Summary
Tynntarms krypten organoids dyrket ex vivo gi en vev kultur system som rekapitulerer vekst av krypter avhengig av stamceller og deres nisje. Vi etablerte en metode for å analysere den metabolske profil i sanntid i primær muse krypten organoids. Vi fant organoids opprettholde fysiologiske egenskaper som er definert av deres kilde.
Abstract
Den lille tarmslimhinnen viser en repeterende arkitektur organisert i to grunnleggende strukturer: villi, som stikker ut i tarmlumen og består av modne enterocytter, slimceller og enteroendocrine celler; krypter, og som befinner seg proksimalt til submukosa og muscularis, husing voksen stilk og progenitorceller og modne Paneth-celler, så vel som stromal og immunceller av krypten mikromiljøet. Inntil de siste årene, ble in vitro studier av tynntarmen begrenset til cellelinjer som stammer fra enten godartede eller ondartede svulster, og ikke representerer fysiologi av normale tarm epitel og påvirkning av mikromiljøet der de bor. Her viser vi en metode tilpasset fra Sato et al. (2009) for dyrking primære musetarm krypten organoids avledet fra C57BL / 6 mus. I tillegg presenterer vi bruk av krypten organoid kulturer å analysere krypten metabolsk profil i sanntid etter målling av basal oksygenforbruk, glycolytic rate, ATP produksjon og luftkapasitet. Organoids opprettholde egenskapene definert av deres kilde og beholde aspekter av deres metabolske tilpasning reflekteres av oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser. Sanntid metabolske studier på dette krypten organoid kultursystem er et kraftig verktøy for å studere krypten organoid energistoffskiftet, og hvordan det kan bli modulert av ernæringsmessige og farmakologiske faktorer.
Introduction
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA. Sporadisk tykktarmskreft - det vil si at som oppstår senere i livet (> 50 år), og med ingen klare predisponerende genetiske faktorer - står for ~ 80% av alle tilfeller med forekomsten sterkt påvirket av langsiktige kostholdet 1,2. Disse svulstene utviser en metabolsk dreining mot avhengighet av oksidativt glykolyse, kjent som Warburg effekten, som kan delvis være høyere konsentrasjoner av cellulære byggesteiner og energi tilgjengelig (gjennom glutaminolysis) for å tillate og kanskje kjøre høy forekomst av tumorcelleproliferasjon 3-5 . Studier av kreft i tykktarmen, så vel som andre gastrointestinale cancere, inkludert tynntarmen kreftformer gir viktig innsikt inn i årsaken til tumordannelse. Gransker metabolske forskjeller mellom normale, pro-tumorigene og tumorigene tilstander av gastrointestinale organsystemer kan hjelpe Fondetermination av relativ risiko for svulst utvikling samt tidlig deteksjon av neoplasi. Videre vil forstå bioenergetisk metabolisme involverer mitokondrie respirasjon og glykolyse gi grunnleggende innsikt i hvordan cellefysiologi, aldring og sykdomstilstand perturbs intestinal homeostase. Utnyttelse av bioenergi analyseteknologi for ekstracellulære flux analyse kan vurdere satsene mitokondriell respirasjon og glykolyse samtidig i celler som vokser i kultur i sanntid 6,7.
Inntil nylig, ble in vitro-studier av tynntarmen begrenset til cellelinjer avledet fra enten benigne eller maligne tumorer 8,9 og ikke representere fysiologien av normale intestinale epitel og påvirkning av mikromiljøet i hvilket de befinner seg. I 2009, Sato et al. 10 innført en ex vivo kultursystem til å vokse tre-dimensjonale (3D) mus intestinal epithelial organoids, eller epithelial "mini-guts", egnet for eksperimentelle, diagnostiske og terapeutiske undersøkelser 10,11. Videre krypter isolert fra calorically begrenset mus opprettholde sine endrede vekstegenskaper som organoids i slike kulturer 12. Sammenlignet med transformerte cellelinjer, kan krypten organoid kulturer anvendes til å generere fysiologisk relevante data som representerer en langt bedre modell for å forstå den in vivo tilstanden.
Vi tilpasset bioenergi analyse teknologi for å analysere energimetabolismen av intestinal krypten organoids. Mus intestinal krypten organoids ble dyrket ex vivo for å utvikle crypt organoid energiomsetningen studier presentert. Den oksygenforbruksrate (OCR) og det ekstracellulære surgjøring hastighet (ecar) av krypten organoids ble målt i fravær og nærvær av to forskjellige metabolske inhibitorer oligomycin (rotenon) og en ione-bærer (karbonyl-cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Krypten organisanoid metabolsk respons til disse kjemiske forbindelsene ble vellykket reflektert gjennom skiftende ecar og OCR verdier.
Cellular bioenergetisk studier vil belyse de gjensidige interaksjoner mellom metabolske tilstand og sykdomsrisiko og fenotype i kreft, fedme, diabetes, stoffskifteforstyrrelser og mitokondrielle sykdommer og hjelpe forhånd screening metoder med direkte implikasjoner for translasjonell medisin. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere tynntarms krypter og kultur krypten organoids. Dessuten introduserer vi en ny metode å bruke krypten organoid kulturer for metabolske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Komiteen for etikk av dyreforsøk i Albert Einstein College of Medicine.
1. Crypt Isolasjon og kultur
- Isolering av krypter fra tynntarmen:
- Isoler tarm krypter fra noen mus modell av interesse. Avlive musene med CO 2 etterfulgt av halshugging.
- Åpne opp buken i lengderetningen og fylle tynntarmen (SI) med iskald fosfatbufret saltoppløsning, PBS (-Ca 2+; Mg 2+) med 2x antibiotika-antimykotisk (anti-anti). Raskt isolere tynntarmen.
- Grundig dissekere fri for mesentrialfett å bruke en skalpell. Vær forsiktig med å perforere vevet - til enhver tid holde vevet fuktig med iskald PBS. Åpne opp intestine på langs og vask grundig med iskald PBS.
- Skjær tynntarmen i to seksjoner og flate ut med en våt bomullstupp, forsiktig skrape av villi hjelp av en forhåndskjølt lysbilde. Vask kraftig i iskalde PBS flere ganger.
- Inkuber 3 min i 20 ml 1 x PBS pr 3 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT) for ikke-enzymatisk dissosiering av vevet.
- Skjær vevet i små biter (2-4 mm) ved hjelp av et barberblad på en pre-avkjølt lysbilde. Overføre stykkene til et 50 ml rør inneholdende 20 ml iskald PBS.
- Pipetter opp og ned forsiktig 10x ved hjelp av en 10 ml steril engangs pipette. La vevfragmenter sedimentere av tyngdekraften. Fjern supernatanten med en pipette. Gjenta tre ganger til; sørge for at overstående er klart.
- Tilsett 20 ml PBS pr 2 mM EDTA. Swirl og inkuberes ved 4 ° C i 30 min med milde rocking.
- La vev sediment og kast supernatanten. Tilsett 15 ml iskald PBS og pipetteopp og ned 5 ganger med en 10 ml pipette. La vevfragmenter sediment og samle supernatanten som Fraksjon 1 (F1). Gjenta samle F2-F5, hver fraksjon vedlikeholdes separat.
- Tilsett 15 ml iskald PBS, og denne gangen riste kraftig for hånd i 15 sekunder. Samle F6 og gjenta for F7, F8. Hvis vev brikker begynner å flyte, trykk for å hjelpe dem å avgjøre.
- Inspisere en aliquot av hver fraksjon under mikroskopet. Pool de fraksjoner som inneholder krypter.
- Passere de samlede fraksjoner gjennom en 70 mikrometer nylon celle sil, samle krypter i en 50 ml tube.
- Sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter ved 4 ° C, supernatanten kastes og resuspender pelleten i 10 ml iskald PBS med 2x anti-anti krypter og overføre til et 15 ml rør. Gjenta vask en gang til.
- Vask krypter gang med 10 ml iskald ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
- Vask krypter gang med 10 ml ADF - 1x anti-anti.
- Tell krypter ved hjelp av en hemocytometer. Juster volumet på løsningen krypten og overføre til et 1,5 ml rør slik at den endelige konsentrasjonen krypten når resuspendert vil være 100-500 krypter pr 50 ul av geléaktige proteinblanding (Matrigel). Sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspender krypter i den geléaktige proteinblandingen.
- Plate 50 ul av krypten - geléaktige proteinsuspensjonen blanding per brønn i en 24-brønns plate (vekstområde: 2 cm 2), forsiktig å plassere suspensjonen fallet i midten av hver brønn. Oppretthold platen i en CO 2, 37 ° C inkubator i ~ 30 min før suspensjonen størkner.
- Legg 500 ul iskald komplett kulturmedium (Advanced DMEM / F12 med 1x anti - anti, 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), 1x Glutamax, 1 x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-Acetyl-L-cystein (NAC), 50 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin).
- Rekonstituer vekstfaktorer i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
- Crypt Organoid Kultur og Passage:
- Passage krypten organoids 14-21 dager etter såing (eller etter behov) som følger:
- Endre media hver fredag og mandag. På onsdager, erstatte halvparten av media med friske media.
- Fjerne kulturmediet. Vask prøven to ganger med 500 ul PBS ved 5 minutters intervaller.
- Fjern PBS og forsiktig bryte opp den geléaktige proteinblandingen ved hjelp av en steril P1000 micro pipettespissen.
- Tilsett 1 ml komplett dyrkningsmedier til en enkelt brønn og resuspender organoids i en ml media.
- Forsiktig forstyrre organoids med en P1000 ved å pipettere opp og ned 20-30x (sjekk under mikroskop for riktig organoid dissosiasjon med en god krypten avkastning til en konsekvent Teknikken er utviklet).
- Overfør krypter til en 1,5 ml mikro rør;sentrifuge ved 100 x g ved 4 ° C, 5 min.
- Vask pelleten to ganger med 1 ml komplett kulturmedier.
- Delt i et forhold på 1: 3 eller 1: 6 etter behov, nytt oppslemme krypter i 50 ul per brønn Matrigel. Fortsett som beskrevet ovenfor (pkt 1.1.16-18).
- Passage krypten organoids 14-21 dager etter såing (eller etter behov) som følger:
- Crypt Organoid Frysing:
- Fjerne kulturmediet. Vask prøven i 500 ul PBS.
- Spre den geléaktige proteinblandingen ved hjelp av en P1000 pipette.
- Tilsett 1 ml media til en enkelt brønn og resuspender organoids i en ml media.
- Forsiktig bryte opp organoids med en P1000 ved å pipettere opp og ned 20-30x.
- Overfør organoids til et 1,5 ml tube. Sentrifuger ved 100 x g ved 4 ° C, 5 min.
- Vask pelleten to ganger med 1 ml komplett kulturmedier.
- Resuspender krypter i 500 mL frysemediet.
- Overfør krypter til en kryorør, plasser røret i en frysebeholder og oppbevar i en -80 ° C fryser overnight.
- Overfør krypter til flytende N2 tank.
- Gjenopprette frosne krypten organoids ved raskt å tine i en 37 ° C vannbad. Vask med 500 ul komplett kulturmedium gang, sentrifuge ved 100 x g, 5 min og resuspender i geléaktige proteinblandingen, og kulturen som beskrevet ovenfor. For bedre utvinning, legge ROCK inhibitor (Y-27632) til frysing media.
2. Crypt Organoid Metabolism analysen
- 24-brønns plate Forberedelse:
- Isolere og telle krypter i henhold til protokollen (se kapittel 1.1 for krypten isolasjon og § 1.2 for krypten passasje).
- Resuspender krypter i geléaktige proteinblanding (100-200 crypts per 20 fil).
- Plate crypt-geléaktige proteinblanding suspensjon i en 24-brønns analyseplaten (pass på at det er minst tre paralleller for hver prøve) og la suspensjonen å stivne ved 37 ° C i en CO 2kuvøse; deretter legge til 500 mL komplett kultur media.
- Kultur krypter (som beskrevet i avsnitt 1.1) og observere etter mikroskop til krypter vokse inn fullt utviklede organoids.
- Ekstracellulær Flux analysen:
- Hydrat patronen over natten i et ikke-CO 2 (0% CO2), 37 ° C inkubator.
- Fjern kulturmediet og vaske organoids to ganger med 500 ul DMEM (uten: glukose, L-glutamin, natriumpyruviat og natriumbikarbonat, og med: fenolrødt). Vent 5 min.
- Legg 675 ul per brønn analysemedium (DMEM med 2 mM L-glutamin og 5 mM D-glukose) til hver brønn.
- Sjekk krypten organoids mikroskopisk morfologi for å sikre at organoids og den geléaktige proteinblanding er intakte etter vask. Inkuber 1 time i en ikke-CO 2, 37 ° C inkubator.
- Forbered 10 uM injiserbare forbindelser (oligomycin, karbonyl cyanid-trifluor-p-metoksy-fenyl-hydrazon (FCCP), rotenone) i analysemedium.
- Set-up kassetten ved å laste 75 mL av 10 mikrometer injiserbare forbindelser til havnene i patronen sekvensielt: Port A - oligomycin; Port B - FCCP; og Port C - (rotenon De endelige konsentrasjoner i løpet av analysen vil være 1 uM).
- Inkuber patronen 30 min - 1 time ved 37 ° C i en ikke-CO 2 inkubator.
- Samtidig slår på XF Analyzer og skape analyseprotokollen mal.
- Plasser kassetten og utility platen inn XF Analyzer og kjør "kalibrere" patron.
- Sjekk krypten organoids mikroskopisk for å sørge for at de er festet til den geléaktige proteinblanding.
- Last celle kultur plate i instrument og kjøre analyseprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crypt organoids ble etablert fra 8 måneder gamle C57BL / 6 mus matet renset gnager diett American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Tarm krypten organoids kan dyrkes i kultur i lengre perioder fra en enkelt krypten (figur 1A, enkel rød pil). Organoids vokse ut krypten-lignende strukturer i 18-20 dager i kultur (figur 1B, røde piler). Krypter ble passaged hver 3. uke og organoids effektivt restituert etter hver passering.
Seahorse bioenergi instrumentering kan vurdere priser av mitokondrie respirasjon og glykolyse samtidig i celler som vokser i kultur i sanntid. Vi tilpasset denne teknologien for å analysere krypten organoid metabolisme. Med organoids avledet fra mus ble matet AIN76A renset diett i 8 måneder, målte vi:. En oksygenforbrukshastighet, OCR vist i figur 2A - rød linje som representerer oksygenforbruksrate (pmol / min) i krypten organoids, blått er the kontrollbrønner bare med Matrigel (den geléaktige protein blanding); 2. ekstracellulære forsuring rate (ecar) vist i figur 2B - rød linje representerer ekstracellulære forsuring rate (mph / min) i krypten organoids, er blå kontrollbrønner bare med den geléaktige proteinblanding.
Figur 1:. Krypten organoids avledet fra 8-måneder gamle C57BL / 6 mus krypter er (A) 2-dager eller (B) 18-dager i kultur. Skala: 100 mikrometer.
Figur 2: Bioenergi assay ved å bruke organoids avledet fra 8-måneders gamle C57BL / 6 mus. (A) Oksygenforbruket rate (OCR) er vist;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi testet oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ecar) av krypter isolert fra 8-måneder gamle mus og vokst til organoids ex vivo. Etter måling av basaldosen, ble krypten metabolisme evaluert ved å legge oligomycin, -karbonyl cyanid -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og rotenon, sekvensielt.
Basal OCR og basal ecar ble registrert 0-29 min (Figur 2A og 2B). På den 29. minutter ble oligomycin (fra port A) injisert i hver brønn (n = 3, for både krypter og kontrollbrønner). Oligomycin er en ATP syntese hemmer. Det brukes for å hindre tilstand 3 (fosforylerende) respirasjon. Dermed oligomycin injeksjon resulterte i en svak reduksjon i OCR, på grunn av blokaden av ATP syntese i mitokondriene, og krypter byttet til glykolyse for å møte deres behov for ATP som resulterer i en økning i ecar. På 64 th min, FCCP (from port B) ble injisert i hver brønn. FCCP er en mobil ion bærer, transport av hydrogenioner på tvers av mitokondriemembranen, hvilket fører til hurtig energiforbruk uten behov for ATP generasjon. OCR økte på grunn av frakobling og ecar økt siden krypter opprettholdt sin energibalanse ved å ansette glykolyse til å generere ATP, og dermed syntetisere og sekresjon melkesyre. Ved 99 th minutter ble rotenon (fra porten C) injisert i hver brønn. Rotenon er en mitokondrie-hemmer. Dermed blir tredje injeksjon førte til en nedgang i OCR grunnet nedsatt mitokondriefunksjon og flyttet krypter til en mer glycolytic tilstand holde ecar verdiene forhøyet.
Det er to hovedkonklusjoner: 1) krypten organoids fra 8 måneder gamle mus ble dyrket med hell gjennom flere passasjer; 2) organoids som hadde blitt dyrket i kultur i 2 måneder etter derivasjon oppviste en metabolsk respons på oligomycin, cyanid karbonyl-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone og rotenon. Dermed blir glykolytisk kapasitet av organoids var stabil etter 2 måneder i kultur, i samsvar med rapporten at organoids fra calorically bundne mus blir relativt permanent tilpasset ulike vekst og metabolisme fenotyper i kultur 12.
De eksperimentelle fremgangsmåter beskrevet i denne protokollen vil være av stor betydning i metabolske undersøkelser av tarm krypter. Protokollen for krypten isolasjon er tilpasset fra Sato et al. 10 Protokollen for å studere krypten metabolisme i tynntarms krypten organoid kulturer som bruker bioenergi analyseteknologi har ikke blitt rapportert. The Crypt organoid metabolismestudier kan utvides ytterligere innføre ulike variabler til media kultur og analyse forhold, for eksempel ulike energikilder, hemmere og aktivatorer av bestemte signalering og metabolske veier, og hypoksiske tilstander som kan modulere stoffskifte.
ontent "> Det er tekniske problemer som krever spesiell oppmerksomhet når du søker disse protokollene. Crypt nummer og vekst effektiviteten i krypten organoid kulturer kan variere avhengig av krypten kilde, f.eks krypter fra genetisk endret vs. villtype mus. Dermed krypten seeding tetthet kan justeres for eksperimenter ved å kjøre en rettssak. I tillegg, krypter og organids har en sterk tendens til å feste seg til overflater. For bedre avlinger, alle rør (1,5 ml, 15 ml, og 50 ml rør), kan pipetter og pipettespisser være belagt med 1% føtalt bovint serum i fosfatbufret saltoppløsning ved 4 ° C over natten. Resultatene kan bli normalisert til total proteinkonsentrasjon ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) assay. Etter den metabolske analysen, 24-brønns plate blir holdt på is inntil BCA-analyse. For BCA-analyse, blir krypter forsiktig vasket i 500 ul kald PBS tre ganger og lysert i 75 ul 0,1 N NaOH i PBS, fulgt av kraftig rysting i 1 time ved romtemperatur. En pipette kan P1000brukes til å bryte den geléaktige proteinblanding og pipettering down up-fremmer lyse. Etter krypt lyse, kan standard BCA-analyse protokoll for cellene bli fulgt. Det er viktig å ha bare "Matrigel" kontrollbrønner i hele Bioenergi analyse for å måle bakgrunnsproteinkonsentrasjon i disse brønnene, og dermed for å vurdere krypten proteinkonsentrasjon nøyaktig ved BCA-analyse.Crypt organoid metabolismestudier som presenteres kan brukes på normal og pasient avledet epitelceller mini guts til å utforske verktøy for tidlig vurdering av relativ sykdomsrisiko og tilnærminger som kan modulere metabolsk fenotype og dermed redusere risikoen. De metabolske analysene beskrevet her innføre nye strategier for mulig evaluering av relativ risiko for sykdomsutvikling og for tidlig påvisning av sykdomstilstand, sin biokjemiske og molekylære disseksjon og potensial modulering. I sammendraget, beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere små intestinal krypter og kultur krypten organoids. I tillegg introduserer vi en ny metode å bruke crypt organoid kultur for å bestemme ekstracellulære forsuring og oksygen forbruk priser for å studere krypten organoid energiomsetningen. Ex vivo krypten organoid kultur metabolsk profilering studier vil definere nye strategier for å forstå intestinal biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen avsløringer.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet med tilskudd RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 og P3013330 fra National Institutes of Health.
Vi vil gjerne takke Michele Houston, Elena Dhima og Dr. Anna Velcich for deres verdifulle kommentarer i utviklings krypten isolasjon protokollen.
Vi takker også Diabetes Training og Research Center av Albert Einstein College of Medicine støttes av NIH P60DK20541, og Dr. Michael Brownlee og Dr. Xue-Liang Du, som styrer og driver Seahorse anlegget, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Final concentration 1x or 2x |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final concentration 1x |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final concentration 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final concentration 10 mM |
| N-acetyl-L-cysteine, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final concentration 1 mM |
| 100x N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final concentration 1x |
| 50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final concentration 1x |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final concentration 500 ng/ml |
| Recombinant Murine EGF, 100 μg | Peprotech | 315-09 | Final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant Murine Noggin, 20 μg | Peprotech | 250-38 | Final concentration 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final concentration 2 mM |
| Gibco® glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT (dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1% in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final concentration 10 μM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final concentration 1 μM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final concentration 1 μM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final concentration 1 μM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O.
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. unezde Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
