी से होता है और एक "तत्काल प्रतिक्रिया 'के रूप में जाना जाता है. त्वचा में, एक खान व भड़क प्रतिक्रिया प्रतिजन चुनौती के मिनट के भीतर आसानी से दिख रहा है. चुनौती की खुराक पर निर्भर करता है, यह एक "देर चरण प्रतिक्रिया" कुछ घंटे बाद निरीक्षण करने के लिए संभव है. देर चरण सूजन के ऊतकों 2 में स्थानीयकृत शोफ और ल्युकोसैट भर्ती की वजह से है. Histamine, आम तौर पर में भाग लेने के प्रमुख मध्यस्थ मानातत्काल एलर्जी प्रतिक्रियाओं, 1 (HR1) जहाजों और हिस्टामिन रिसेप्टर 2 (HR2) चिकनी पेशी पर व्यक्त की पर व्यक्त हिस्टामिन रिसेप्टर पर कार्य करता है. संयुक्त प्रभाव सूजन 4 के स्थल पर रक्त प्रवाह और संवहनी पारगम्यता बढ़ जाती है.
एलर्जी के पशु मॉडल की एक किस्म एलर्जी अस्थमा, प्रणालीगत तीव्रग्राहिता, और स्थानीय तीव्रग्राहिता की मॉडल सहित एलर्जी सूजन में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के क्रम में विकसित किया गया है. अंतःशिरा डाई प्रशासन प्रकाशनों 1920 के दशक से 5 वापस इस तकनीक डेटिंग का वर्णन के साथ, लगभग एक सदी के लिए पशु मॉडल में स्थानीयकृत एलर्जी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. खरगोश और गिनी सूअरों तत्काल अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल पहली पशु मॉडल थे, और सबसे संवेदनशील प्रतिक्रियाएं आम तौर पर कान 5,6 में पाए गए. परख बाद में चूहों 7 और चूहों 8 में उपयोग के लिए मान्य किया गया था.
ऐतिहासिक दृष्टि से,प्रयोगात्मक विधियों की एक किस्म पूर्व डाई का इंजेक्शन, डाई का इंजेक्शन से पहले प्रतिजन के इंजेक्शन के लिए प्रतिजन इंजेक्शन, और डाई और प्रतिजन के एक साथ इंजेक्शन सहित इस्तेमाल किया गया है. एलर्जी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए एक साधन के रूप में अंतःशिरा डाई प्रशासन यह निष्क्रिय, सक्रिय मापने के लिए इस्तेमाल किया, और निष्क्रिय प्रतिक्रियाओं 5,9 रिवर्स किया जा सकता है के रूप में एक बहुमुखी परख है. कई रंगों Trypan ब्लू, Pontamine स्काई ब्लू, इवांस ब्लू, Geigy ब्लू 536, और भारत स्याही 5,6,9 सहित एलर्जी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है. 0.5% इवांस नीले रंग का एक समाधान वर्तमान में त्वचा में एलर्जी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल मानक डाई है.
चुनौती के लिए anaphylactic प्रतिक्रिया क्षणिक है; अधिकतम तीव्रता 10 के भीतर पहुँच जाता है - डाई इंजेक्शन के 15 मिनट, और डाई की परवाह किए बिना 9 इस्तेमाल किया जानवरों की प्रजातियों की चुनौती के बाद 30 से अधिक मिनट दिलाई है अगर कोई प्रतिक्रिया दिखाई है. डाई तरल पदार्थ का स्त्राव की मात्रा मूल थाly नीले डाई 7-9 से संकेत के रूप में खान आकार को मापने के द्वारा प्राप्त की. साथ ही, degranulated मस्तूल कोशिकाओं की गिनती प्रतिक्रिया की साइट से त्वचा ऊतक excising और 7 नीले toluidine साथ धुंधला द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. मस्तूल कोशिकाओं उच्च आत्मीयता IgE रिसेप्टर FcεRI व्यक्त मुख्य स्थानीय सेल की आबादी के रूप में मस्तूल सेल degranulation अक्सर, त्वचीय, IgE मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. ऊतक में डाई तरल पदार्थ का स्त्राव को मापने के लिए Spectrophotometric तकनीक 1990 में चूहे 10 और माउस 11 में निष्क्रिय त्वचीय तीव्रग्राहिता (पीसीए) के लिए विकसित किए गए.
निम्नलिखित स्थानीय तीव्रग्राहिता परख प्रोटोकॉल. कोजिमा एट अल से 1 अनुकूलित, और एलर्जी प्रतिक्रियाओं को जानने के लिए प्रतिजन के रूप में चिकन अंडे ovalbumin (OVA) का इस्तेमाल किया गया था. अगर वांछित हालांकि, ओवीए अलावा अन्य एंटीजन इस्तेमाल किया जा सकता है. परख तो नाड़ी permeabilit में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इवांस नीले डाई का उपयोग करता हैसेल आईजीई पार से जोड़ने और histamine रिलीज मस्तूल की वजह से होती है कि वाई.
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Protocol
1 संवेदनशील चूहे
- 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पीबीएस में ओवीए गिराए द्वारा एक ओवीए शेयर समाधान तैयार है. भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर cryovials और दुकान में aliquots नीचे रुक.
- कमरे के तापमान को 20 मिलीग्राम / एमएल ओवीए स्टॉक में से एक या अधिक aliquots लाओ. एक टोपी के साथ एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब में 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पीबीएस में ओवीए पतला. भंवर संक्षिप्त मिश्रण करने के लिए.
- 1 अनुपात: मध्यम गति पर सेट एक भंवर पर 1 मिलीग्राम / एमएल ओवीए युक्त polystyrene ट्यूब धारण करते हुए एक 1 निर्माण करने के लिए ट्यूब भंवर जारी रखते हुए अच्छी तरह से homogenized Imject फिटकिरी (40 मिलीग्राम / एमएल) dropwise के एक बराबर मात्रा जोड़ने immunogen को फिटकिरी.
- भंवर ट्यूब और टेप ट्यूब पर टोपी रखें. सबसे कम सेटिंग पर भंवर मुड़ें और ओवीए 30 मिनट के लिए फिटकिरी को सोखना के लिए अनुमति देते हैं.
- समय की एक बड़ी राशि ओवीए / फिटकिरी की तैयारी और चूहों को संवेदनशील के बीच पारित करने की अनुमति न दें. संवेदीकरण ओवीए / फिटकिरी preparat के बाद सीधे पूरा नहीं किया जा सकता है, तोकमरे के तापमान पर आयन, दुकान ओवीए / फिटकिरी. उपयोग करने से पहले 1 मिनट के लिए भंवर.
- ओवीए / फिटकिरी मिश्रण के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज लोड. 27 गेज सुई के साथ सिरिंज टोपी.
- ओवीए के 50 माइक्रोग्राम और फिटकिरी के 2 मिलीग्राम के माउस प्रति एक खुराक के लिए BALB / ग चूहों की पेरिटोनियम में ओवीए / फिटकिरी के 100 μl इंजेक्षन.
- एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, पीबीएस के लिए चूहों के एक और समूह को संवेदनशील. ओवीए को छोड़ते हुए, ऊपर सूचीबद्ध के रूप में एक ही तरीके से फिटकिरी और पीबीएस के 1 मिश्रण: एक 1 तैयार करें.
- 3 इंजेक्शन की कुल के लिए 3 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह एक बार सभी चूहों (OVA और पीबीएस नियंत्रण) संवेदनशील. अंतिम इंजेक्शन के बाद स्थानीय तीव्रग्राहिता परख प्रदर्शन से पहले कम से कम 2 सप्ताह प्रतीक्षा करें.
2 स्थानीय तीव्रग्राहिता परख
- कमरे के तापमान को ओवीए शेयर समाधान लाओ. (: 1X पीबीएस में ओवीए के 4 कमजोर पड़ने 1) एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, पीबीएस के साथ 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 20 मिलीग्राम / एमएल ओवीए शेयर पतला. भंवर संक्षिप्त मिश्रण करने के लिए.
- आर सी 2 <उपयोग कर चूहों चतनाशून्य/ Sup> कृंतक संज्ञाहरण प्रणाली (या तुलनीय वाष्पीकृत वितरण प्रणाली). Isoflurane साथ जलाशय को भरने, और ओ 2 airflow पर बारी. प्रेरण कक्ष में जगह चूहों और anesthetization आरंभ करने के लिए 5% isoflurane नियंत्रण डायल समायोजित. चूहों पूरी तरह anesthetized हैं एक बार, गतिशीलता की कमी से संकेत दिया, गहरी anesthetization बनाए रखने के लिए 3% isoflurane नियंत्रण डायल समायोजित. इस प्रक्रिया में संज्ञाहरण के उद्देश्य पशु स्थिर है. कान और पूंछ नस में इंजेक्शन जानवर के लिए महत्वपूर्ण दर्द या संकट का कारण नहीं है.
नोट: Isoflurane मानव प्रजनन प्रणाली पर नकारात्मक प्रभाव हो सकता है. अपशिष्ट गैस बेअसर करने के लिए एक अच्छी तरह हवादार कमरे में उपयोग और प्रेरण कक्ष के लिए एक सफाई कनस्तर भेजना न भूलें. Isoflurane का उपयोग करते समय यदि आप गर्भवती हैं, जोखिम को कम करने के लिए एक कार्बन फिल्टर मुखौटा पहनते हैं. - लोड एक 31 जी सुई के साथ छाया हुआ एक 3/10 सीसी इंसुलिन सिरिंज में 5 मिलीग्राम / एमएल ओवीए के 10 μl. 10 μl के साथ एक और 3/10 सीसी इंसुलिन सिरिंज लोडकी 1x पीबीएस.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग, ओवीए की 50 ग्राम की एक चुनौती खुराक के लिए एक anesthetized माउस के दाहिने कान में ओवीए के 10 μl इंजेक्षन. अन्य खुराक, इस तरह के 20 ग्राम के रूप में, यह भी स्वीकार्य हैं.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के आसपास स्कॉच टेप (चिपचिपा तरफ ऊपर) लपेट, इंजेक्शन के लिए कान को स्थिर करने के लिए. टेप करने का अधिकार कान के पृष्ठीय पक्ष को सुरक्षित करो. कान की दो पत्तियों के बीच सुई उठाव तरफ ऊपर डालें. धीरे धीरे किसी भी रक्त वाहिकाओं को हिट करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, कान ऊतक के केंद्र में ओवीए इंजेक्षन.
- ऊपर वर्णित एक ही विधि का उपयोग करना, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बाएं कान में पीबीएस के 10 μl इंजेक्षन.
- 3 मिनट रुको.
- इस समय के दौरान, एक restrainer में माउस जगह और 1 मिनट रक्त वाहिकाओं को चौड़ा करने के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे या एक गर्म पानी के स्नान में पूंछ पकड़.
- धीरे धीरे पूंछ वी में 0.5% इवांस नीले रंग के 200 μl इंजेक्षन, एक 27 जी सुई के साथ छाया हुआ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का प्रयोगमाउस के Ein. पूरे 200 μl से पहले पोत संरचना को नष्ट कर सकते तेजी से इंजेक्शन किया जाता है. यदि ऐसा होता है, पूंछ के विपरीत दिशा में नस में डाई की शेष मात्रा इंजेक्षन करने का प्रयास.
- 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
- माउस Euthanize और संदंश और शल्य कैंची का उपयोग दोनों कानों को हटा दें.
- कोई दबाव कान के केंद्र में इंजेक्शन साइट के लिए लागू किया जाता है, यकीन है कि संदंश के साथ कान के किनारों को पकड़ो. के करीब कटौती करके जितना संभव कान ऊतक निकालें, लेकिन नहीं के माध्यम से, कान के आधार पर उपास्थि वर्तमान के कटक. फर की थोड़ी मात्रा excised कान पर मौजूद हो सकता है; इस परख को प्रभावित नहीं करेगा.
- विभाज्य 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में formamide के 700 μl. कान प्रति एक ट्यूब (माउस प्रति दो ट्यूबों) तैयार करें.
नोट: Formamide, टेराटोजेनिक mutagenic, और एक अड़चन है. दस्ताने, नेत्र संरक्षण, और चेहरे संरक्षण पहनें. एक से निपटने जब गर्भवती महिलाओं को सावधानी का उपयोग करना चाहिएएस formamide fetotoxic हो सकता है. - , Formamide ट्यूब टोपी, और 63 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक सूखी गर्मी स्नान में रातोंरात सेते कान जोड़ें. कान अभी भी ऊष्मायन के बाद थोड़ा नीला दिखाई दे सकते हैं; हालांकि डाई का बहुमत formamide में निकाला जाएगा.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए, दो प्रतियों में, प्रत्येक नमूने के 300 μl जोड़ें. यह नमूने में मौजूद है तो फर स्थानांतरित करने से बचें. कुओं में मौजूद कोई बुलबुले हैं कि वे absorbance पढ़ने को प्रभावित करेगा के रूप में, यह सुनिश्चित करें.
- 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए, दो प्रतियों में, formamide के 300 μl जोड़ें. इन कुओं कारतूस के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
- 620 एनएम पर absorbance को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें. प्रत्येक नमूने पढ़ने से घटाना formamide कुओं.
नोट: सभी प्रयोगों वर्दीधारी सेवाओं विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया.
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Representative Results
सफलतापूर्वक परख आया है कि पशु त्वचा और नीले रंग दिखाई देते हैं कि आंखों होगा. पीबीएस अवगत जानवरों इसलिए दोनों कानों सफेद (चित्रा 1 ए) रहना चाहिए, पीबीएस या ओवीए चुनौती या तो प्रतिक्रिया नहीं करनी चाहिए. ओवीए अवगत पशुओं में, पीबीएस चुनौती प्राप्त कान (बाएं) पूरी तरह से सफेद या इंजेक्शन के स्थल पर एक स्थानीय तरीके से हल्के से नीले या तो होना चाहिए. ओवीए चुनौती प्राप्त कान (दाएं) डाई प्रशासन (चित्रा 1 बी) के बाद 10 मिनट के दौरान उत्तरोत्तर गहरा नीला हो जाना चाहिए.
पीबीएस अवगत जानवरों पीबीएस और ओवीए चुनौती (2A चित्रा) दोनों के लिए नगण्य absorbance रीडिंग होगा. ओवीए अवगत जानवर, पीबीएस इंजेक्शन आम तौर पर 0.13 का एक मतलब absorbance के पढ़ने और 0.04 की एक मानक विचलन में परिणाम है. इसके विपरीत, 0.58 की एक मतलब absorbance के पढ़ने और 0.18 की एक मानक विचलन में एक 50 माइक्रोग्राम ओवीए चुनौती परिणाम (फाईgure 2 बी). यदि आवश्यक हो तो चुनौती के लिए इस्तेमाल किया ओवीए की राशि व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 0.30 की एक मतलब absorbance और 0.10 (चित्रा -2) की एक मानक विचलन में एक 20 माइक्रोग्राम ओवीए चुनौती परिणाम, 20 माइक्रोग्राम से कम हालांकि एक चुनौती विश्वसनीय परिणाम नहीं दे सकता है. ओवीए एकाग्रता में परिवर्तन अनुकूलित और उपयोग करने से पहले मान्य किया जाना चाहिए.
पीबीएस absorbance ओवीए absorbance की तुलना के साथ परिणाम रेखांकन, जोड़ा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, परिणाम प्रत्येक व्यक्ति पशु के लिए ओवीए absorbance से घटाया पीबीएस absorbance के साथ, एक मूल्य के रूप में प्लॉट किया जा सकता है.
चित्रा 1: पीबीएस और ओवीए अवगत पशुओं में कान रंजकता. (ए). पीबीएस में कान रंजकता जानवरों अवगत. 5 के साथ चुनौती (पीबीएस के साथ चुनौती दी है) बाएं कान और सही कान (0 ग्राम ओवीए) नहीं डाई तरल पदार्थ का स्त्राव को थोड़ा दिखा. (बी). ओवीए अवगत पशुओं में कान रंजकता. नीले डाई तरल पदार्थ का स्त्राव की अनुपस्थिति से संकेत के रूप में (पीबीएस के साथ चुनौती दी है) बाएं कान में कोई एलर्जी की प्रतिक्रिया होती है. (50 माइक्रोग्राम ओवीए साथ चुनौती) सही कान वृद्धि हुई नाड़ी पारगम्यता, कान ऊतक में सेल सक्रियण का एक सीधा परिणाम का संकेत एक चमकदार नीले रंग से पता चलता है.
चित्रा 2: ओवीए अवगत जानवरों के लिए प्रतिनिधि आयुध डिपो मूल्यों 620 एनएम पर लिया spectrophotometric माप से व्युत्पन्न आयुध डिपो मूल्यों (ए)... पीबीएस अवगत पशुओं में 50 माइक्रोग्राम ओवीए चुनौती. दोनों पीबीएस और ओवीए चुनौती के लिए आयुध डिपो मूल्यों नगण्य हैं. (बी). ओवीए अवगत पशुओं में 50 माइक्रोग्राम ओवीए चुनौती. आयुध डिपो मूल्यों में पीबीएस चुनौती परिणामों <0.2 और ओवीए चुनौती resuआयुध डिपो मूल्यों में एलटीएस> 0.3. (सी). 20 माइक्रोग्राम ओवीए चुनौती. आयुध डिपो मूल्यों में पीबीएस चुनौती परिणामों <0.2. सही कान थोड़ा इस्तेमाल ओवीए की एक छोटी चुनौती खुराक की वजह से आयुध डिपो मूल्यों को कम कर दिया.
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Discussion
एलर्जी रोग के कई मार्करों airway चुनौती की सेटिंग में ब्रोन्कोएल्वियोलर द्रव में घूम हिस्टामिन, Th2 साइटोकाइन उत्पादन, और सेल भर्ती के स्तर में परिवर्तन सहित allergen चुनौती निम्नलिखित एलर्जी प्रतिक्रियाओं की ताकत का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन मानकों में परिवर्तन की निगरानी एलर्जी के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, जैविक मार्कर हमेशा नैदानिक एलर्जी रोग के साथ संबंध स्थापित नहीं है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित स्थानीय तीव्रग्राहिता परख स्थानीयकृत एलर्जी रोग के लिए एक सहसंबंधी के रूप में स्थानीय संवहनी पारगम्यता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप प्रदान करता है. नीले डाई तरल पदार्थ का स्त्राव का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल दृश्य और एक स्थानीय एलर्जी की प्रतिक्रिया के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव दोनों में सक्षम बनाता है. नैदानिक स्कोरिंग पर भरोसा करते हैं कि एलर्जी assays के विपरीत, (spectrophotometric absorbance के द्वारा मापा के रूप में नीले रंग की डाई तरल पदार्थ का स्त्राव) इस परख के प्राथमिक परिणाम आसानी से पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह के अधीन नहीं है. एक अन्य उन्नत स्तरntage जानवरों संभावित allergen चुनौती और डाई प्रशासन की वजह से किसी भी असुविधा सीमित शीघ्र ही चुनौती के बाद euthanized हैं कि है. Akiyama एट अल. 10 द्वारा वर्णित एक हाथ से आयोजित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के वैकल्पिक प्रयोग संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन की सतत मापन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, इवांस नीले डाई विषाक्त है, और इंजेक्शन अंततः पशु euthanized होने की जरूरत को बढ़ावा मिलेगा.
इस परख शक्तियों में से एक संख्या है, यह कुछ हद तक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होने के सीमा है. विश्वसनीय परिणाम सुसंगत और सफल कान और पूंछ नस में इंजेक्शन पर निर्भर हैं. पूरे चुनौती खुराक कान में प्रशासित नहीं है, तो इवांस ब्लू नसों में इंजेक्शन पूरा नहीं हुआ है, तो एक रक्त वाहिका की स्पष्ट पंचर में कान इंजेक्शन परिणाम, या, पशु विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. हमारी प्रयोगशाला में, जांचकर्ताओं seve के लिए अंतर्त्वचीय कान इंजेक्शन अभ्यास करना पड़ा हैप्रवीणता को विकसित करने से पहले RAL सप्ताह. इसके अतिरिक्त, यह परख के लिए उचित नियंत्रण चलाने के लिए महत्वपूर्ण है. जानवरों सुई प्रविष्टि की वजह से नुकसान के लिए थोड़ा अलग तरह से प्रतिक्रिया करने लगते हैं के रूप में विशेष रूप से, पीबीएस इंजेक्शन नियमित तौर पर, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पीबीएस पढ़ने इंजेक्शन से ही प्रेरित संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन के लिए एक आधारभूत उपाय देता है. अंतर्त्वचीय कान इंजेक्शन का उपयोग करने के एवज में, परख भी चूहों की त्वचा वापस करने के लिए लागू किया जा सकता है. जांचकर्ता इसके अलावा, यह एक साथ कई एंटीजन के परीक्षण के लिए अनुमति देता है, इस मार्ग से कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो पाते हैं, और हो सकता है.
चुनौती खुराक प्रयोग के आधार पर चालाकी से किया जा सकता है के रूप में स्थानीय तीव्रग्राहिता परख, अत्यंत बहुमुखी है. यह एलर्जी प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन को देखने के लिए आवश्यक है, यह इस तरह के 20 ग्राम के रूप में, एक कम ओवीए चुनौती खुराक का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. इस रूप में, absorbance में निगरानी परिवर्तन में वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए अनुमति देता हैयह सेल सक्रियण के लिए संतृप्ति बिंदु तक पहुँच जाएगा कि संभावना कम हो जाएगा.
साथ ही, यह परख निष्क्रिय त्वचीय तीव्रग्राहिता (पीसीए) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस रूपरेखा में प्रतिजन विशिष्ट IgE दूसरे में एक कान और वाहन में इंजेक्ट किया जाता है. 24 घंटे बाद, पशु प्रतिजन और इवांस नीले रंग की एक अंतःशिरा चुनौती दी गई है. पीसीए मॉडल यह प्रयोग, प्रयुक्त जानवर की संख्या को पूरा करने के लिए लगने वाले समय को कम करने, और जांचकर्ताओं आईजीई पार से जोड़ने के विशिष्ट प्रभाव को देखने के लिए अनुमति दे सकते हैं.
समय ले प्रदर्शन करने के बावजूद, इस पत्र में वर्णित सक्रिय त्वचीय तीव्रग्राहिता (एसीए) मॉडल का उपयोग करने के लिए कुछ लाभ कर रहे हैं. संवेदीकरण आमतौर पर प्रणालीगत है और लोगों को आम तौर पर प्रचलन में allergen विशिष्ट IgE और आईजीजी दोनों के रूप में साप्ताहिक प्रदर्शन के माध्यम से संवेदीकरण, mimics व्यक्तियों एलर्जी रोग का विकास प्रक्रिया है जिसके द्वारा प्रतिजन के लिए. आईजीई पार से जोड़ने मा का प्राथमिक साधन हैसेंट सेल degranulation, मस्तूल कोशिकाओं को भी आईजीजी पार से जोड़ने का जवाब. शोधकर्ताओं केवल IgE की मध्यस्थता रोग के अलावा एलर्जी प्रतिक्रियाओं के तंत्र की जांच करने के लिए इसलिए, एसीए मॉडल की अनुमति देता है. इस्तेमाल किया संवेदीकरण की विधि अन्वेषक के विवेक पर है, जबकि अंत में, स्थानीय तीव्रग्राहिता परख बहुमुखी है और संवेदनशील बनाने के तरीके की एक किस्म के साथ प्रयोग किया जा सकता है.
कान में सूजन, एलर्जी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्कर, भी ओवीए चुनौती के बाद मापा जा सकता है. हम ओवीए साथ चुनौती कानों 1 घंटा पोस्ट इंजेक्शन पर पीबीएस के साथ चुनौती दी कान की तुलना में काफी अधिक सूजन है कि मिल गया है. इवांस ब्लू परीक्षण के विपरीत, हम माप तरल पदार्थ का स्त्राव डाई और उपकरणों को मापने का उपयोग करते समय कान मोटाई कान के संपीड़न द्वारा बदला जा सकता है के रूप में जांचकर्ताओं के बीच अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता प्रदर्शन की तुलना में कम संवेदनशील होते हैं कि कान मोटाई मनाया है.
माउस के अलावा अन्य उपभेदोंBALB / ग स्थानीय तीव्रग्राहिता परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि absorbance रीडिंग इस्तेमाल किया तनाव के आधार पर थोड़ा भिन्न होगा. मजबूत Th2 प्रतिक्रियाओं को विकसित करने की उनकी प्रवृत्ति की वजह से, BALB / ग चूहों आम तौर पर इस परख के साथ विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रीडिंग का उत्पादन.
इस परख एंटीजन की एक किस्म को अवगत पशुओं में स्थानीयकृत एलर्जी प्रतिक्रियाओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. परख सफलतापूर्वक ओवीए और कीहोल लंगड़ाहट Hemocyanin (KLH) के रूप में आम एलर्जी, के साथ प्रदर्शन किया गया है के रूप में एंटीजन चयन, लचीला है. इसके अलावा, संवेदनशील बनाने के एवज में, एक स्थानीय एलर्जी की प्रतिक्रिया एंटीबॉडी इंजेक्शन द्वारा एक भोले पशु में हासिल किया जा सकता है कि basophils और मस्तूल कोशिकाओं पर पार से लिंक आईजीई या आईजीई रिसेप्टर्स, या ऐसे CD200R3 1 के रूप में इन कोशिकाओं पर गैर आईजीई सक्रियण रिसेप्टर्स ligating से .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
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