Brain myeloidceller karakterisering efter stroke kan utföras med stereology med den optiska fraktioneringsmetod, eller genom en flödescytometrianalyser av hjärnan leukocyter suspensioner. Båda är användbara tekniker för att utföra en korrekt fenotypiska skillnaden av de viktigaste myeloida cellgrupper som finns i den ischemiska hjärnan.
Mikroglia aktivering, samt extravasation av hematogen makrofager och neutrofiler, tros spela en central roll i hjärnskada efter stroke. Dessa myeloida cellsubpopulationer kan visa olika fenotyper och funktioner och kunna särskiljas och karakteriseras att studera deras reglering och bidrag till vävnadsskador. Detta protokoll ger två olika metoder för hjärnan immunceller karakterisering: en exakt stereologisk strategi och en flödescytometrisk analys. Den stereologisk strategi bygger på den optiska fraktioneringsmetod, som beräknar det totala antalet celler i ett område av intresse (infarkt hjärnan) uppskattas genom en systematisk stickprov. Den andra karakterisering metod ger ett enkelt sätt att isolera hjärn leukocyt upphängningar och karakterisera dem med flödescytometri, vilket möjliggör karakterisering av mikroglia, infiltrerade monocyter och neutrofiler i ischemisk vävnad. Dessutom är det också details en cerebral ischemi modell hos möss som enbart påverkar hjärnans cortex, genererar mycket reproducerbara infarkter med en låg dödlighet, och förfarandet för histologisk hjärn behandling för att karakterisera infarktvolym av Cavalieri metoden.
Morfologiska, fenotypiska och genuttryck förändringar av mikroglia, liksom extravasering och aktivering av hematogen makrofager och neutrofiler tros spela en central roll i den patofysiologiska kaskad efter hjärnskada 1-4. Detta protokoll ger två metoder för att uppskatta antalet olika myeloid cellgrupper av den ischemiska hjärnan och att utföra sina fenotypiska karaktärisering. Dessutom ger det också en beskrivning av en experimentell modell av cerebral ischemi i möss, som består av övergående eller permanent ligering av både distala Arteria cerebri media (MCA) och den gemensamma halspulsådern (CCA), inklusive hur man utvärdera infarkt genom noggrann Cavalieri metoden i ett stereologisk mjukvara.
Den första metoden att karaktärisera myeloida cellgrupper av ischemisk hjärnan är en stereologisk metod baserad på den optiska fraktionatorn tillvägagångssätt 5. Detta är det mestvanligen används stereologisk sond i biovetenskap och ger en hög grad av precision med låga koefficienter för fel 5-7. Detta är det bästa valet för cell kvantifiering när vävnaden skärs i sektioner, eftersom den undviker bias på cell uppskattning på grund av fragmenteringen av vävnaden i sektioner. Denna metod är ett mycket kraftfullt sätt att karakterisera siffror, dynamik och fenotypiska förändringar av infiltrerade neutrofila subpopulationer av den ischemiska vävnaden 8.
Den andra karakterisering strategi bygger på ett modifierat protokoll från Campan och medarbetare 9 som ger ett enkelt sätt att isolera hjärn leukocyt upphängningar och karakterisera dem med flödescytometri. I motsats till konventionella immunhistokemiska tekniker, flödescytometri karakterisering tillåter differentiering mellan mikroglia (CD45 lo CD11b +) och infiltrerade myeloidceller (CD45 hi CD11b +) baserat på deras difftekniker när expressionsnivåer av CD45 9-13. Dessutom proinflammatoriska monocyter (CD45 hi CD11b + Ly-6G – Ly-6C hi), neutrofiler (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) och andra leukocyter delmängder av den ischemiska vävnaden kan urskiljas. Denna metod ger en tillförlitlig och snabb analys för att bedöma neuroinflammation i experimentella modeller av hjärnischemi. Emellertid kan vävnadsbehandling påverka aktiveringstillstånd och numren på de olika cellpopulationer som finns i den ischemiska vävnaden tillhandahåller en semi-kvantitativ karakterisering.
