Summary
Allergiska reaktioner, som kännetecknas av aktivering av mastceller och basofiler, drivs av tvärbindning av IgE och frisättning av proinflammatoriska mediatorer. En kvantitativ bedömning av allergiska responser kan uppnås genom användning av Evans Blue färgämne för att övervaka förändringar i vaskulär permeabilitet efter allergenutmaning.
Abstract
Allergiska reaktioner är resultatet av aktivering av mastceller och basofiler och efterföljande frisättning av vasoaktiva och proinflammatoriska mediatorer. Exponering för ett allergen i en sensibiliserad individ kan leda till kliniska symtom som varierar från mindre erytem till livshotande anafylaxi. I laboratoriet har olika djurmodeller utvecklats för att förstå mekanismerna som driver allergiska reaktioner. Häri beskriver vi en detaljerad metod för att mäta förändringar i vaskulär permeabilitet för att kvantifiera lokaliserade allergiska svar. Den lokala anafylaxi analysen rapporterades först på 1920-talet, och har anpassats från den teknik som publicerats av Kojima et al. 2007 1. I denna analys är möss sensibiliserade mot OVA utmanas i vänster öra med bil och i höger öra med OVA. Detta följs av en intravenös injektion av Evans Blue färgämne. Tio minuter efter injicering Evans Blue, är djuret avlivas och färgämnet som extravaserat itill öronen utvinns natten i formamid. Absorbansen för det extraherade färgämnet kvantifieras sedan med en spektrofotometer. Denna metod resulterar pålitligt i en visuell och kvantifierbar manifestation av en lokal allergisk reaktion.
Introduction
Typ I överkänslighet medieras av antigeninducerad tvärbindning av IgE på ytan av mastceller och basofiler. Detta resulterar i cellulär degranulering och frisättning av vasoaktiva och proinflammatoriska mediatorer såsom histamin, tryptas, och blodplättsaktiverande faktor 2. Efter lanseringen av förformade mediatorer vid degranulering, mastceller syntetiserar och frigör prostaglandiner och leukotriener, vilket ytterligare öka vaskulär permeabilitet 3. Den initiala kliniska svaret sker snabbt och refereras till som en "omedelbar reaktion". I huden, är en wheal-och-flare svar väl synlig inom några minuter av antigen. Beroende på dosen av utmaningen, är det möjligt att observera en "sena svaret" några timmar senare. Sen fas svullnad beror på lokalt ödem och leukocytrekrytering i vävnaderna 2. Histamin, som allmänt anses vara den huvudsakliga medlaren deltar iomedelbara allergiska reaktioner, verkar på histaminreceptor 1 (HR1) uttryckt på fartyg och histamin-receptor 2 (HR2) uttryckt på glatt muskulatur. Den kombinerade effekten ökar blodflödet och vaskulär permeabilitet vid inflammationsstället 4.
En mängd olika djurmodeller av allergi har utvecklats i syfte att studera de mekanismer som är inblandade i allergisk inflammation, inklusive modeller av allergisk astma, systemisk anafylaxi, och lokala anafylaxi. Intravenös färgämne administration har använts för att mäta lokala allergiska reaktioner i djurmodeller för nästan ett sekel, med publikationer som beskriver denna teknik med anor från 1920-talet 5. Kaniner och marsvin var de första djurmodeller används för att testa omedelbara överkänslighetsreaktioner, och de mest känsliga responser i allmänhet finns i örat 5,6. Analysen senare validerats för användning i råttor 7 och möss 8.
Historiskten mängd olika experimentella metoder har använts, inklusive injektion av antigen före injektion av färgämne, injektion av färgämne före injektionen av antigen, och samtidig injektion av färgämne och antigenet. Intravenös färgämne administrering som ett medel för mätning av allergiska svar är en mångsidig analys såsom den kan användas för mätning av aktiva, passiva, och omvända passiva reaktioner 5,9. Många färgämnen har använts för att bedöma allergiska reaktioner, inklusive trypanblått, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blue 536, och Indien bläck 5,6,9. En lösning av 0,5% Evans Blue är för närvarande standard färgämne som används för mätning av allergiska reaktioner i huden.
