Brain myeloide celler karakterisering følgende slag kan utføres ved hjelp av optiske stereology fraksjoneringsmetoden, eller ved en strømningscytometrisk analyse av hjerne leukocytter suspensjoner. Begge er nyttige teknikker for å utføre en nøyaktig fenotypiske forskjellsbehandling av de viktigste myeloide celle undergrupper som finnes i iskemisk hjernen.
Mikroglia aktivering, samt bloduttredelse av hematogen makrofager og nøytrofile, antas å spille en sentral rolle i hjerneskade etter hjerneslag. Disse myeloide celle subpopulasjoner kan vise ulike fenotyper og funksjoner, og må skilles og preget til å studere deres regulering og bidrag til vevsskade. Denne protokollen gir to ulike metoder for hjernen immun celle karakterisering: en presis stereological tilnærming og en flowcytometrisk analyse. Den stereological tilnærming er basert på den optiske fraksjoneringsmetoden, som beregner det totale antall celler i et område av interesse (infarkt hjernen) estimeres ved en systematisk stikkprøvekontroll. Den andre karakterisering tilnærmingen gir en enkel måte å isolere hjernen leukocytt-suspensjoner, og å karakterisere dem ved flowcytometri, som åpner for karakterisering av mikroglia, infiltrert monocytter og nøytrofile av iskemisk vev. I tillegg er det også details en cerebral iskemi modell i mus som utelukkende påvirker hjernens cortex, genererer svært reproduserbare infarkter med lav dødelighet, og prosedyren for histologisk hjernen behandling for å karakterisere infarktvolum ved Cavalieri metoden.
Morfologiske, fenotypiske og genuttrykk endringer av mikroglia, samt bloduttredelse og aktivering av hematogen makrofager og nøytrofile antas å spille en sentral rolle i den patofysiologiske kaskade følgende hjerneskade 1-4. Denne protokollen gir to tilnærminger for å beregne antall forskjellige myeloid celle undergrupper av den iskemisk hjernen og å utføre sin fenotypisk karakterisering. I tillegg gir det også en beskrivelse av en eksperimentell modell av cerebral iskemi i mus, som består av den forbigående eller permanent ligation av både distal arteria cerebri media (MCA) og arteria carotis communis (CCA), inkludert hvordan å evaluere infarktet av den nøyaktige Cavalieri metode med en stereological programvare.
Den første metode for å karakterisere myeloide celleundergrupper av ischemisk hjerne er en stereological metode basert på den optiske fraksjonerings tilnærming 5. Dette er den mestbrukte stereological sonde i biovitenskap og gir en høy grad av presisjon med lave koeffisienter av feil 5-7. Dette er det beste valget for celle kvantifisering når vevet er skåret inn i seksjoner, som det unngår skjevhet på celle estimering på grunn av fragmentering av vevet inn i seksjoner. Denne metoden er en svært effektiv måte å karakterisere tall, dynamikk og fenotypiske endringer av infiltrert nøytrofile subpopulasjoner av iskemisk vev 8.
Den andre karakterisering tilnærming er basert på en modifisert protokoll fra Campanella og medarbeidere 9 som gir en enkel måte å isolere hjerne leukocytt-suspensjoner, og å karakterisere dem ved strømningscytometri. I motsetning til konvensjonelle immunhistokjemiske teknikker, flowcytometri karakterisering tillater skille mellom mikroglia (CD45 lo CD11b +) og infiltrert myeloide celler (CD45 hi CD11b +) basert på deres different uttrykk nivåer av CD45 9-13. I tillegg proinflammatoriske monocytter (CD45 hi CD11b + Ly-6G – Ly-6C hi), nøytrofile (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) og andre leukocytter undergrupper av den iskemisk vev kan skilles. Denne tilnærmingen gir en pålitelig og rask analyse for å vurdere nevroinflammasjon i eksperimentelle modeller med hjerneiskemi. Imidlertid kan behandlingen vev påvirke aktiveringstilstand, og numrene til de forskjellige cellepopulasjoner som finnes i ischemisk vev og gir en semi-kvantitativ karakterisering.
Cerebral iskemi modell introdusert her gir svært reproduserbare infarktvolum bestemmes 24-48 timer og 7 dager etter MCA ligation av ulike tilnærminger 8,15,17. Dette MCAO modellen har en lav dødelighet (mindre enn 1%) i forhold til andre, noe som minsker antall dyr som brukes i studier. Et kritisk punkt for å få denne lav dødelighet er å opprettholde riktig aseptiske forhold for å unngå infeksjoner som kan svekke overlevelse etter hjerneslag induksjon. Dette MCAO modellen kan ikke bare brukes som en permanent MCAO modell, som regnes som en klinisk relevant modell for translasjonsforskning 18, men også som en forbigående modell av forbigående ligering av CCA og MCA med en slipknot og posterior reperfusjon på ønsket tidspunkt 19. Denne metoden har blitt brukt i mus og rotter 17,20. Alt dette bevis indikerer at MCAO ved ligering er en høy allsidig modell av cerebral iskemi med flere programmer. En Critical trinn ved denne teknikk er at den krever invasiv kirurgi under et stereomikroskop; kraniotomi bør utføres svært nøye for å ikke å skade zygomatic bein samt MCA. Men bruken av narre dyr (er som utsettes for den kirurgiske fremgangsmåten, men CCA MCA og ligering utføres ikke) gir et nyttig verktøy for å diskriminere kirurgisk prosedyre avhengige effekter. Graden av hjerneskade etter denne teknikken kan kvantifiseres ved flere metoder. Vår protokoll for hjerne snitting Nissl-farging og etterfølgende beregning av volumet av Cavalieri muliggjør en nøyaktig kvantifisering av det skadede område, og reduserer antallet mus som brukes i denne type studier siden seriehjerneseksjoner kan også brukes for forskjellige immunhistokjemisk analyse. For en bedre ytelse av denne metodikken, er det avgjørende å velge de riktige parametrene som brukes i stereology programvare (tabell 1) som vil være nødvendig for å estimere the volumet av de forskjellige områder ved formelen: V = 1 / SSF * a f * t * ogOp i (SSF er stykket samplings fraksjon, t er den midlere tykkelse av seksjonene, er en f området av gitteravstanden og ogOp antall poeng treffer struktur).
Den distale MCAO ved ligering kan være nyttig for å karakterisere den infiltrerte leukocytt- og immuncelle subpopulasjoner 8,13 som deltar i den inflammatoriske prosessen etter hjerneskade 1-4. Her foreslår vi to ulike metoder for hjernen immun celle karakterisering, en presis stereological tilnærming og en flowcytometrisk analyse for bedre karakterisere flere leukocytter subpopulasjoner.
Å ta fordel av seriehjerne seksjonering, kan kvantifisering av totalt antall nøytrofile celler oppnås ved den optiske fraksjoneringsmetode 16 som beregner det totale antall celler i antallet celler samplet witha Systematisk Tilfeldig Samplet (SRS) sett med objektive virtuelle telling områder som dekker hele regionen av interesse, i vårt tilfelle infarktet regionen, med jevn avstand mellom objektive virtuelle telling mellomrom i retningene X, Y og Z. Denne metoden gir en nøyaktig verktøy for å anslå total nøytrofile tall i den ischemiske hjerne på forskjellige tidspunkter etter ligering. Selv om det ikke er vist i denne studien, kan denne protokollen også benyttes for beregning av de forskjellige nøytrofile subpopulasjoner etter iskemi 21 og for en nøyaktig kvantifisering av enhver annen cellepopulasjon som finnes i den ischemiske hjerne som andre infiltrerte leukocytter (monocytter / makrofager) og også for å estimere overlevende nevroner eller selv for neurogenesis kvantifisering etter hjerneslag. Den viktigste trinn for en nøyaktig estimering i det ønskede området er utvalget av de aktuelle parametere, som de som er vist i Tabell 3 for nøytrofil kvantifisering i den ischemiske området.Disse parameterne vil bli brukt for stereology programvare for å beregne den totale positive celletallet (N) ved å bruke ligningen N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- er det totale antall celler tellet med fraksjonatoren, er SSF delen samplings fraksjon, asf er samplingsområdet fraksjon, og TSF er samplings fraksjon tykkelse) 5. Selv om denne metoden er langsommere enn andre kvantifisering teknikker (for eksempel analyse av nøytrofile markører ved mg vev, densitometri av representative bilder eller antallet nøytrofiler i hvert felt), har den fordel å være en objektiv og en fast teknikk som gir et presist kvantifisering av celleantallet.
Hjernen leukocytt isolasjon tilnærmingen muliggjør en simultan identifisering og kvantifisering av flere immun-celle-undertyper uten behov for å forspenne system ved in vivo-farging eller genetiske manipulasjoner. Påfølgende celle sortering fra preget myeloid populations eller deres immunomagnetisk separasjon kan brukes til flere nedstrøms applikasjoner, for eksempel videre studier på genet eller protein uttrykk. Den nøyaktige karakterisering av nøytrofiler, monocytter og mikroglia oppnådd med denne metoden gir høy spesifisitet med hensyn til eksisterende metoder slik som de immunhistokjemiske studier, en fordel som gjør det mulig å fordele spesifikke funksjoner til de forskjellige myeloide celler som medierer hjernen medfødte immunrespons. I tillegg kan den forlenges ytterligere å karakterisere andre hjerne populasjoner med det passende etikett, som blodbårne makrofager (CD11b + CD45 hi CD68 +), og det kan anvendes for studium av andre CNS-sykdommer eller skader. Derfor er denne teknikken gir et viktig verktøy for å utforske heterogenitet av den inflammatoriske respons i hjernen. En hovedbegrensning av denne teknikk ligger på fremstilling av leukocytt-suspensjoner fra friskt hjernevev, som kan forandreaktiveringstilstanden til cellene eller deres antigen endring. Selv om denne teknikken gir en mer detaljert kvalitativ karakterisering i forhold til immunhistokjemiske studier gir den en mindre nøyaktig kvantifisering basert på celleisolasjon. Til tross for dette, er effektiviteten av vår celle isolasjonsprotokoll lik andre publiserte metoder 9, og den kan effektivt brukes til å detektere forskjeller i antallet av hjerneimmunceller mellom kontroll og MCAO-grupper eller til og med mellom MCAO grupper som utsettes for forskjellige behandlinger 8.
Kritiske trinn i denne protokollen er vevet disseksjon, vevet avbrudd straffeprosess og myelin fjerning. Når det gjelder vev-samlingen, kan en normaliseringstrinn bli inkludert (ved veiing av vevet oppsamlet) for å unngå variasjoner på grunn av forskjellige disseksjon forestillinger. I tillegg kan normalisering mellom forskjellige MCAO-grupper også forekomme gjennom infarktvolum (tidligere bestemt ved magnetisk Resonance). En annen måte å løse dette problemet på er å bruke hele ipsilaterale hemisfæren av både ischemiske og kontrollgruppene, eller til og med bruke den kontralaterale hemisfære av iskemisk mus som en kontroll for å minimalisere antall dyr anvendt. Selv om denne løsning unngår forskjeller mellom hver disseksjon, den har en største ulempe; en fortynningsfaktor blir tilsatt ved å øke det totale antall celler, men ikke antall myeloide celler som utelukkende ligger i kjernen og peri-infarktområder av ipsilateral korteks. Angå vev avbrudd, illustrerer denne protokollen trinnene for mekanisk forstyrrelse av hjerneceller, unngå enzymatiske behandlinger og hindrer overflateantigen endring 9,22, en viktig sak for ytterligere kvalitativ og kvantitativ analyse av betennelsesceller undergruppene. I tillegg til fremstilling av cellesuspensjonen er av interesse, er myelin fjerning fra hjerneprøver et sterkt anbefalt trinn for å unngå interferens med downstReam programmer, for eksempel immunomagnetisk celle separasjon eller flowcytometri 23,24. Dette kan oppnås ved hjelp av forskjellige metoder, for eksempel sukrose eller Percoll gradienter, eller anti-myelin-perler. Her, og basert på tidligere studier som sammenligner ulike metoder for hjernecellesuspensjon isolasjon, mekanisk avbrudd i kombinasjon med Percoll® bruk for å fjerne myelin brukes til å forbedre celleutbytte og levedyktighet 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |