Måling Lokale anafylaksi hos mus

Summary

Allergiske reaktioner, karakteriseret ved aktivering af mastceller og basofile, drives af krydsbinding af IgE og frigørelsen af ​​proinflammatoriske mediatorer. En kvantitativ vurdering af allergiske reaktioner kan opnås ved hjælp af Evans Blå farvestof for at overvåge ændringer i vaskulær permeabilitet efter allergen.

Abstract

Allergiske reaktioner er resultatet af aktiveringen af ​​mastceller og basofile og den efterfølgende frigivelse af vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer. Udsættelse for et allergen i et sensibiliseret individs kan resultere i kliniske symptomer, der varierer fra mindre erytem til livstruende anafylaksi. I laboratoriet har forskellige dyremodeller blevet udviklet til at forstå mekanismerne køre allergiske reaktioner. Heri beskriver vi en detaljeret metode til at måle ændringer i vaskulær permeabilitet til at kvantificere lokaliserede allergiske reaktioner. Den lokale anafylaksi assay blev først rapporteret i 1920'erne, og er blevet tilpasset fra den teknik publiceret af Kojima et al. i 2007 ^1. I dette assay mus sensibiliseret til OVA udfordres i det venstre øre med køretøj, og i højre øre med OVA. Dette er efterfulgt af en intravenøs injektion af Evans blå farvestof. Ti minutter efter injektion af Evans Blå, dyret aflivet, og farvestoffet, der har ekstravaseret itil ørerne udvindes natten over i formamid. Absorbansen af ​​det ekstraherede farvestof derefter kvantificeres med et spektrofotometer. Denne metode med sikkerhed giver en visuel og kvantificerbar manifestation af en lokal allergisk reaktion.

Introduction

Type I-overfølsomhed medieret af antigen-induceret tværbinding af IgE på overfladen af ​​mastceller og basofiler. Dette resulterer i cellulær degranulering og frigivelse af vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer såsom histamin, tryptase, og blodpladeaktiverende faktor ^2. Efter frigivelsen af præfabrikerede mediatorer under degranulering, mastceller syntetiserer og frigiver prostaglandiner og leukotriener, hvilket yderligere øger vaskulær permeabilitet ^3. Den indledende kliniske respons sker hurtigt og omtales som en "øjeblikkelig reaktion". I huden, en vabler-og flare reaktion er umiddelbart synlige i løbet af minutter antigen. Afhængig af den dosis af udfordringen, er det muligt at observere en "sen fase respons" et par timer senere. Sene fase hævelse skyldes lokalt ødem og leukocytrekruttering ind i vævene ^2. Histamin, der generelt anses for at være vigtig mediator deltager iumiddelbare allergiske reaktioner, virker på histamin-receptor 1 (HR1) udtrykt på skibe og histamin receptor 2 (HR2) udtrykt på den glatte muskulatur. Den kombinerede effekt øger blodgennemstrømningen og karpermeabilitet på stedet for inflammation ^4.

En række dyremodeller for allergi er blevet udviklet med henblik på at undersøge de mekanismer, der er involveret i allergisk inflammation, herunder modeller for allergisk astma, systemisk anafylaksi, og lokale anafylaksi. Intravenøs farvestof administration er blevet brugt til at måle lokale allergiske reaktioner i dyremodeller i næsten et århundrede, med publikationer, der beskriver denne teknik går tilbage til 1920'erne. ⁵ Kaniner og marsvin var de første anvendte dyremodeller til at teste umiddelbare overfølsomhedsreaktioner, og de ​​mest følsomme besvarelser blev generelt fundet i øret ^5,6. Assayet blev senere godkendt til brug i rotter ⁷ og mus ^8.

Historisken række eksperimentelle metoder er blevet anvendt, herunder injektion af antigen før injektion af farvestof, injektion af farvestof før injektion af antigen, og samtidig injektion af farvestof og antigen. Intravenøs farvestof administration som et middel til måling af allergiske reaktioner er en alsidig assay som det kan anvendes til måling af aktiv og passiv, og omvendt passive reaktioner ^5,9. Talrige farvestoffer er blevet brugt til at vurdere allergiske reaktioner, herunder trypanblåt, Pontamine Sky Blue, Evans Blå, Geigy Blå 536, og Indien Ink ^5,6,9. En opløsning af 0,5% Evans Blue er i øjeblikket standard farvestof anvendes til måling af allergiske reaktioner i huden.

Den anafylaktisk reaktion på udfordringen er forbigående; maksimal intensitet nås inden 10 - 15 min farvestof injektion og ingen reaktion er synlig, hvis farvestoffet indgives mere end 30 minutter efter udfordring, uanset de anvendte dyrearter ^9. Kvantificering af farvestof ekstravasation var oprindeligly opnås ved at måle vabler størrelse som angivet af det blå farvestof ^7-9. Derudover kan tællinger af degranulerede mastceller kvantificeres ved udskæring af hud væv fra stedet for reaktionen og farvning med toluidinblåt ^7. Mastcelledegranulering bruges ofte som en markør for kutant, IgE-medierede allergiske reaktioner, som mastceller er den vigtigste lokale cellepopulation udtrykker højaffinitets IgE-receptor FceR. Spektrofotometriske teknikker til måling af farvestof ekstravasation i vævet blev udviklet for passive kutane anafylaksi (PCA) hos rotter ¹⁰ og mus ¹¹ i 1990'erne.

Følgende lokale anafylaksi assayprotokollen blev tilpasset fra Kojima et al. ^1, og udnytter kylling æg ovalbumin (OVA) som antigen til at fremkalde allergiske reaktioner. Imidlertid kan andre end OVA antigener om ønsket anvendes. Assayet derefter bruger Evans Blå farvestof for at overvåge ændringer i vaskulær permeability, der opstår på grund af mast celle IgE krydsbinding og histamin frigivelse.

Protocol

1. bevidstgøre Mus

1. Forbered en OVA-stamopløsning ved fortynding OVA i 1x PBS til en slutkoncentration på 20 mg / ml. Frys ned portioner i kryoglas og opbevares ved -80 ° C til senere brug.
2. Bring en eller flere portioner af 20 mg / ml OVA lager til stuetemperatur. Fortynd OVA i 1x PBS til en slutkoncentration på 1 mg / ml i et 5 ml polystyren rundbundet rør med en hætte. Vortex kortvarigt at blande.
3. Hold polystyrenrør indeholdende 1 mg / ml OVA i en hvirvel indstillet til medium hastighed, tilsættes et lige volumen af ​​grundigt homogeniseret Imject Alum (40 mg / ml) dråbevis under fortsat vortexes røret for at fremstille en 1: 1-forhold mellem Alun til immunogenet.
4. Placer hætten på røret og tape rør til vortex. Slå vortex på laveste indstilling og tillade OVA at adsorbere til Alum i 30 min.
   1. Lad ikke en stor mængde tid til at passere mellem forberede OVA / Alun og sensibiliserende mus. Hvis overfølsomhed ikke kan afsluttes direkte efter OVA / Alum forberedelse;ion, butik OVA / Alum ved stuetemperatur. Vortex i 1 minut før brug.
5. Indlæse en 1 ml insulinsprøjte med OVA / Alum blanding. Cap sprøjten med 27 gauge kanyle.
6. Indsprøjtes 100 ul OVA / Alum i peritoneum af BALB / c-mus i en dosis pr mus på 50 ug af æg og 2 mg alun.
7. Ved en negativ kontrol sensibiliseres anden gruppe af mus til PBS. Forbered en 1: 1 blanding af Alun og PBS på samme måde som nævnt ovenfor, at udelade OVA.
8. Bevidstgøre alle mus (OVA og PBS kontrol) en gang om ugen i 3 uger for i alt 3 injektioner. Efter sidste injektion, skal du vente mindst 2 uger, før du udfører en lokal anafylaksi analysen.

2. Lokal Anafylaksi Assay

1. Bring OVA stamopløsning til stuetemperatur. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, fortyndes 20 mg / ml OVA lager til en endelig koncentration på 5 mg / ml med PBS (1: 4 fortynding af OVA i 1X PBS). Vortex kortvarigt at blande.
2. Bedøver mus ved brug af RC ^{2 <}/ Sup> gnaver Anæstesi system (eller sammenlignelig fordampet levering system). Fyld beholderen med isofluran, og tænd O ₂ luftstrøm. Placer mus i induktion kammer og justere isofluran drejeknappen til 5% at indlede bedøvelse. Når musene er fuldt bedøvet, indikeret ved manglende mobilitet, justere isofluran drejeknappen til 3% for at bevare dyb bedøvelse. Formålet med anæstesi i denne procedure er at immobilisere dyret. Øret og haleveneinjektioner ikke forårsager betydelige smerter eller lidelse for dyret.
   BEMÆRK: Isofluran kan have negative virkninger på den menneskelige reproduktive system. Vær sikker på at bruge i et godt ventileret rum og vedlægge en latrintømning dunk til induktion kammer at neutralisere røggas. Hvis du er gravid, mens du bruger isofluran, bære et kulfilter maske for at minimere eksponering.
3. Læg 10 pi 5 mg / ml æg i en 3/10 cc insulinsprøjte udjævnet med en 31 G kanyle. Læg endnu 3/10 cc insulinsprøjte med 10 pi1X PBS.
4. Ved hjælp af en dissektionsmikroskop, injiceres 10 pi æg i højre øre af en bedøvet mus til en udfordring dosis på 50 ug OVA. Andre doser, såsom 20 ug, kan også accepteres.
   1. For at stabilisere øre til injektion, wrap tape (klæbende side op) omkring en 15 ml konisk rør. Fastgør den dorsale side af det højre øre til båndet. Sæt nåleaffasningen opad mellem de to blade af øret. Injicer langsomt OVA ind i midten af ​​øret væv, pas på ikke at ramme nogen blodkar.
5. Ved anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, injiceres 10 pi PBS i venstre øre som en negativ kontrol.
6. Vent 3 min.
   1. I løbet af denne tid, skal du placere musen i en harpiksstopperen og holde halen under en varmelampe eller i et varmt vandbad i 1 min til at spile blodkarrene.
7. Ved hjælp af en 1 ml insulinsprøjte udjævnet med en 27 G kanyle, langsomt injiceres 200 pi 0,5% Evans blå farvestof i halen vein af musen. Hurtig injektion kan ødelægge skibet struktur før hele 200 ul administreres. Hvis dette sker, forsøger at injicere den resterende mængde af farvestof i venen på den modsatte side af halen.
8. Vent 10 min.
9. Aflive musen og fjern begge ører ved hjælp af pincet og kirurgiske saks.
   1. Tag kanterne af øret med pincet, hvilket gør, at der ikke påføres tryk på injektionsstedet i midten af ​​øret. Fjern så meget øre væv som muligt ved at skære tæt på, men ikke gennem, højderyggen af ​​brusk til stede ved basis af øret. Små mængder af pels kan være til stede på den udskårne øre; Dette vil ikke påvirke assayet.
10. Afmål 700 pi formamid i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Forbered et rør pr øre (to rør per mus).
    BEMÆRK: Formamid er teratogent, mutagene og irriterende. Bær handsker, øjenbeskyttelse og ansigtsbeskyttelse. Gravide kvinder bør være forsigtig, når du håndterer ets formamid kan være toksiske.
11. Tilføj ører formamid, cap rørene og inkuberes natten over i en tør varme bad indstillet til 63 ° C. Ører vises muligvis stadig lidt blå efter inkubation; men de fleste af farvestoffet vil blive ekstraheret i formamid.
12. Der tilsættes 300 pi af hver prøve i to eksemplarer på en plade med 96 brønde. Undgå at overføre pels, hvis det er til stede i prøven. Sørg for at der ikke er bobler i brøndene, da de vil påvirke absorbansen læsning.
13. Der tilsættes 300 pi formamid, i to eksemplarer, til 96-brønds plade. Disse brønde vil blive anvendt som blindprøver.
14. Brug et spektrofotometer til at måle absorbans ved 620 nm. Fratræk formamid brønde fra hver prøve læsning.
    BEMÆRK: Alle forsøg blev udført under protokoller godkendt af uniformerede tjenester University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Representative Results

Dyr, der har undergået analysen held vil have hud og øjne, der vises blå. PBS sensibiliserede dyr bør ikke reagere på enten PBS eller OVA Udfordringen består derfor begge ører bør forblive hvid (figur 1A). I OVA sensibiliserede dyr, øret modtager PBS udfordring (til venstre) skal enten være helt hvide eller svagt blå i en lokaliseret måde ved injektionsstedet. Øret modtager OVA udfordring (til højre), bør blive gradvist mørkere blå i løbet af 10 min efter farvestof administration (figur 1B).

PBS sensibiliserede dyr vil have ubetydelige absorbansaflæsninger for både PBS og OVA udfordring (figur 2A). For OVA sensibiliserede dyr generelt PBS injektion resulterer i en gennemsnitlig absorbans læsning på 0,13 og en standardafvigelse på 0,04. Omvendt en 50 ug OVA udfordring resulterer i en gennemsnitlig absorbans læsning på 0,58 og en standardafvigelse på 0,18 (FIfigur 2B). Mængden af ​​OVA anvendes til udfordring kan justeres til individuelle eksperimenter, hvis nødvendigt. For eksempel, en 20 ug OVA challenge resulterer i en gennemsnitlig absorbans på 0,30 og en standardafvigelse på 0,10 (Figur 2C) imidlertid en udfordring mindre end 20 ug kan ikke give pålidelige resultater. Ændringer i OVA Koncentrationen skal optimeres og valideres før brug.

Resultaterne kan grafisk parret, med PBS absorbans i forhold til OVA-absorbans. Alternativt kan resultaterne afbildet som en enkelt værdi, med PBS absorbans trækkes fra OVA absorbansen for hvert enkelt dyr.

Figur 1: Øre pigmentering i PBS og OVA sensibiliserede dyr. (A). Ear pigmentering i PBS sensibiliserede dyr. Det venstre øre (udfordret med PBS), og det højre øre (udfordret med 50 ug OVA) viser lidt at ingen farvestof ekstravasation. (B). Øre pigmentering i OVA sensibiliserede dyr. Der er ingen allergiske reaktion i venstre øre (udfordret med PBS), som indikeret ved et fravær af blå farve ekstravasation. Højre øre (udfordret med 50 ug OVA) viser en lys blå farve indikerer øget vaskulær permeabilitet, et direkte resultat af celle aktivering i øret væv.

Figur 2: Repræsentative OD-værdier for OVA sensibiliserede dyr OD-værdier afledt af spektrofotometriske målinger foretaget ved 620 nm (A)... 50 ug OVA-udfordring i PBS sensibiliserede dyr. OD-værdier for både PBS og OVA udfordring er ubetydelige. (B). 50 ug OVA udfordring i OVA sensibiliserede dyr. PBS udfordring resulterer i OD-værdier <0,2 og OVA udfordring resuLTS i OD-værdier> 0,3. (C). 20 ug OVA-udfordring. PBS challenge resultater i OD-værdier <0,2. De rigtige ører har lidt reduceret OD-værdier på grund af en mindre udfordring dosis OVA anvendes.

Discussion

Talrige markører for allergisk sygdom bruges til at vurdere styrken af ​​allergiske reaktioner efter allergen udfordring, herunder ændringer i niveauer af cirkulerende histamin, Th2 cytokin produktion, og celle rekruttering til bronkoalveolær væske i fastsættelsen af ​​luftvejene udfordring. Mens overvåge ændringer i disse parametre er vigtig for at studere allergiske reaktioner, behøver biologiske markører ikke altid overens med de kliniske allergisk sygdom. Den lokale anafylaksi assay beskrevet i denne protokol giver reproducerbar måling af lokaliseret karpermeabilitet som et korrelat til lokaliseret allergisk sygdom. Ved at bruge blåt farvestof ekstravasation, denne protokol giver mulighed for både visualisering og relativ kvantificering af en lokal allergisk reaktion. I modsætning til allergi analyser, som er afhængige af klinisk scoring, er det primære resultat af denne analyse (blåt farvestof ekstravasation som målt ved spektrofotometrisk absorbans) ikke nemt underkastet observatør bias. En anden advantage er, at dyrene aflives kort efter udfordring, at begrænse nogen ubehag som potentielt skyldes udfordring allergenet og farvestof administration. Det alternativ anvendelse af en håndholdt spektrofotometer beskrevet af Akiyama et al. ¹⁰ giver mulighed for kontinuerlig måling af ændringer i vaskulær permeabilitet. Men Evans blå farvestof er giftigt, og injektion vil i sidste ende føre til, at dyret behøver at blive aflivet.

Selv om denne analyse har en række styrker, har det en begrænsning af at være noget teknisk udfordrende. Pålidelige resultater afhænger af konsekvente og vellykkede øre og haleveneinjektioner. Hvis hele udfordring dosis ikke administreres i øret, hvis øre injektion resulterer i indlysende punktering af et blodkar, eller hvis Evans Blå intravenøs injektion er ikke komplet, dyret bør udelukkes fra analysen. I vores laboratorium har forskere måtte praktisere de intradermale øre injektioner for several uger før udvikle færdighed. Derudover er det vigtigt at køre en ordentlig kontrol for assayet. Konkret skal PBS injektion rutinemæssigt anvendes som en intern kontrol, som dyrene synes at reagere lidt forskelligt på skader forårsaget af nål indsættelse. PBS læsning giver en baseline foranstaltning for ændringer i vaskulær permeabilitet som følge af injektion selv. I stedet for at anvende intradermale øre injektioner kan analysen også anvendes til bagsiden huden på mus. Efterforskere kan finde denne vej at være mindre teknisk udfordrende, og desuden, det giver mulighed for afprøvning af flere antigener samtidigt.

Den lokale anafylaksi assayet er ekstremt alsidig, da belastningsdosis kan manipuleres afhængig af eksperimentet. Hvis det er nødvendigt at se på forandringer i allergiske reaktioner, kan det være fordelagtigt at anvende en lavere OVA belastningsdosis, såsom 20 ug. Dette giver mulighed for øget følsomhed i overvågning af ændringer i absorbans, somdet vil være mindre sandsynligt, at mætningspunktet for celle aktivering vil være nået.

Derudover kan dette assay anvendes til at studere passiv kutan anafylaksi (PCA). I denne indstilling er antigen-specifikt IgE injiceres i det ene øre og køretøj i den anden. 24 timer senere, er dyret gives intravenøs udfordring af antigen og Evans blå farvestof. PCA modellen kan reducere den tid, det tager at gennemføre forsøget, antallet af dyr, der anvendes, og tillader forskere til at se på de specifikke virkninger af IgE-tværbinding.

Trods tager længere tid at udføre, er der nogle fordele ved at bruge den aktive kutan anafylaksi (ACA) model er beskrevet i dette dokument. Overfølsomhed ved ugentlig eksponering for antigen efterligner den proces, hvor individer udvikle allergisk sygdom, som sensibilisering er sædvanligvis systemisk og folk generelt har både allergen-specifikt IgE og IgG i omløb. Mens IgE krydsbinding er det primære middel til mast celle degranulation, mastceller også reagere på IgG krydsbinding. Derfor tillader ACA model for forskere at undersøge mekanismerne for allergiske reaktioner i tillæg til blot IgE-medieret sygdom. Konklusionen er, mens metoden for sensibilisering anvendes, er på foranledning af investigator, den lokale anafylaksi analysen er alsidig og kan bruges med en bred vifte af overfølsomhedsreaktioner metoder.

Ear hævelse, et almindeligt anvendt markør for vurdering af allergiske reaktioner, kan også måles efter OVA-udfordring. Vi har fundet, at ørerne belastet med OVA har betydeligt flere hævelse end ører udfordret med PBS ved 1 time efter injektion. I modsætning til Evans Blå testen har vi observeret, at øretykkelse målinger er mindre følsomme end dye ekstravasation og udviser større variation mellem efterforskere som øretykkelse kan ændres ved sammenpresning af øret, når du bruger måleinstrumenter.

Mus stammer bortsetBALB / c-kan bruges til lokal anafylaksi assay; dog absorbanslæsninger vil variere lidt afhængigt af den anvendte stamme. På grund af deres tilbøjelighed til at udvikle stærke Th2-responser generelt BALB / c-mus producerer pålidelige og reproducerbare målinger med dette assay.

Denne analyse giver mulighed for kvantificering af lokaliserede allergiske responser i dyr sensibiliseret til en række antigener. Antigenselektion er fleksibel, da analysen er blevet udført med almindelige allergener, såsom OVA og keyhole limpet hemocyanin (KLH). Desuden, i stedet for sensibilisering, en lokal allergisk reaktion kan fremkaldes i et naivt dyr ved injektion af antistoffer, der krydsbinder IgE eller IgE-receptorer på basofile og mastceller, eller ved at ligere ikke-IgE-aktivering receptorer på disse celler, såsom CD200R3 ¹ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform