Summary
Modelli animali di malattia pediatrica possono sperimentare insorgenza precoce e la progressione della malattia aggressiva. Erogazione di una terapia clinicamente rilevanti per modelli giovani del mouse può essere tecnicamente difficile. Questo protocollo descrive un metodo di iniezione endovenosa non invasivo per topi neonati entro i primi due giorni di vita postnatale.
Abstract
L'iniezione endovenosa è un modo clinicamente applicabile per fornire terapie. Per i roditori adulti e animali più grandi, iniezioni endovenose sono tecnicamente fattibili e di routine. Tuttavia, alcuni modelli di mouse possono avere insorgenza precoce della malattia, con una progressione rapida che rende la somministrazione di potenziali terapie difficile. La vena temporale (o facciale) è appena anteriore alla auricolare nei topi ed è chiaramente visibile per i primi due giorni dopo la nascita su entrambi i lati della testa utilizzando un microscopio da dissezione. In questa finestra, la vena temporale può essere iniettato con volumi fino a 50 microlitri. L'iniezione è sicuro e ben tollerato sia dai cuccioli e le dighe. Una tipica procedura di iniezione è completata entro 1-2 minuti, dopo di che il cucciolo viene restituito alla gabbia a casa. Con il terzo giorno dopo la nascita la vena è difficile da visualizzare e la procedura di iniezione diventa tecnicamente inaffidabile. Questa tecnica è stata utilizzata per la consegna del virus adeno-associato (AAV) vectRUP, che a loro volta possono fornire, espressione del transgene stabile quasi scala corpo per la vita dell'animale a seconda del sierotipo virale prescelto.
Introduction
Consegna di terapie del sistema nervoso centrale (SNC) in modelli murini di malattia pediatrica rimane una sfida. I topi che modello patologie neonatali sono sottodimensionati e in maniera immatura, e quindi può essere difficile da iniettare direttamente in strutture adeguate all'interno del sistema nervoso centrale. Iniezione intravascolare di agenti terapeutici è un non-invasiva, metodo ben tollerato per fornire cellule, droghe, o vettori virali per tutto il corpo, compreso il sistema nervoso centrale e della retina 1-5 3,5-9. Pubblicazioni precedenti descrivono temporale iniezione faccia vena utilizzando un transilluminatore 10,11, senza un microscopio dissezione 11,12, o che richiedono due individui a iniettare 10. La tecnica di iniezione descritto in questo protocollo è vantaggioso perché un singolo individuo può iniettare cuccioli, e la sorgente di luce per visualizzare la vena temporale non tocca il cucciolo, eliminando la necessità di nastro chirurgico o l'attacco di un cucciolo di una superficie fissacome un transilluminatore 11. Consegna di adeno-associato vettore virale sierotipo 9 (AAV9) nei topi produce robusta espressione nei neuroni e astrociti in tutto il cervello e il midollo spinale (Figura 1). Consegna intravascolare di vettori virali nella superficiale vena facciale temporale è stato utilizzato in modo affidabile in vari studi in topi neonati per trattare il disturbo neuromuscolare pediatrica Atrofia Muscolare Spinale (SMA) 2,4,13,14 e, infine, ha aumentato la durata della vita dei topi trattati.
Iniezione intravascolare di topi neonati anche gli obiettivi in modo efficace il sistema nervoso periferico e organi periferici (Figura 2). Dopo l'iniezione di AAV, trasduzione dei gangli spinali, fegato, cuore, muscolo scheletrico, del polmone e del plesso mioenterico dell'intestino è stato osservato 1,3,6,7,15. Trasduzione diffusa del SNC e della periferia rende questo metodo di iniezione ideale per le malattie che richiedono espressione globaleun transgene, come la malattia di 16 e di altre malattie da accumulo lisosomiale di Gaucher 17,18, la malattia di Batten e relativi lipofuscinoses ceroid neuronali, 19 e la sindrome di Bardet-Biedl, una malattia multisistemica genetico con insorgenza dei sintomi che si verificano nella prima infanzia 20. Iniezione intravascolare in topi neonatale dovrebbe essere considerato come un nuovo metodo di malattie pediatriche modellazione a livello di sistema. Questa tecnica è stato tradotto in modelli animali di maggiori dimensioni 5,21 e l'iniezione intravascolare esiste già come un metodo clinicamente accettabile di fornire terapie.
L'attuale protocollo descrive un metodo semplice e efficace di diffondere agenti a topi neonati attraverso il volto superficiale vena temporale entro e non oltre postnatale giorno 2. iniezione può essere completato da un singolo, praticata individuale ed è ben tollerato sia dai cuccioli e le dighe. Pups sperimentano disagio minimo e recuperare rapidamente. ImportanTLY, iniezione di successo si tradurrà nella consegna globale dell'agente somministrato. Questo protocollo è appropriato per la consegna di vettori virali, agenti farmaceutici o cellule di topi appena nati.
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Protocol
Tutte le procedure elencate nel protocollo sono stati approvati Istituto per uso animale e del comitato Care (IACUC), della Ohio State University.
1. Preparazione del lavoro
- Raccogliere ghiaccio, per anestetizzare i cuccioli di topo, una gabbia vuota per separare diga dalla lettiera, un microscopio da dissezione, una fonte di luce che può essere posizionato in un angolo per l'iniezione (uso di una sorgente di luce a 90 ° angolo rispetto al sito di iniezione oscura la vena), una superficie pulita per posizionare l'animale per l'iniezione, tamponi di cotone, 3/10 cc siringa da insulina con 3/8 "30 ago G (uno per animale) e l'1% Evans Blu Dye ( fatta con) una soluzione tampone fosfato salino (PBS) per la formazione.
- Rimuovere la diga di una gabbia separata, mentre la manipolazione dei cuccioli.
Procedura 2. Iniezione
- Posizionare un cucciolo direttamente sul ghiaccio umido per 30-60 secondi per anestetizzare l'animale. Non lasciare tegli animali sul ghiaccio troppo a lungo a causa di un rischio di complicanze legate ipotermia, tra cui la fibrillazione ventricolare, ipossia tissutale e acidosi metabolica.
NOTA: La nostra esperienza è che 30-60 secondi è sufficiente a rallentare i movimenti cucciolo per consentire l'iniezione. Se è necessaria l'anestesia profonda, inalanti, come 1-2% isoflurano può essere opportuno. - Mentre l'animale è sul ghiaccio, caricare la siringa con 30 ml di Evans colorante blu.
- Quando l'animale è completamente anestetizzato, confermata dalla mancanza di movimento sul ghiaccio mentre ancora respirando, spostarlo al microscopio. Per un'iniezione mano destra, di fronte il muso dell'animale a destra. Posizionare il dito indice sinistro sul muso e la caudale dito medio sinistro per il cuscinetto auricolare in modo che il cuscinetto auricolare è tra l'indice e il medio (Figura 1).
- Esaminare solo anteriore per il cuscinetto auricolare per una capillare superficiale che si muove quando la pelle viene manipolato. Questa capillare non è l'obiettivo, maidentificazione è importante per l'identificazione della vena temporale. Quindi, individuare un buio, vena ombra inferiore alla capillare che rimane fissa a prescindere dalla posizione della pelle. La vena temporale appare in ombra, corre dorsale a ventrale, e alimenta la vena giugulare (Figura 1).
- Inserisci la vena temporale con l'ago smusso up. Se inserita correttamente, è possibile visualizzare le bisello dell'ago riempiono di sangue attraverso la pelle. Quindi premere il pistone lentamente e nota pallore della vena lungo il lato del viso.
- Lasciare l'ago di rimanere all'interno della vena per l'aggiunta di un 10-15 secondi per impedire il riflusso del injectant.
3. Post-iniezione
- Dopo un'iniezione adeguata, il cucciolo dovrebbe diventare blu quasi immediatamente. Rimuovere l'ago e usare la forza gentile per applicare un tampone di cotone sul sito di iniezione fino a quando i coaguli di sangue.
- Monitorare il cucciolo per segni di sofferenza. Lasciare il cucciolo 2-3 minuti per recuperare e riscaldare, recognize quando il cucciolo è cosciente, in posizione verticale e in movimento, prima di tornare in gabbia. Coppa dei cuccioli nelle mani guantate del ricercatore di fornire calore appropriato per aiutare nel recupero, se necessario. In alternativa, inserire una piastra elettrica sotto la gabbia a casa per facilitare il riscaldamento il cucciolo iniettato. In genere dopo l'iniezione colorante blu Evans, eutanasia cuccioli. Non includere colorante quando si inietta materiale di prova.
- Posizionare il cucciolo nella gabbia casa e garantire il cucciolo è rivestito con biancheria da letto e / o nestlet per garantire il reinserimento dalla diga.
- Utilizzare una nuova siringa e un batuffolo di cotone per ogni cucciolo di mantenere la sterilità.
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Representative Results
Durante una iniezione corretta, la vena deve momentaneamente girare chiaro, o sbollentare. Se l'iniezione di tingere l'intero cucciolo dovrebbe diventare blu in pochi secondi. Se si è verificato un iniezione improprio, vi è spesso un bolo sottocutaneo concentrato nella testa o al collo e injectant può fuoriuscire dal sito di iniezione. Iniezioni scorrette possono anche provocare la comparsa di lividi intorno alla gola. Cuccioli che ricevono iniezioni sottocutanee (cioè l'iniezione non è stato completamente consegnato in vena) generalmente sperimentare effetti collaterali negativi e di routine rispondere al trattamento, come i topi iniettati fanno correttamente.
A seconda della terapia erogata, iniezione di successo può provocare distribuzione capillare al SNC e organi periferici. Quando si somministra auto gratuito adeno-associato virus del sierotipo 9 che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) con un β-actina pollo promotore ibrido (CB) (insieme denominato "scAAV9 CB GFP"), transespressione genica si trova nelle cellule gliali e neuroni in più regioni del cervello e nel midollo spinale (figure 2A-2C). Iniezione intravascolare di scAAV9 CB GFP si traduce anche in un'espressione diffusa in tutta la periferia, con evidente espressione nel cuore e tessuto epatico (Figure 3A-3D).
Figura 1: (A) una piattaforma di iniezione improvvisato fatto da un tampone assorbente ("pannolino") avvolto intorno ad una cremagliera polistirolo da 50 ml di imballaggio conica. La piattaforma permette al ricercatore di riposare la mano sul tavolo accanto alla piattaforma. Questo permette al ricercatore di effettuare l'iniezione a più piatto angolo rispetto al cucciolo mouse. (B) Immagine che mostra cucciolo immobilizzazione tra l'indice e il medio. (
Figura 2: l'espressione genica del sistema nervoso centrale per via endovenosa neonato di auto AAV9 complementari che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP scAAV9 CB) giorno post-natale 1 (P1) cuccioli di topo sono state iniettate per via endovenosa di 1 x 10 11 genomi vettoriali (VG) di auto. complementare (sc) scAAV9 CB GFP. Quattro settimane dopo l'iniezione, i topi sono stati sacrificati e perfusi con paraformaldeide al 4%. I tessuti sono stati raccolti, tagliati e colorati per l'espressione della GFP. GFP è visto in tutto il cervello tra cui lo striato anteriore (A) through ponte e cervelletto (B). Cellule GFP positive sono in genere i neuroni e astrociti. GFP è anche rilevato nel midollo spinale (C). Motoneuroni spinali e neuroni dei gangli delle radici dorsali sono efficacemente trasdotte con consegna neonato IV. GFP vascolare e astrociti positivo sono anche visto in tutta la materia grigia spinale. Tutte le barre di scala = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: l'espressione della GFP in organi periferici a seguito di iniezione endovenosa neonatale di sé complementare AAV9 GFP (scAAV9 CB GFP) GFP immunofluorescenza è rilevabile nel cuore topo adulto (A) e del fegato (C). (B) e del fegato (D) di topi uninjected. Tutte le barre di scala = 100 micron.
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Discussion
Consegna intravascolare di agenti al sistema nervoso centrale o in tutto il corpo è difficile in modelli murini di malattie neonatali. Il protocollo descritto è un modo rapido, relativamente non invasivo per somministrare per via endovenosa di soluzioni in topi neonati con requisiti di equipaggiamento minimo. Sebbene faccia temporale vena può essere visto ad occhio nudo, iniezioni possono avere una maggiore precisione con l'uso del microscopio e sorgente di luce a fibre ottiche, in particolare per un iniettore inesperto. Iniezioni intravascolari nei topi neonati hanno un alto tasso di successo 12, e AAV trasduzione è stata osservata nei primi cuccioli, anche se parte del injectant viene somministrato per via sottocutanea. L'iniezione è ben tollerato dai cuccioli di topo, e dighe sul FVB / N o C57BL / 6 sfondi tollera la manipolazione dei cuccioli molto bene. Tuttavia, in rari casi dighe possono distruggere intere cucciolate. Queste iniezioni possono essere eseguite con successo nei topi di dimensioni fino a 0,8 g per 1,6 g. Iniectio Alternativen percorsi per topi neonati sono stati pubblicati da noi e gli altri, tra cui retro-orbitale, intrajugular e 10,15,22 intraperitoneale. Preferiamo il percorso di iniezione descritto perché è clinicamente rilevante, in grado di essere eseguita da un singolo sperimentatore senza requisiti speciali dell'apparecchiatura e consente un'ampia gamma di volumi da somministrare.
Un problema comune sperimentato durante l'esecuzione di iniezioni è difficoltà nel visualizzare la vena temporale e quindi smarrimento dell'ago. La sorgente di luce in fibra ottica deve essere posizionata a <90 ° e splendente verso il basso sulla testa quando si terrà per una migliore visualizzazione della vena. Iniettori devono prendere tempo per regolare la fonte di luce per soddisfare le loro esigenze. Osservazione vena temporale è significativamente diminuita se cuccioli sono troppo grandi, caratterizzato come vecchi allora P2 o superiore a 2,0 g. Un secondo problema può determinare se il bisello ago è inserito nella vena. La vena facciale temporale è superficiale, quindi bisogna fare attenzione per evitare di entrare sotto la vena. Assicurare che il bisello dell'ago entra parallelamente alla vena impedirà pungere attraverso la vena. Posizionamento dell'ago è meglio verificata mediante iniezione lenta e successiva sbiancamento della vena.
La vena temporale superficiale è visibile su entrambi i lati della testa. Individui mancini possono trovare che di fronte l'animale alla sinistra del ricercatore può essere ergonomicamente migliore e deve essere determinato per ogni singolo ricercatore. Qualora la vena non essere visibile o è mistargeted tentativi iniziali, rivolti vena sul lato opposto della testa è appropriato. Se la vena è forato sui due lati della testa, possono avvenire trafilamenti attraverso il primo sito durante iniezione nel secondo sito. A seconda della distanza di lavoro del microscopio, può essere opportuno costruire una piccola piattaforma sulla quale iniettare l'animale; per esempio, un contenitore polistirolo vuoto da 50 ml conicaimballaggio tubo (Figura 1). Questo permette al ricercatore di posizionare l'animale vicino al bordo della piattaforma in modo che la mano di iniezione del ricercatore può poggiare direttamente sul tavolo. Questo può migliorare l'angolo di entrata nella vena e minimizzare l'ostruzione della luce.
Ci sono alcune limitazioni per l'utilità del protocollo, compreso il volume di iniezione, la finestra età per iniezioni e l'imprevedibilità della risposta diga. Volumi di iniezione per i cuccioli sono limitati a 50 ml. Abbiamo già dosato animali con 100 microlitri, ma abbiamo osservato un aumento della mortalità correlata iniezione rispetto alle iniezioni di volume più bassi, ma altri riportano la consegna con successo 100 ml 10,12. Inoltre, è stato suggerito che l'aumento dei volumi di iniezione possono danneggiare la barriera ematoencefalica 23. Spesso il reagente sperimentale viene miscelato con PBS per mantenere un volume di iniezione di 50 microlitri costante. Siamo a conoscenza di studi examining l'effetto del volume di iniezione sulla diffusione nel topi neonati e studi empirici devono essere eseguiti per identificare effetti sul volume di iniezione di nuovi reagenti a una data dose. Una seconda limitazione è che la vena temporale superficiale è facilmente visibile sul primo e secondo giorno dopo la nascita. Le modifiche alla dimensione degli animali, pigmentazione della pelle e lo spessore si combinano per oscurare la vena in fasi successive anche se altri riferiscono di accesso attraverso la vena giorno postnatale 6 10,12. In alternativa, abbiamo utilizzato ultrasuoni guidati iniezioni cardiache per offrire vettore virale per la circolazione in P5 e P10 animali 4. Infine, l'accettazione delle dighe del mouse della procedura è imprevedibile. Abbiamo trattato FVB / N, C57BL / 6 e topi B6SJL attraverso modelli murini di malattie e disturbi dello spettro autistico neuromuscolari. FVB / N topi sono i più tolleranti mentre i ceppi sul C57BL / 6 sfondo occasionalmente possono distruggere singoli cuccioli o intere cucciolate, ma questo un evento raro. Tuttavia, questodovrebbe essere una considerazione quando si pianifica una sufficiente n per un esperimento. Accettazione Dam può essere ulteriormente influenzato da ciò che la malattia del ceppo di topi è la modellazione. Ad esempio, un modello di un disturbo dello spettro autistico ha avuto un tasso molto più elevato di rifiuto cucciolo di quanto previsto in base al ceppo sfondo. Promuovere cuccioli può essere una considerazione se diga accettazione è una preoccupazione. Altri approcci per limitare il rifiuto comprendono l'esecuzione di iniezioni in una stanza separata dalla diga di limitare l'accesso ai Pup vocalizzazioni ultrasoniche, e strofinare il naso della diga e / o i cuccioli con un panno inumidito con etanolo al 70% per mascherare qualsiasi odore investigatore. Cuccioli dovrebbero essere strofinato con biancheria sporca per aiutare nella accettazione.
Questo protocollo è stato utilizzato con successo per il trattamento di un modello murino di SMA. SMA è una malattia neurodegenerativa pediatrica che colpisce soprattutto i neuroni motori inferiori del midollo spinale. Senza trattamento, questo modello di topo muore di 15 giorni dopo la nascita, in media. Afiniezioni endovenose ter della terapia genica AAV in 1 giorno-vecchi topi, la sopravvivenza è stato esteso ad un anno, a dimostrazione della sicurezza e la tollerabilità del protocollo di iniezione descritto 2,4,14. Risultati simili sono stati ottenuti anche nello stesso modello murino SMA dopo l'iniezione IV di oligonucleotidi antisenso 8,9. Le applicazioni future includono la fornitura di altre terapie cellulari e geniche, nonché la creazione di modelli neonatali per disturbi dello sviluppo del SNC e la periferia per esprimere esogenamente un cDNA o un cassetto RNAi 24. L'iniezione endovenosa è un metodo clinico approvato consegna; Pertanto, l'utilizzo di questa tecnica può essere vantaggioso in studi preclinici per una varietà di agenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il NINDS, FightSMA, e le famiglie di SMA per il sostegno finanziario. SEGL è supportato da una formazione NINDS concessione # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
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