Summary
Diermodellen van pediatrische ziekte vroeg begin en agressieve ziekteprogressie ervaren. Klinisch relevante afgifte van therapie aan jonge muismodellen kan zijn technisch moeilijk. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve werkwijze voor intraveneuze injectie pasgeboren muizen binnen de eerste twee dagen postnatale leven.
Abstract
Intraveneuze injectie is een klinisch toepasbare wijze therapeutica leveren. Voor volwassen knaagdieren en grotere dieren, intraveneuze injecties zijn technisch haalbaar en routine. Echter, sommige muismodellen vroeg begin van de ziekte met een snelle progressie dat toediening van mogelijke therapieën bemoeilijkt hebben. De tijd (of gezicht) ader anterieure oordopje in muizen en duidelijk zichtbaar is voor de eerste twee dagen na de geboorte aan weerszijden van de kop met een dissectie microscoop. Tijdens dit venster kan de temporale ader worden geïnjecteerd met volumes tot 50 pl. De injectie is veilig en goed verdragen door zowel de pups en de dammen. Een typerende injectieprocedure voltooid binnen 1-2 min, waarna de pup terug naar hun kooi. Door de derde postnatale dag de ader is moeilijk te visualiseren en de injectie procedure wordt technisch onbetrouwbaar. Deze techniek is gebruikt voor aflevering van adeno-geassocieerd virus (AAV) vectors, waardoor nagenoeg de gehele body, stabiele expressie van transgenen kan voor de levensduur van het dier, afhankelijk van het virale serotype gekozen.
Introduction
Levering van therapieën voor het centrale zenuwstelsel (CNS) in muismodellen van pediatrische ziekte blijft een uitdaging. Muizen die model pasgeboren ziektetoestanden zijn ondermaats en ontwikkelingsgebied onvolwassen en daarom moeilijk direct te injecteren in relevante structuren in het CZS. Intravasculaire injectie van therapeutische middelen is een niet-invasieve, goed verdragen methode cellen, drugs of virale vectoren leveren aan het hele lichaam inclusief het CZS 1-5 en retina 3,5-9. Vorige publicaties beschrijven temporale gezicht ader injectie met behulp van een transilluminator 10,11, zonder een dissectie microscoop 11,12, of waarbij twee personen om te injecteren 10. De in dit protocol beschreven injectietechniek is voordelig omdat een enkel individu pups kunnen injecteren, en de lichtbron om te bekijken de temporale ader wordt niet aanraken van de pup, waardoor de noodzaak voor chirurgische tape of de bevestiging van een pup op vaste ondergrondzoals een transilluminator 11. Aflevering van adeno-geassocieerde virale vector serotype 9 (AAV9) bij muizen produceert robuuste expressie in neuronen en astrocyten gehele hersenen en ruggenmerg (figuur 1). Intravasculaire levering van virale vectoren in de oppervlakkige temporale gezicht ader is betrouwbaar die in verschillende studies in neonatale muizen om de pediatrische neuromusculaire aandoening Spinale musculaire atrofie (SMA) 2,4,13,14 behandelen en uiteindelijk meer de levensduur van de behandelde muizen.
Intravasculaire injectie van pasgeboren muizen ook effectief richt het perifere zenuwstelsel en perifere organen (figuur 2). Na injectie van AAV is transductie van dorsale wortel ganglia, lever, hart, skeletspier, long en myenterische plexus van de darm waargenomen 1,3,6,7,15. Wijdverspreide transductie van de CNS en periferie maakt deze methode van injectie ideaal voor ziekten waarbij wereldwijde uiting vaneen transgen, zoals de ziekte van Gaucher 16 en andere lysosomale stapelingsziekten 17,18, de ziekte van Batten en verwante neuronale ceroid lipofuscinosen, 19 en Bardet-Biedl syndroom, een genetische stoornis in met begin van symptomen Tijdens de vroege kindertijd 20. Intravasculaire injectie in neonatale muizen moeten worden beschouwd als een nieuwe werkwijze modelleren systeembrede kinderziekten. Deze techniek is vertaald grotere diermodellen 5,21 en intravasculaire injectie bestaat als klinisch aanvaardbare werkwijze voor het afgeven therapeutica.
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte methode van het leveren van agenten om neonatale muizen door de oppervlakkige temporale gezicht ader uiterlijk postnatale dag 2. Injectie kan worden ingevuld door een enkele, oefende individueel en wordt goed verdragen door zowel de pups en de dammen. Pups ervaren minimale nood en snel te herstellen. ImportanTLY, zal succesvolle injectie resulteren in wereldwijde levering van het middel toegediend. Dit protocol is geschikt voor afgifte van virale vectoren, farmaceutische middelen of cellen pasgeboren muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in het protocol genoemde procedures zijn goedgekeurd Institute for Animal Gebruik en onderhoud van de commissie (IACUC) van de Ohio State University.
1. Voorbereiding van de Workspace
- Verzamel nat ijs de muis pups verdoven, een lege kooi aan de dam uit het nest, een dissectie microscoop, een lichtbron die kan worden geplaatst onder een hoek op de injectie (gebruik van een lichtbron bij 90 ° scheiden hoek de injectieplaats verduistert de ader), een schoon oppervlak om het dier voor de injectie plaats, wattenstaafjes, 3/10 cc insulinespuit met 3/8 "30 G naald (één per dier) en 1% Evans Blue Dye ( die met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) oplossing voor training.
- Verwijder de dam om een aparte kooi, terwijl het manipuleren van de pups.
2. Injectie Procedure
- Plaats één pup direct op het natte ijs gedurende 30-60 sec om het dier te verdoven. Niet t vertrekkenhij dier op het ijs te lang te wijten aan een risico op onderkoeling gerelateerde complicaties zoals ventrikelfibrilleren, weefsel hypoxie en metabole acidose.
NB: Onze ervaring is dat 30-60 seconden voldoende is om de pup langzame bewegingen om voor injectie. Indien diepere anesthesie noodzakelijk kan inhalatiemiddelen zoals 1-2% isofluraan geschikt. - Terwijl het dier op het ijs, laadt u de spuit met 30 ul van Evans blauwe kleurstof.
- Wanneer het dier volledig verdoofd bevestigd door gebrek aan beweging op het ijs terwijl ademen, bewegen onder de microscoop. Voor een rechtshandige injectie, geconfronteerd met de snuit van het dier aan de rechterkant. Plaats de linker wijsvinger op de snuit en de linker middelvinger caudaal van het oordopje zodat de oordop is tussen de wijs- en middelvinger (Figuur 1).
- Onderzoeken anterieure het oordopje voor een oppervlakkige capillaire die beweegt wanneer de huid wordt gemanipuleerd. Deze capillaire is NIET het doel, maarIdentificatie is belangrijk voor het temporeel ader identificatie. Zoek vervolgens naar een donkere, schimmige ader inferieur aan de capillaire dat blijft vast ongeacht huid positie. De temporale ader verschijnt schimmige, loopt dorsale ventrale, en voedt in de halsader (Figuur 1).
- Voer de temporale ader met de naald schuine up. Indien correct geplaatst, is het mogelijk om te bekijken de naald schuine rand vullen met bloed door de huid. Druk vervolgens de zuiger langzaam en note blancheren van de ader langs de zijkant van het gezicht.
- Laat de naald naar binnen de ader blijven voor een extra 10-15 sec om terugstromen van de injectiemiddel voorkomen.
3. Post-injectie
- Na een goede injectie dient de pup bijna onmiddellijk blauw. Verwijder de naald en gebruik zachte kracht om een wattenstaafje toepassing op de injectieplaats tot bloedstolling.
- Bewaken van de pup voor tekenen van nood. Laat de pup 2-3 min om te herstellen en rewarm, recognize wanneer de pup bij bewustzijn is, rechtop en bewegen, alvorens terug te keren naar de kooi. Cup de pups in gehandschoende handen van de onderzoeker om passende warmte om te helpen bij het herstel indien nodig te voorzien. Als alternatief kunt u een verwarmingselement onder de kooi te vergemakkelijken opwarming van de geïnjecteerde pup. Meestal na een Evans blauwe kleurstof injectie, euthanaseren pups. Neem geen kleurstof bij het injecteren testmateriaal.
- Plaats de pup terug in de kooi en zorgen voor de pup is bedekt met beddengoed en / of nestlet om reacceptance verzekeren door de dam.
- Gebruik een nieuwe spuit en wattenstaafje voor elke pup om steriliteit te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens een juiste injectietechniek, moet de ader even draaien duidelijk of blancheren. Als het injecteren kleurstof het gehele pup moet blauw worden binnen enkele seconden. Als een onjuiste injectie heeft plaatsgevonden, is er vaak een geconcentreerde subcutane bolus in het hoofd of de nek en geïnjecteerde lekken uit de injectieplaats. Onjuiste injecties kunnen ook resulteren in het ontstaan van blauwe plekken rond de keel. Pups die subcutane injecties ontvangen (dat wil zeggen de injectie was niet volledig geleverd in de ader) in het algemeen ondervinden geen nadelige bijwerkingen en routinematig reageren op de behandeling als de juiste manier ingespoten muizen te doen.
Afhankelijk van de afgegeven therapie kunnen succesvolle injectie tot wijdverspreide afgifte aan de centrale en perifere organen. Bij het injecteren zelf een gratis adeno-geassocieerd virus serotype 9, waarmee het groen fluorescerend eiwit (GFP) met een kip β-actine hybride promotor (CB) (samen aangeduid als "scAAV9 CB GFP"), transgenexpressie is gevonden in gliacellen en neuronen over meerdere gebieden van de hersenen en in het ruggenmerg (de figuren 2A-2C). Intravasculaire injectie van scAAV9 CB GFP ook resulteert in wijdverspreide expressie gedurende de periferie, met merkbare expressie in hart en leverweefsel (Figuren 3A-3D).
Figuur 1: (A) een geïmproviseerde injectie platform gemaakt van een absorberend kussen ("luier") rond een Styrofoam rack 50 ml conische verpakking. Het platform stelt de onderzoeker om hun hand op de tafel naast het platform rust. Hierdoor kan de onderzoeker aan de injectie uit te voeren op een vlakkere hoek ten opzichte van de muis pup. (B) Afbeelding toont pup immobilisatie tussen de voorste en middelste vingers. (
Figuur 2: Centraal zenuwstelsel genexpressie volgende pasgeborene intraveneuze injectie van zelf complementaire AAV9 uiten van groen fluorescerend eiwit (GFP scAAV9 CB) postnatale dag 1 (P1) muis pups werden intraveneus geïnjecteerd met 1 x 10 11 vector genoom (vg) van zelf. complementaire (sc) scAAV9 CB GFP. Vier weken na injectie werden de muizen opgeofferd en geperfuseerd met 4% paraformaldehyde. Weefsels werden verzameld, gesneden en gekleurd voor GFP expressie. GFP expressie wordt gezien tijdens de hersenen zoals de voorste striatum (A) through de pons en het cerebellum (B). GFP positieve cellen typisch neuronen en astrocyten. GFP expressie wordt ook gedetecteerd in het ruggenmerg (C). Spinale motorische neuronen en dorsale wortel ganglia neuronen worden efficiënt getransduceerde behulp pasgeborene IV levering. GFP positieve vaatstelsel en astrocyten zijn ook te zien in de hele wervelkolom grijze stof. Alle schaal bars = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: GFP expressie in perifere organen na neonatale intraveneuze injectie van zelf complementaire AAV9 GFP (scAAV9 CB GFP) GFP immunofluorescentie detecteerbaar in de volwassen muizenhart (A) en de lever (C). (B) en de lever (D) van de geïnjecteerde muizen. Alle schaal bars = 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravasculaire afgifte van middelen aan het CNS of het hele lichaam moeilijk in neonatale muizen modellen van ziekte. De beschreven protocol is een snelle, relatief niet-invasieve manier intraveneus oplossingen in neonatale muizen met minimale uitrusting vereisten beheren. Hoewel de temporele gezicht ader kan worden bekeken met het blote oog kunnen injecties grotere nauwkeurigheid hebben met het gebruik van de microscoop en vezeloptische lichtbron, met name voor een ongeoefende injector. Intravasculaire injectie in neonatale muizen een hoog slagingspercentage 12 en AAV transductie is waargenomen bij vroege pups zelfs als een deel van het injectiemiddel subcutaan toegediend. De injectie wordt goed verdragen door de muis pups en dammen op FVB / N of C57BL / 6 achtergrond tolereren manipulatie van de pups goed. Echter, in zeldzame gevallen dammen kan hele nesten te vernietigen. Deze injecties kunnen met succes worden uitgevoerd bij muizen zo klein als 0,8 g tot 1,6 g. Alternatieve injection routes voor pasgeboren muizen zijn gepubliceerd door ons en anderen, inclusief retro-orbitaal, intrajugular en intraperitoneale 10,15,22. Wij prefereren de injectie route beschreven omdat het klinisch relevant, kan worden uitgevoerd door een enkele experimentator zonder speciale apparatuur vereisten en maakt diverse volumes toegediend.
Een veel voorkomend probleem ervaren bij het uitvoeren van injecties is moeilijk het bekijken van de temporale ader en dus onjuiste plaatsing van de naald. De fiber-optic lichtbron moet worden geplaatst op <90 ° en stralende neerwaarts op de kop toen aangehouden voor de beste weergave van de ader. Injectoren moet de tijd nemen om de lichtbron aan te passen aan hun behoeften. Temporal ader waarneming significant verlaagd als pups te groot, gekenmerkt ouder dan P2 of groter dan 2,0 g. Een tweede probleem kan worden om te bepalen of de naald schuine de ader is aangegaan. De temporale gezicht ader is SuperFiciële, dus zorg moet worden genomen om te voorkomen dat het invoeren van onder de ader. Ervoor zorgen dat de naald afschuining is het invoeren van parallel aan de ader wordt voorkomen dat aanprikken door de ader. Plaatsing van de naald wordt best gecontroleerd door langzame injectie en de daaropvolgende blancheren van de ader.
De oppervlakkige temporale ader zichtbaar aan weerszijden van de weg. Linkshandige mensen kunnen vinden dat tegenover het dier naar links van de onderzoeker kan ergonomisch beter zijn en moet worden bepaald voor elke individuele onderzoeker. Indien de ader niet zichtbaar of mistargeted bij eerste pogingen gericht op de ader aan de andere kant van de kop geschikt. Wanneer de ader wordt aangeprikt aan beide zijden van het hoofd, kan enige lekkage optreden door de eerste plaats tijdens de injectie in de tweede plaats. Afhankelijk van de werkafstand van de microscoop, kan het aangewezen zijn een klein platform waarop het dier te injecteren te bouwen; bijvoorbeeld een lege container Styrofoam 50 ml conischebuis verpakking (figuur 1). Hierdoor kan de onderzoeker het dier nabij de rand van het platform te positioneren zodat injecteren hand van de onderzoeker direct rusten op de tafel. Dit kan de hoek van binnenkomst in de ader te verbeteren en de lichte obstructie.
Er zijn een aantal beperkingen aan de bruikbaarheid van het protocol dat injectievolume, leeftijd venster voor injecties en de onvoorspelbaarheid van de dam respons. Injectievolumes voor pups zijn beperkt tot 50 pi. We hebben eerder geteste dieren blijven met 100 ul, maar steeg injectie gerelateerde sterfte hebben waargenomen in vergelijking met lager volume injecties, maar anderen melden succes leveren van 100 ul 10,12. Verder is gesuggereerd dat meer injectievolume de bloedhersenbarrière 23 kan beschadigen. Vaak de experimentele reagens gemengd met PBS tot een constante 50 ul injectievolume handhaven. We zijn niet op de hoogte van studies examining het effect van injectie volume verspreid over de pasgeborene muizen en empirische studies worden uitgevoerd om effecten op injectievolume nieuwe reagentia identificeren een gegeven dosis. Een tweede beperking is dat de oppervlakkige temporale ader is goed zichtbaar op de eerste en tweede postnatale dagen. Wijzigingen in de omvang dier, pigmentatie van de huid en de dikte combineren om de ader te verduisteren op latere leeftijd terwijl anderen melden met de toegang tot ader door postnatale dag 6 10,12. Als alternatief hebben we gebruik echogeleide cardiale injecties om virale vector te leveren aan de bloedsomloop in P5 en P10 dieren 4. Ten slotte is de acceptatie van de muis dammen van de procedure is onvoorspelbaar. We hebben behandeld FVB / N, C57BL / 6 en B6SJL muizen over muismodellen van neuromusculaire ziekte en autisme spectrum stoornissen. FVB / N muizen zijn de meest tolerante terwijl stammen op de C57BL / 6 achtergrond af en toe kan vernietigen individuele pups of hele nesten, maar dit een zeldzame gebeurtenis. Echtermoet een overweging zijn bij de planning voor voldoende n voor een experiment. Dam aanvaarding kan verder worden beïnvloed door wat de ziekte de muis stam is modelleren. Bijvoorbeeld, een model van een autisme spectrum stoornis een veel hogere pup afwijzing dan verwacht op basis van de achtergrond stam. Het bevorderen van pups kan een overweging zijn als dam acceptatie is een punt van zorg. Andere benaderingen om afstoting te beperken zijn onder meer het uitvoeren van injecties in een aparte ruimte van de dam om de toegang te beperken tot ultrasone geluiden Pup, en wrijf de neus van de dam en / of de pups met een vochtige doek met 70% ethanol aan elke onderzoeker geur te maskeren. Pups moeten ook worden ingewreven met vuile beddengoed om te helpen bij de acceptatie.
Dit protocol is met succes gebruikt om een muismodel van SMA behandelen. SMA is een pediatrische neurodegeneratieve ziekte die vooral van invloed op lagere motorische neuronen van het ruggenmerg. Zonder behandeling, dit muismodel sterft door 15 dagen na de geboorte gemiddeld. After intraveneuze injecties van AAV gentherapie in 1 dag oude muizen, werd de overleving verlengd tot een jaar, het aantonen van de veiligheid en verdraagbaarheid van de beschreven injectieprotocol 2,4,14. Soortgelijke resultaten werden ook verkregen op dezelfde SMA muismodel na IV injectie van antisense oligonucleotiden 8,9. Toekomstige toepassingen omvatten het aanbieden van andere cel- en gentherapie, evenals het creëren van neonatale modellen voor ontwikkelingsstoornissen van het CZS en de periferie naar exogeen drukken een cDNA of RNAi cassette 24. Intraveneuze injectie is een goedgekeurde klinische wijze van levering; Daarom kan het gebruik van deze techniek voordelig preklinische studies voor diverse agentia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de NINDS, FightSMA en Families van SMA erkennen voor financiële steun. Segl wordt ondersteund door NINDS training subsidie # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
- Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
- Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
- Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
- Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
- Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
- Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
- Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
- Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
- Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
- Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).