Den anafylaktisk reaktion på utmaningen är övergående; maximal intensitet nås inom 10 - 15 min för färginjektion, och ingen reaktion är synlig om färgämne administreras mer än 30 minuter efter provokation, oberoende av de djurarter som används 9. Kvantifiering av färgämne extravasation var originally erhållas genom att mäta strimmigt storlek såsom indikeras av det blåa färgämnet 7-9. Dessutom kan räkningar av degranulated mastceller kvantifieras genom utskärning hudvävnad från platsen för reaktionen och färgning med toluidinblått 7. Mastcelldegranulering används ofta som en markör för kutan, IgE-medierade allergiska reaktioner, eftersom mastceller är den viktigaste lokala cellpopulation som uttrycker högaffinitets IgE-receptorn FcsRI. Spektrofotometriska tekniker för att mäta färgextravasation in i vävnaden utvecklades för passiva kutana anafylaxi (PCA) i råtta 10 och mus 11 på 1990-talet.
Följande lokala anafylaxi analysprotokoll anpassades från Kojima et al. 1, och utnyttjar hönsägg ovalbumin (OVA) som antigen för framkallande allergiska reaktioner. Emellertid kan andra än OVA-antigener användas om så önskas. Analysen använder sedan Evans Blue färgämne för att övervaka förändringar i vaskulär permeability som uppstår på grund av mastcell IgE tvärbindning och histaminfrisättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sensibilisera möss
- Bered en OVA stamlösning genom utspädning OVA i 1x PBS till en slutkoncentration av 20 mg / ml. Frys ner alikvoter i cryovials och förvara vid -80 ° C för framtida bruk.
- Ta med en eller flera portioner av 20 mg / ml OVA lager till rumstemperatur. Späd OVA i 1x PBS till en slutlig koncentration av 1 mg / ml i en 5 ml polystyren rundbottnad rör med ett lock. Kort Vortex att blanda.
- Håll i polystyrenrör innehållande 1 mg / ml OVA på en vortex inställd på mediumhastighet, tillsätt en lika stor volym noggrant homogeniserades Imject Alum (40 mg / ml) droppvis medan den fortsätter att vortexblanda röret för att producera en 1: 1-förhållande av Alum till immunogen.
- Placera locket på röret och tejpa röret till virvel. Slå virvel på lägsta inställningen och tillåta OVA att bindas till Alum i 30 min.
- Låt inte en stor del av tiden att passera mellan förbereda OVA / Alum och sensibiliserande möss. Om sensibilisering inte kan genomföras direkt efter OVA / Alum Förberedelsejon, lagra OVA / Alum vid rumstemperatur. Vortex i 1 minut innan du använder.
- Ladda en spruta 1 ml insulin med OVA / Alum blandning. Cap sprutan med 27 gauge nål.
- Injicera 100 pl av OVA / Alum i peritoneum hos möss BALB / c för en dos per mus av 50 ^ g av OVA och 2 mg Alum.
- För en negativ kontroll, sensibilisera en annan grupp av möss till PBS. Bered en 1: 1 blandning av alun och PBS på samma sätt som anges ovan, bortsett från OVA.
- Medvetandegöra alla möss (OVA och PBS kontroll) en gång per vecka under 3 veckor för totalt 3 injektioner. Efter sista injektionen, vänta minst 2 veckor innan du utför den lokala anafylaxi analysen.
2 Lokal Anafylaxi Assay
- Bring OVA stamlösningen till rumstemperatur. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, utspädd 20 mg / ml OVA lager till en slutlig koncentration av 5 mg / ml med PBS (1: 4 utspädning av OVA i 1X PBS). Kort Vortex att blanda.
- Söva möss med RC 2 </ Sup> Gnagare Anesthesia System (eller jämförbart förångas leveranssystem). Fyll behållaren med isofluran, och slå på O2 luftflöde. Placera möss i induktionskammare och justera isofluran kontrollratten på 5% för att initiera anesthetization. När möss helt bedövad, indikeras av bristande rörlighet, justera isofluran kontrollratten på 3% för att bibehålla djup anesthetization. Syftet med anestesi i detta förfarande är att immobilisera djuret. Örat och svans ven injektioner inte orsakar betydande smärta och lidande hos djuret.
OBS: Isofluran kan få negativa effekter på den mänskliga fortplantningssystem. Se till att använda i ett väl ventilerat rum och bifoga en rensning kanister med induktionskammare för att neutralisera avgaserna. Om du är gravid när du använder isofluran, ha ett kolfilter mask för att minimera exponeringen. - Belastning 10 pl av 5 mg / ml OVA i en spruta 3/10 cc insulin utjämnade med en 31 G nål. Fyll en annan spruta 3/10 cc insulin med 10 lav 1 x PBS.
- Använda ett dissektionsmikroskop, injicera 10 | il av OVA i höger öra av en sövd mus efter en utmaning dos av 50 ^ g av OVA. Andra doser, till exempel 20 mikrogram, godtas också.
- För att stabilisera örat för injektion, linda tejp (klibbiga sidan uppåt) runt en 15 ml koniska rör. Fäst ryggsidan av den högra öra till bandet. Stick in nålen avfasning uppåt mellan de två bladen av örat. Spruta långsamt OVA i mitten av örat vävnad, noga med att inte träffa några blodkärl.
- Med användning av samma metod som beskrivits ovan, injicera 10 | il av PBS i det vänstra örat som en negativ kontroll.
- Vänta 3 min.
- Under denna tid, placera musen i fixeringsutrustning och håll svansen under en värmelampa eller i ett varmt vattenbad i en minut för att vidga blodkärlen.
- Med hjälp av en spruta 1 ml insulin utjämnade med en 27 G nål, sakta injicera 200 pl 0,5% Evans Blue färgämne i svansen vein på musen. Snabb injektion kan förstöra fartyget struktur innan hela 200 l administreras. Om detta inträffar, försök att injicera den återstående volymen av färgämnet i venen på den motsatta sidan av svansen.
- Vänta 10 min.
- Euthanize musen och ta bort båda öronen med hjälp av pincett och kirurgisk sax.
- Ta kanterna på örat med pincett, och se till att inget tryck appliceras på injektionsstället vid mitten av örat. Avlägsna så mycket öronvävnad som möjligt genom att klippa nära intill, men inte genom, åsen av brosk närvarande vid basen av örat. Små mängder päls kan finnas på utskurna örat; detta kommer inte att påverka analysen.
- Alikvotera 700 | il formamid till 1,5 ml mikrorör. Förbered ett rör per öra (två tuber per mus).
OBS: Formamid är teratogent, mutagena och irriterande. Använd handskar, skyddsglasögon och ansiktsskydd. Gravida kvinnor bör vara försiktig när du hanterar etts formamid kan vara fosterskadande. - Lägg öron att formamid, mössa rören, och inkubera över natten i en torr värme bad satt till 63 ° C. Öronen kan fortfarande se lite blå efter inkubation; emellertid majoriteten av färgämnet kommer att extraheras in i formamid.
- Lägg 300 ul av varje prov, i två exemplar, till en 96-brunnsplatta. Undvik att överföra päls om den finns i provet. Säkerställ att det inte finns några bubblor i brunnarna, eftersom de kommer att påverka absorbansen behandlingen.
- Lägg 300 | il av formamid, i två exemplar, till 96 brunnar. Dessa brunnar kommer att användas som ämnen.
- Använd en spektrofotometer för mätning av absorbans vid 620 nm. Subtrahera formamid brunnar från varje prov läsning.
OBS: Alla experiment utfördes enligt protokoll som godkänts av uniformerade Services University Institutional Animal Care och användning kommittén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Djur som har genomgått analysen med framgång kommer att ha hud och ögon som visas blå. PBS sensibiliserade djur bör inte reagera på antingen PBS eller OVA utmaning, därför båda öronen bör förbli vit (Figur 1A). I OVA sensibiliserade djur, örat tar emot PBS utmaningen (vänster) bör vara antingen helt vita eller lätt blå i en lokal sätt vid injektionsstället. Örat tar emot OVA utmaningen (höger) bör bli gradvis mörkare blått under 10 min efter färg administration (Figur 1B).
PBS sensibiliserade djur kommer att få försumbara absorbansavläsningar för både PBS och OVA utmaningen (Figur 2A). För OVA sensibiliserade djur, PBS injektion resulterar vanligtvis i en genomsnittlig absorbans läsning av 0,13 och en standardavvikelse på 0,04. Omvänt, en 50 ug OVA challenge resulterar i en genomsnittlig absorbans läsning av 0,58 och en standardavvikelse på 0,18 (Figur 2B). Mängden OVA användas för utmaning kan justeras för enskilda experiment om nödvändigt. Till exempel, en 20 ^ g OVA challenge resulterar i ett genomsnittligt absorbansvärde av 0,30 och en standardavvikelse av 0,10 (Figur 2C), emellertid en utmaning mindre än 20 ^ g kan inte ge tillförlitliga resultat. Förändringar i OVA koncentrationen måste optimeras och valideras före användning.
Resultaten kan grafiskt paras med PBS absorbans jämfört med OVA absorbans. Alternativt kan resultaten ritas som ett enda värde, med PBS absorbansen subtraheras från OVA absorbansen för varje enskilt djur.
Figur 1: Öronpigmente i PBS och OVA sensibiliserade djur. (A). Öronpigmente i PBS sensibiliserade djur. Den vänstra örat (utmanas med PBS) och det högra örat (utmanades med 50 ug OVA) visar liten eller ingen färg extravasering. (B). Ear pigmentering i OVA sensibiliserade djur. Det finns ingen allergisk reaktion i det vänstra örat (utmanas med PBS), såsom indikeras av en avsaknad av blått färgämne extravasering. Det högra örat (utmanades med 50 ^ g OVA) visar en ljus blå färgning som indikerar ökad vaskulär permeabilitet, en direkt följd av cellaktivering i öronvävnaden.
Figur 2: Representant OD-värden för OVA sensibiliserade djur OD-värden som härrör från spektrofotometriska mätt vid 620 nm (A)... 50 ug OVA utmaning i PBS sensibiliserade djur. OD-värden för både PBS och OVA utmaning är försumbara. (B). 50 mikrogram OVA utmaning i OVA sensibiliserade djur. PBS challenge ger OD-värden <0,2 och OVA utmaning results i OD-värden> 0,3. (C). 20 mikrogram OVA utmaning. PBS challenge resultat i OD-värden <0.2. Rätt öron har något reducerad OD-värden på grund av en mindre utmaning dos OVA används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många markörer för allergisk sjukdom används för att bedöma styrkan av allergiska reaktioner efter allergenprovokation, inklusive förändringar i nivåer av cirkulerande histamin, Th2 cytokinproduktion och cellrekrytering till bronkoalveolär vätska i fastställandet av luftvägs utmaning. Medan övervakning av förändringar i dessa parametrar är viktiga för att studera allergiska reaktioner, behöver biologiska markörer inte alltid korrelerar med klinisk allergisk sjukdom. Den lokala anafylaxi analys som beskrivs i detta protokoll ger reproducerbar mätning av lokal vaskulär permeabilitet som korrelat för lokaliserad allergisk sjukdom. Genom att använda blått färgämne extravasation, möjliggör detta protokoll både visualisering och relativ kvantifiering av en lokal allergisk reaktion. Till skillnad från allergi-analyser som bygger på klinisk poäng, är det primära resultatet av denna analys (blått färgämne extravasation mätt med spektrofotometrisk absorbans) inte lätt utsätts för observatörs bias. En annan Advantage är att djur avlivas strax efter utmaning, begränsar obehaget eventuellt orsakas av allergen utmaning och färgämne administration. Den alternativa användningen av en handhållen spektrofotometer beskrivs av et al. Akiyama 10 möjliggör kontinuerlig mätning av förändringar i vaskulär permeabilitet. Emellertid är Evans Blue färgämne giftig, och injektion kommer slutligen att leda till djuret som behöver avlivas.