Den cerebral ischemi modellen introducerades här ger mycket reproducerbara infarkt volymer bestäms 24-48 timmar och 7 dagar efter MCA ligation av olika metoder 8,15,17. Denna kortex modellen har en låg dödlighet (mindre än 1%) jämfört med andra, minimera antalet djur som används i studier. Ett kritiskt steg för att få denna låga dödligheten är att upprätthålla korrekta aseptiska förhållanden för att undvika infektioner som kan försämra överlevnaden efter stroke induktion. Denna kortex modellen kan inte bara användas som en permanent kortex modell, vilket anses vara en kliniskt relevant modell för translationell forskning 18, men också som en övergångsmodell genom transient ligering av CCA och MCA med en slipknot och bakre reperfusion vid önskad tidpunkt 19. Denna metod har använts framgångsrikt i möss och råttor 17,20. Allt detta pekar på att kortex genom ligering är en hög mångsidig modell av cerebral ischemi med flera program. En critical steg med denna teknik är att den kräver invasiv kirurgi under ett stereomikroskop; kraniotomi bör utföras mycket noggrant så att inte skada okbenet samt MCA. Men användningen av simulerade djur (är som utsätts för det kirurgiska ingreppet, men CCA och MCA ligation inte utförts) ger ett användbart verktyg för att diskriminera kirurgiska ingrepp beroende effekter. Omfattningen av hjärnskada efter denna teknik kan kvantifieras genom flera metoder. Vår protokoll av hjärnsektione, Nissl färgning och efterföljande uppskattning av volymen av Cavalieri möjliggör en exakt kvantifiering av den skadade regionen och minimerar antalet möss som används i denna typ av studier eftersom seriehjärnsektioner kan också användas för olika immunhistokemisk analys. För en bättre prestanda för denna metod, är det viktigt att välja lämpliga parametrar som används i stereology programvara (tabell 1) som kommer att vara nödvändiga för att uppskatta the volymen för de olika regionerna av formeln: V = 1 / ssf * en f * t * ap I (SSF är den skiva samplingsfraktionen, T är den genomsnittliga tjockleken av sektionerna, är en fi området för rutnätet och ap antalet punkter slår strukturen).
Den distala kortex genom ligering kan vara användbart för att karakterisera infiltrerade leukocyter och immun cellsubpopulationer 8,13 som deltar i den inflammatoriska processen efter hjärnskada 1-4. Här föreslår vi två olika metoder för hjärnan immunceller karakterisering, en exakt stereologisk strategi och en flödescytometrisk analys för att bättre karakterisera flera leukocyter subpopulationer.
Med utnyttjande av seriehjärnsektione, kan kvantifiering av det totala antalet neutrofiler uppnås genom den optiska fraktionatorn metoden 16, som uppskattar det totala antalet celler från antalet celler samplade withektar Systematiskt slumpmässigt utvalda (SRS) uppsättning objektiva virtuella räknings utrymmen som täcker hela regionen av intresse, i vårt fall infarktområdet, med jämnt avstånd mellan objektiva virtuella räknings utrymmen i riktningen X, Y och Z. Denna metod ger en korrekt verktyg för att uppskatta totala neutrofila nummer i den ischemiska hjärnan vid olika tidpunkter efter ligering. Även om det inte har visats i denna studie, kan detta protokoll också användas för uppskattning av de olika neutrofila subpopulationer efter ischemi 21 och för en exakt kvantifiering av varje annan cellpopulation som finns i den ischemiska hjärnan liksom andra infiltrerade leukocyter (monocyter / makrofager) och även för att skatta överlevande nervceller eller ens för neurogenes kvantifiering efter stroke. Det viktigaste steget för en korrekt uppskattning i önskat område är valet av lämpliga parametrar, som de som visas i tabell 3 för neutrofil kvantifiering i ischemiska området.Dessa parametrar kommer att användas för den stereology programvara för att beräkna det totala positiva cellen antalet (N) genom att använda ekvationen N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- är det totala antalet räknade celler med fraktionatorn är SSF avsnittet samplingsfraktionen, asf är samplingsfraktionen området, och TSF är samplingsfraktionen tjocklek) 5. Även om denna metod är långsammare än andra kvantifiering tekniker (till exempel analys av neutrofila markörer genom mg vävnad, densitometri representativa bilder eller antal neutrofiler per fält), har den fördelen att vara en opartisk och en solid teknik som ger en exakt kvantifiering av cellantal.
Hjärnan leukocyt isolerings tillvägagångssätt möjliggör en samtidig identifiering och kvantifiering av flera immuncell subtyper utan att behöva belasta systemet genom in vivo färgning eller genetiska manipulationer. Efterföljande cellsortering från karakteriseras myeloisk populations eller deras immunomagnetisk separation kan användas för tillämpningar flera nedströms, såsom ytterligare studier på gen- eller proteinuttryck. Den exakta karakterisering av neutrofiler, monocyter och mikroglia erhålls med denna metod ger hög specificitet med avseende på befintliga metoder såsom immunhistokemiska studier, en fördel som gör att tilldela specifika funktioner till de olika myeloida celler som förmedlar hjärnans medfödda immunsvar. Dessutom kan den förlängas ytterligare för att karakterisera andra hjärn populationer med lämplig etikett, liksom blodburna makrofager (CD11b + CD45 hej CD68 +), och den kan tillämpas för att studera andra CNS patologier eller skador. Därför denna teknik ger ett viktigt verktyg för att utforska heterogenitet det inflammatoriska svaret i hjärnan. En huvud begränsning av denna teknik befinner sig på förberedelserna av leukocyt suspension från färsk hjärnvävnad, vilket kan förändraaktiveringstillstånd av cellerna eller deras antigen förändring. Även om denna teknik möjliggör en mer detaljerad kvalitativ karakterisering jämfört med immunhistokemiska studier, ger det en mindre exakt kvantifiering baserad på cellisolering. Trots detta, liknar andra publicerade metoder 9 effektiviteten i vår cellisolering protokoll och den kan effektivt användas för att upptäcka skillnader i antalet hjärnimmunceller mellan kontroll och kortex grupper eller ens mellan kortex grupper som utsätts för olika behandlingar åtta.
Kritiska steg i detta protokoll är vävnaden dissektion, störningar vävnadsförfarandet, och myelin borttagning. När det gäller vävnadssamling, kan en normalisering steg ingå (genom vägning vävnaden samlas in) för att undvika variationer på grund av olika dissektion föreställningar. Dessutom kan normalisering mellan olika kortex grupperna också ske genom infarktvolym (tidigare bestäms av Magnetic Resonance). Ett annat sätt att lösa detta problem är att använda hela ipsilaterala halvklotet av både ischemiska och kontrollgrupper, eller ens använda den kontrahjärn ischemisk musen som en kontroll för att minimera antalet djur som används. Även om detta tillvägagångssätt undviker skillnader mellan varje dissektion, den har en största nackdelen; en utspädningsfaktor sättes genom att öka det totala antalet celler, men inte antalet myeloidceller som uteslutande är belägna i kärn och peri-infarkt områden av den ipsilaterala cortex. Beträffande störningar vävnad, illustrerar detta protokoll stegen för den mekaniska störning av hjärnceller, undvika enzymatiska behandlingar och förebyggande ytantigen förändring 9,22, en viktig fråga för ytterligare kvalitativ och kvantitativ analys av de inflammatoriska cellsubpopulationer. Utöver förberedelserna av cellsuspensionen av intresse, är myelin avlägsnande från hjärnprover ett starkt rekommenderat steg för att undvika störningar med downstream applikationer, såsom immunomagnetisk cellseparation eller flödescytometri 23,24. Detta kan åstadkommas med hjälp av olika metoder, såsom sackaros eller Percoll gradienter, eller anti-myelin pärlor. Här, och baserat på tidigare studier som jämför olika metoder för hjärncell fjädring isolering, mekanisk störning i kombination med Percoll användning för att avlägsna myelin används för att förbättra cellutbyten och livskraft 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |