Summary
Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.
Abstract
Reazioni allergiche sono il risultato dell'attivazione dei mastociti e basofili e il successivo rilascio di vasoattivo e mediatori proinfiammatori. L'esposizione ad un allergene in una persona sensibilizzata può causare sintomi clinici che variano da eritema lieve a pericolo di vita anafilassi. In laboratorio, sono stati sviluppati diversi modelli animali per capire i meccanismi di guida reazioni allergiche. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per misurare i cambiamenti della permeabilità vascolare per quantificare le risposte allergiche localizzate. Il saggio anafilassi locale è stata segnalata per la prima nel 1920, ed è stato adattato dalla tecnica pubblicata da Kojima et al. nel 2007 1. In questo saggio, i topi sensibilizzati al OVA sono sfidati nel orecchio sinistro con il veicolo e l'orecchio destro con OVA. Questa è seguita da una iniezione endovenosa di Blu di Evans colorante. Dieci minuti dopo l'iniezione di Blu di Evans, l'animale è eutanasia e il colorante che è uscito dai vasi inper le orecchie viene estratto durante la notte in formammide. L'assorbanza del colorante estratto viene poi quantificato con uno spettrofotometro. Questo metodo assicura in maniera affidabile una manifestazione visiva e quantificabile di una reazione allergica locale.
Introduction
Ipersensibilità di tipo I è mediata da antigene-indotta cross-linking delle IgE sulla superficie dei mastociti e basofili. Ciò si traduce in degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori vasoattivi e proinfiammatori come l'istamina, triptasi, e fattore attivante le piastrine 2. A seguito del rilascio di mediatori preformati durante degranulazione, mastociti sintetizzano e rilasciano prostaglandine e leucotrieni, che aumentano ulteriormente la permeabilità vascolare 3. La risposta clinica iniziale avviene rapidamente ed è indicato come una "reazione immediata". Nella pelle, una risposta wheal-e-bagliori è facilmente visibile a pochi minuti dall'esposizione all'antigene. A seconda della dose di sfida, è possibile osservare una "risposta in fase tardiva" poche ore più tardi. Gonfiore fase tardiva è dovuta a edema localizzato e il reclutamento dei leucociti nei tessuti 2. L'istamina, generalmente considerato il principale mediatore parteciparereazioni allergiche immediate, agisce sul recettore dell'istamina 1 (HR1) espresso su navi e istamina recettore 2 (HR2) espresso sulla muscolatura liscia. L'effetto combinato aumenta il flusso sanguigno e la permeabilità vascolare nel sito di infiammazione 4.
Una varietà di modelli animali di allergia sono stati sviluppati al fine di studiare i meccanismi coinvolti nell'infiammazione allergica, compresi i modelli di asma allergica, anafilassi sistemica, e anafilassi locali. Somministrazione endovenosa colorante è stato utilizzato per misurare le reazioni allergiche localizzate in modelli animali per quasi un secolo, con pubblicazioni che descrivono questa tecnica risalente al 1920 5. Conigli e porcellini d'India sono stati i primi modelli animali utilizzati per testare le reazioni immediate di ipersensibilità, e le risposte più sensibili sono stati generalmente presenti nell'orecchio 5,6. Il dosaggio è stato successivamente convalidato per l'uso in ratti e topi 7 8.
Storicamente,una varietà di metodi sperimentali sono stati utilizzati, compresa l'iniezione di antigene prima dell'iniezione del colorante, iniezione di colorante prima dell'iniezione di antigene, e l'iniezione contemporanea di colorante e l'antigene. Somministrazione endovenosa colorante come mezzi per misurare le risposte allergiche è un test versatile in quanto può essere utilizzato per misurare attiva, passiva, e invertire reazioni passive 5,9. Numerosi coloranti sono stati utilizzati per valutare reazioni allergiche, tra cui Trypan Blue, Pontamine Cielo Blu, Blu di Evans, Geigy Blu 536, e l'India Ink 5,6,9. Una soluzione di 0,5% Blu di Evans è attualmente il colorante standard utilizzato per misurare le risposte allergiche della pelle.
La risposta anafilattica alla sfida è transitoria; intensità massima viene raggiunta entro 10 - 15 minuti di iniezione colorante, e nessuna reazione è visibile se colorante viene somministrato più di 30 minuti dopo la sfida, indipendentemente dalle specie animali utilizzate 9. Quantificazione di colorante stravaso era originalely ottenuta misurando dimensione pomfo come indicato dal colorante blu 7-9. Inoltre, conti di mastociti degranulati possono essere quantificati da asportare tessuto cutaneo dal sito della reazione e la colorazione con blu di toluidina 7. Degranulazione dei mastociti è spesso usato come marker per cutanea, reazioni allergiche IgE-mediate, come mastociti sono la principale popolazione di cellule locale che esprime il recettore ad alta affinità per le IgE FcεRI. Tecniche spettrofotometriche per la misurazione colorante stravaso nei tessuti sono stati sviluppati per anafilassi cutanea passiva (PCA) nel ratto e topo 10 11 nel 1990.
Il seguente protocollo del saggio anafilassi locale è stato adattato da Kojima et al. 1, e utilizza ovoalbumina uova di gallina (OVA) come l'antigene per suscitare reazioni allergiche. Tuttavia, antigeni diversi OVA possono essere utilizzati se lo si desidera. Il test utilizza quindi Blu di Evans colorante per monitorare i cambiamenti in permeabilit vascolarey che si verificano a causa di mastociti IgE cross-linking e il rilascio di istamina.
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Protocol
1. Mice Sensibilizzare
- Preparare una soluzione stock OVA diluendo OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Congelare le aliquote in cryovials e conservare a -80 ° C per un uso futuro.
- Portare una o più aliquote di 20 mg / ml di OVA magazzino a temperatura ambiente. Diluire OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml in una provetta 5 ml di polistirolo rotonda fondo con un tappo. Vortex brevemente per miscelare.
- Tenendo la provetta di polistirene contenente 1 mg / ml di OVA in un vortice funzionante a velocità media, aggiungere un volume uguale di fondo omogeneizzato Imject allume (40 mg / ml) goccia a goccia continuando a vortice tubo per produrre un rapporto 1: 1 di Alum a immunogeno.
- Mettere tappo sul tubo e nastro tubo vortex. Attivare vortice sul valore più basso e consentire OVA di adsorbimento al Alum per 30 min.
- Non permettere che una grande quantità di tempo per passare tra la preparazione OVA / allume e sensibilizzazione topi. Se sensibilizzazione non può essere completata direttamente dopo OVA / allume preparatione, negozio OVA / allume a temperatura ambiente. Vortex per 1 min prima di utilizzare.
- Caricare una siringa da insulina da 1 ml con miscela di OVA / Alum. Chiudere la siringa con l'ago calibro 27.
- Iniettare 100 ml di OVA / Alum nel peritoneo di topi BALB / c per una dose per ogni topo di 50 mg di OVA e 2 mg di Alum.
- Per un controllo negativo, sensibilizzare altro gruppo di topi a PBS. Preparare una miscela 1: 1 di Alum e PBS in stesso modo di cui sopra, omettendo OVA.
- Sensibilizzare tutti i topi di controllo (OVA e PBS) una volta a settimana per 3 settimane per un totale di 3 iniezioni. Dopo l'iniezione finale, attendere almeno 2 settimane prima di eseguire il test anafilassi locale.
2. locale anafilassi Assay
- Portare soluzione madre OVA a temperatura ambiente. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, diluire 20 mg / ml di OVA magazzino ad una concentrazione finale di 5 mg / ml con PBS (1: 4 diluizione di OVA in PBS 1X). Vortex brevemente per miscelare.
- Anestetizzare topi utilizzando RC 2 </ Sup> Roditore anestesia sistema (o sistema di erogazione vaporizzata comparabili). Riempire il serbatoio con isoflurano, e accendere O 2 flusso d'aria. Luogo topi in camera di induzione e regolazione selettore di controllo isoflurano al 5% di avviare anestesia. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, indicato dalla mancanza di mobilità, regolare il selettore di controllo isoflurano al 3% per mantenere la profonda anestesia. Lo scopo di anestesia in questa procedura è quello di immobilizzare l'animale. Le iniezioni orecchie e coda vena non causano dolore o disagi all'animale.
NOTA: isoflurano può avere effetti negativi sul sistema riproduttivo umano. Assicurarsi di utilizzare in una stanza ben ventilata e allegare una bomboletta scavenging alla camera di induzione di neutralizzare gas di scarico. In caso di gravidanza durante l'utilizzo di isoflurano, indossare una maschera di filtro a carbone per ridurre al minimo l'esposizione. - Carico 10 ml di 5 mg / ml OVA in una siringa da insulina 3/10 cc ricoperto con un ago 31 G. Caricare un'altra siringa da insulina 3/10 cc con 10 microlitridi 1x PBS.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, iniettare 10 ml di OVA in dell'orecchio destro di un mouse anestetizzato per una dose di 50 mg di OVA. Altre dosi, come ad esempio 20 mg, sono anche accettabili.
- Per stabilizzare l'orecchio per l'iniezione, avvolgere nastro adesivo (adesivo rivolto verso l'alto) attorno ad un tubo da 15 ml. Fissare il lato dorsale dell'orecchio destro al nastro. Inserire il lato ago smusso tra le due foglie dell'orecchio. Iniettare lentamente OVA nel centro del tessuto dell'orecchio, facendo attenzione a non colpire eventuali vasi sanguigni.
- Utilizzando lo stesso metodo descritto sopra, iniettare 10 ml di PBS nell'orecchio sinistro come controllo negativo.
- Attendere 3 min.
- Durante questo periodo, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e tenere la coda sotto una lampada di calore o in un bagno di acqua calda per 1 min a dilatare i vasi sanguigni.
- Usando una siringa da insulina da 1 ml con tappo con un ago 27 G, iniettare lentamente 200 ml di 0,5% Blu di Evans colorante in coda vein del mouse. Iniezione rapida può distruggere la struttura nave prima l'intero 200 ml viene somministrato. In questo caso, tentare di iniettare il volume residuo di colorante nella vena sul lato opposto della coda.
- Attendere 10 min.
- Euthanize il mouse e rimuovere entrambe le orecchie con pinze e forbici chirurgiche.
- Afferrare i bordi dell'orecchio con una pinza, facendo attenzione che non viene applicata pressione al sito di iniezione al centro dell'orecchio. Rimuovere il tessuto più orecchie possibile tagliando vicino a, ma non attraverso la cresta di cartilagine presente alla base dell'orecchio. Piccole quantità di pelo possono essere presenti su un orecchio asportato; ciò non pregiudica il test.
- Aliquota 700 ml di formammide in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Preparare una provetta per orecchio (due tubi per il mouse).
NOTA: Formamide è teratogeno, mutageno, e un irritante. Indossare guanti, protezioni per gli occhi e la faccia. Le donne incinte dovrebbero prestare attenzione quando si maneggia unas formammide può essere fetotossici. - Aggiungi orecchie per formammide, tappare i tubi, e incubare una notte in un bagno di calore secco impostato a 63 ° C. Orecchie possono ancora apparire leggermente blu dopo l'incubazione; Tuttavia la maggior parte del colorante sarà estratto nel formammide.
- Aggiungere 300 ml di ciascun campione, in duplicato, di una piastra ben 96. Evitare il trasferimento di pelliccia se è presente nel campione. Assicurarsi che non vi siano bolle presenti nei pozzetti, in quanto saranno influenzare la lettura di assorbanza.
- Aggiungere 300 ml di formammide, in duplice copia, alla piastra ben 96. Questi pozzi saranno utilizzati come spazi vuoti.
- Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 620 nm. Pozzi formammide sottrarre da ogni lettura del campione.
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla Institutional Animal Care and Use Committee in uniforme Servizi Università.
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Representative Results
Gli animali che hanno subito il test con successo avranno la pelle e gli occhi che appaiono blu. PBS animali sensibilizzati non dovrebbero reagire a uno o PBS sfida OVA, quindi entrambe le orecchie dovrebbero rimanere bianco (Figura 1A). Negli animali sensibilizzati OVA, l'orecchio riceve la sfida PBS (sinistra) dovrebbe essere completamente bianca o leggermente blu in modo localizzato nel sito di iniezione. L'orecchio riceve la sfida OVA (a destra) dovrebbe diventare progressivamente più scuro blu durante il 10 minuti dopo la somministrazione della tintura (Figura 1B).
PBS animali sensibilizzati avranno letture di assorbanza trascurabili sia per la PBS e OVA sfida (Figura 2A). Per gli animali sensibilizzati OVA, iniezione di PBS in genere si traduce in una lettura di assorbanza media di 0,13 e una deviazione standard di 0,04. Al contrario, a 50 mcg OVA sfida si traduce in una lettura di assorbanza media di 0,58 e una deviazione standard di 0,18 (Fifigura 2B). La quantità di OVA utilizzato per la sfida può essere regolato per i singoli esperimenti, se necessario. Ad esempio, a 20 mcg OVA sfida si traduce in una assorbanza media di 0,30 e una deviazione standard di 0,10 (Figura 2C), tuttavia una sfida meno di 20 mg possono non dare risultati affidabili. Le variazioni di concentrazione OVA devono essere ottimizzati e convalidati prima dell'uso.
I risultati possono essere graficamente accoppiati, con PBS assorbanza rispetto al OVA assorbanza. In alternativa, i risultati possono essere riportati in un unico valore, con l'assorbanza PBS sottratto l'assorbanza OVA per ogni singolo animale.
Figura 1: Ear pigmentazione negli animali PBS e sensibilizzati OVA. (A). Ear pigmentazione in PBS sensibilizzati animali. L'orecchio sinistro (sfidato con PBS) e l'orecchio destro (sfidato con 50 mg OVA) mostrano poco o nessun stravaso colorante. (B). Ear pigmentazione negli animali sensibilizzati OVA. Non vi è alcuna reazione allergica nell'orecchio sinistro (sfidato con PBS), come indicato da una mancanza di colorante blu stravaso. L'orecchio destro (sfidato con 50 mg OVA) mostra una brillante colorazione blu indicativa di un aumento della permeabilità vascolare, un risultato diretto di attivazione delle cellule nel tessuto nell'orecchio.
Figura 2: valori di OD rappresentativi per gli animali sensibilizzati OVA valori di OD ottenuti da misure spettrofotometriche prese a 620 nm (A)... 50 mg OVA sfida in animali sensibilizzati PBS. Valori di OD sia per sfida PBS e OVA sono trascurabili. (B). 50 mg OVA sfida in animali sensibilizzati OVA. PBS sfida si traduce in valori di OD <0,2 e OVA sfida ResuLTS in valori OD> 0.3. (C). 20 mg OVA sfida. PBS sfida si traduce in valori di OD <0,2. Le orecchie destra hanno leggermente ridotto valori OD a causa di una dose minore di OVA utilizzato.
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Discussion
Numerosi marcatori di malattia allergica sono utilizzati per valutare la forza delle risposte allergiche seguenti sfida allergene, compresi i cambiamenti nei livelli di istamina circolante, Th2 produzione di citochine, e il reclutamento di cellule in liquido broncoalveolare nella cornice della sfida delle vie aeree. Mentre il monitoraggio dei cambiamenti in questi parametri è importante per studiare le reazioni allergiche, marcatori biologici non sempre correlano con malattia allergica clinica. Il test anafilassi locale descritto in questo protocollo fornisce la misura riproducibile della permeabilità vascolare localizzato come un correlato di malattia allergica localizzata. Utilizzando colorante blu stravaso, questo protocollo permette sia la visualizzazione e la quantificazione relativa di una reazione allergica localizzata. In contrasto con saggi di allergia che si basano su di punteggio clinico, l'esito primario di questo saggio (colorante blu stravaso misurata come assorbanza spettrofotometrica) non è facilmente soggetto a bias dell'osservatore. Un altro ADVAntage è che gli animali vengono sacrificati subito dopo sfida, limitando qualsiasi disagio potenzialmente causato dalla sfida allergene e l'amministrazione colorante. L'uso alternativo di uno spettrofotometro portatile descritto da Akiyama et al. 10 consente per la misura in continuo delle variazioni di permeabilità vascolare. Tuttavia, Blu di Evans colorante è tossico, e l'iniezione alla fine porterà a dover all'animale di essere eutanasia.
Anche questo test ha un certo numero di punti di forza, non hanno il limite di essere un po 'tecnicamente impegnativo. Risultati affidabili dipendono da iniezioni di orecchie e coda vena coerente e di successo. Se l'intera dose di sfida non viene somministrato nell'orecchio, se i risultati iniezione orecchio in evidente puntura di un vaso sanguigno, o se l'iniezione endovenosa Blu Evans non è completa, l'animale dovrebbero essere escluse dall'analisi. Nel nostro laboratorio, i ricercatori hanno dovuto praticare le iniezioni intradermiche orecchio per several settimane prima di sviluppare competenze. Inoltre, è importante eseguire controlli adeguati per il dosaggio. In particolare, l'iniezione PBS deve ordinariamente essere utilizzato come controllo interno, in quanto gli animali sembrano rispondere in modo leggermente diverso per i danni causati da inserimento dell'ago. La lettura PBS dà una misura di riferimento per i cambiamenti nella permeabilità vascolare indotta dall'iniezione stessa. Invece di utilizzare iniezioni intradermiche orecchio, il dosaggio può anche essere applicato alla pelle posteriore di topi. Gli investigatori possono trovare questa strada per essere tecnicamente meno impegnativo, e, inoltre, consente la sperimentazione di antigeni multipli contemporaneamente.
Il saggio anafilassi locale è estremamente versatile, in quanto la dose sfida può essere manipolata a seconda dell'esperimento. Se è necessario esaminare i cambiamenti nelle risposte allergiche, può essere utile per utilizzare una dose sfida OVA inferiore, ad esempio 20 mg. Questo permette una maggiore sensibilità nel monitoraggio dei cambiamenti in assorbanza, comesarà meno probabile che venga raggiunto il punto di saturazione per l'attivazione delle cellule.
Inoltre, questo test può essere utilizzato per studiare l'anafilassi cutanea passiva (PCA). In questa impostazione, IgE antigene-specifica viene iniettato in un orecchio e veicolo nell'altra. 24 ore più tardi, l'animale viene data una sfida per via endovenosa di antigene e di Blu di Evans colorante. Il modello PCA può ridurre il tempo necessario per completare l'esperimento, il numero di animali utilizzati, e permettere agli investigatori di guardare gli effetti specifici di IgE cross-linking.
Nonostante prendendo più tempo per eseguire, ci sono alcuni vantaggi di utilizzare l'anafilassi cutanea (ACA) modello attivo descritto in questo documento. Sensibilizzazione attraverso l'esposizione settimanale al Antigen imita il processo mediante il quale gli individui sviluppano malattie allergiche, come la sensibilizzazione di solito è sistemica e le persone in genere hanno entrambi IgE allergene-specifiche e IgG in circolazione. Mentre IgE cross-linking è il mezzo principale di madegranulazione st, mastociti rispondono anche alle IgG cross-linking. Pertanto, il modello ACA permette ai ricercatori di indagare i meccanismi di reazioni allergiche, oltre alla malattia solo IgE-mediata. In conclusione, mentre il metodo di sensibilizzazione utilizzato è a discrezione del ricercatore, il saggio anafilassi locale è versatile e può essere utilizzato con una varietà di metodologie di sensibilizzazione.
Gonfiore dell'orecchio, un marker comunemente usato per valutare reazioni allergiche, può anche essere misurata dopo OVA sfida. Abbiamo scoperto che le orecchie sfidato con OVA hanno significativamente più gonfiore di orecchie sfidati con PBS in 1 ora dopo l'iniezione. In contrasto con la prova di Blu di Evans, abbiamo osservato che le misurazioni dello spessore dell'orecchio sono meno sensibili di tintura stravaso e presentano una maggiore variabilità tra gli investigatori come spessore dell'orecchio può essere modificata per compressione del all'orecchio quando si utilizza dispositivi di misurazione.
Mouse ceppi diversi da quelliBALB / c può essere utilizzato per il saggio anafilassi locale; tuttavia letture di assorbanza variano leggermente a seconda del ceppo utilizzato. A causa della loro propensione a sviluppare forti risposte Th2, topi BALB / c producono generalmente affidabili, letture riproducibili con questo test.
Questo test consente la quantificazione delle risposte allergiche localizzate in animali sensibilizzati ad una varietà di antigeni. Selezione Antigen è flessibile, in quanto il test è stato eseguito con successo con allergeni comuni, come OVA e Keyhole Patella Emocianina (KLH). Inoltre, al posto di sensibilizzazione, una reazione allergica locale può essere raggiunta in un animale ingenuo iniettando anticorpi che i recettori cross-link IgE o IgE sui basofili e mastociti, o legando i recettori di attivazione non-IgE su queste cellule, come CD200R3 1 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z.
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