Även denna analys har ett antal styrkor, har den begränsningen att vara något tekniskt utmanande. Tillförlitliga resultat är beroende av konsekventa och framgångsrika öra och svans ven injektioner. Om hela utmaningen dosen inte administreras i örat, om örat injektion medför uppenbara punktion av ett blodkärl eller om Evans Blue intravenös injektion inte är fullständig, djuret bör undantas från analysen. I vårt laboratorium, har utredarna tvungna att öva intradermala öron injektioner för several veckor före att utveckla kunskaper. Dessutom är det viktigt att köra korrekta kontroller för analysen. Specifikt bör PBS injektionen rutinmässigt användas som en intern kontroll, som djur tycks reagera lite olika på skador orsakade av nålinförande. PBS läsning ger en grundläggande åtgärd för förändringar i vaskulär permeabilitet inducerade av själva injektionen. I stället för att använda intradermala öron injektioner kan analysen även anbringas på baksidan huden på möss. Utredarna kan finna denna väg som mindre tekniskt utmanande, och dessutom gör det möjligt för testning av flera antigener samtidigt.
Den lokala anafylaxi analysen är extremt mångsidig, eftersom utmaningen dosen kan manipuleras beroende på experimentet. Om det är nödvändigt att titta på förändringar i allergiska reaktioner, kan det vara fördelaktigt att använda en lägre OVA provokationsdos, till exempel 20 mikrogram. Detta möjliggör ökad känslighet i övervaknings förändringar i absorbans, somdet kommer att vara mindre sannolikt att mättnadspunkten för cellaktivering kommer att nås.
Dessutom kan denna analys användas för att studera passiv kutan anafylaxi (PCA). I det här läget är antigenspecifikt IgE injiceras i ena örat och fordon i den andra. 24 h senare, är djuret ges intravenös utmaning av antigen och Evans Blue färgämne. PCA-modellen kan minska den tid det tar att slutföra experimentet, det antal djur som används, och tillåter undersökare att titta på de specifika effekterna av IgE-tvärbindning.
Trots tar längre tid att utföra, det finns vissa fördelar med att använda den aktiva kutan anafylaxi (ACA) modell som beskrivs i detta dokument. Sensibilisering genom exponering i veckan på antigen härmar den process genom vilken individer utvecklar allergisk sjukdom, eftersom allergi är oftast systemiska och folk i allmänhet har både allergenspecifika IgE och IgG i omlopp. Medan IgE tvärbindning är det primära sättet att mast cell degranulering, mastceller svarar också på IgG-tvärbindning. Därför tillåter ACA modell för forskare att undersöka mekanismer för allergiska reaktioner utöver endast IgE-medierad sjukdom. Avslutningsvis, medan metoden för sensibilisering används avgörs av utredaren, är den lokala anafylaxi analysen mångsidig och kan användas med en mängd olika sensibilisering metoder.
Öron svullnad, en vanligen använd markör för bedömning av allergiska svar, kan också mätas efter OVA utmaning. Vi har funnit att öron utmanade med OVA ha betydligt mer svullnad än öron utmanade med PBS vid 1 h efter injektion. Till skillnad från Evans Blue testet har vi observerat att örontjockleken mätningar är mindre känsliga än dye extravasering och uppvisar större variation mellan utredare som örontjockleken kan förändras genom kompression av örat vid användning av mätinstrument.
Musstammar andra änBALB / c kan användas för den lokala anafylaxi analys; Men absorbansavläsningar varierar något beroende på den använda stammen. På grund av deras benägenhet att utveckla starka Th2 svar, BALB / c-möss producerar vanligtvis tillförlitliga, reproducerbara avläsningar med denna analys.
Denna analys tillåter kvantifieringen av lokaliserade allergiska svar i djur sensibiliserade mot en mängd antigener. Antigen val är flexibelt, eftersom analysen har utförts med godkänt resultat med vanliga allergen, till exempel ägg och hemocyanin från nyckelhålssnäcka (KLH). Vidare i stället för allergi, en lokal allergisk reaktion kan framkallas i en naiv djur genom att injicera antikroppar som tvärbinda IgE eller IgE-receptorer på basofiler och mastceller, eller genom ligering icke-IgE aktiverings receptorer på dessa celler såsom CD200R3 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z. Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse. The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
