Summary
Modelos animais de doença pediátrica pode experimentar início precoce e progressão da doença agressiva. Clinicamente entrega terapia relevantes para jovens modelos de mouse pode ser tecnicamente difícil. Este protocolo descreve um método de injecção intravenosa não-invasiva para a ratinhos recém-nascidos nos dois primeiros dias pós-natais de vida.
Abstract
A injeção intravenosa é uma forma clinicamente aplicável para entregar terapêutica. Para roedores adultos e animais maiores, injeções intravenosas são tecnicamente viáveis e de rotina. No entanto, alguns modelos de mouse pode ter início precoce da doença com uma progressão rápida que torna a administração de terapias potenciais difícil. A veia temporal (ou facial) é apenas anterior ao botão da orelha em ratinhos e é claramente visível para os dois primeiros dias após o nascimento em cada lado da cabeça, usando um microscópio de dissecação. Durante esta janela, a veia temporal, podem ser injectados com volumes de até 50 ul. A injecção é seguro e bem tolerado por ambas as crias e as barragens. Um procedimento típico de injecção está concluída dentro de 1-2 min, após o que o filhote é devolvida à gaiola de origem. No terceiro dia pós-natal a veia é difícil de visualizar e do procedimento de injeção se torna tecnicamente confiável. Esta técnica tem sido utilizada para a entrega de vírus adeno-associado (AAV) vectors, que por sua vez pode fornecer quase todo o corpo, a expressão do transgene estável durante a vida do animal, dependendo do serotipo viral escolhido.
Introduction
A entrega de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC) em modelos murinos de doença pediátrica continua a ser um desafio. Ratos que modelo estados de doença recém-nascidos são subdimensionados e developmentally imaturo, e, portanto, pode ser difícil de injectar directamente nas estruturas apropriadas dentro do SNC. Injeção intravascular de agentes terapêuticos é um método não-invasivo, bem tolerado para entregar células, drogas ou vetores virais para todo o corpo, incluindo o SNC 1-5 e 3,5-9 retina. Publicações anteriores descrevem injeção veia rosto temporal, utilizando um transiluminador 10,11, sem um microscópio de dissecação 11,12, ou exigindo duas pessoas para injetar 10. A técnica de injeção descritos neste protocolo é vantajoso porque um único indivíduo pode injetar filhotes, ea fonte de luz para ver a veia temporal, não está tocando o filhote, eliminando a necessidade de fita cirúrgica ou a fixação de um filhote de cachorro para uma superfície fixatal como um transiluminador 11. Entrega de adeno-associado vector viral serótipo 9 (AAV9) em ratinhos produz expressão robusta em neurónios e astrócitos em todo o cérebro e na medula espinal (Figura 1). A entrega intravascular de vectores virais na veia facial temporal superficial foi usado de forma fiável em vários estudos em ratinhos neonatais para tratar a doença neuromuscular pediátrica atrofia muscular espinal (SMA) e, finalmente, 2,4,13,14 aumentou o tempo de vida dos ratinhos tratados.
Injecção intravascular de ratinhos neonatais também tem como alvo de forma eficaz o sistema nervoso periférico e órgãos periféricos (Figura 2). Após a injecção de AAV, a transdução de gânglios da raiz dorsal, fígado, coração, músculo esquelético, o pulmão, e do plexo mientérico do intestino foi observada 1,3,6,7,15. Transdução generalizada do sistema nervoso central e periferia torna este método de injeção ideal para doenças que requerem expressão global deum transgene, tais como a doença de 16 e outro de depósito lisossômico doenças de Gaucher, doença de 17,18 Batten e lipofuscinoses Ceróides neuronais relacionados, 19 e síndrome de Bardet-Biedl, uma doença genética do sistema múltiplo com início dos sintomas que ocorrem na infância 20. Injecção intravascular em ratinhos neonatais, também deve ser considerado como um novo método de doenças pediátricas em todo o sistema de modelagem. Esta técnica tem sido traduzido para animais de grande porte 5,21 e injeção intravascular já existe como um método clinicamente aceitável de entregar terapêutica.
O protocolo atual descreve um método simples e eficiente de agentes para ratos neonatais entregar através da veia superficial rosto temporal, o mais tardar até dia pós-natal 2. Injeção pode ser completado por um único, praticada individual e é bem tolerado por ambos os filhotes e as barragens. Filhotes experimentar angústia mínima e recuperar rapidamente. Importantly, injecção bem sucedido resultará na entrega global do agente administrado. Este protocolo é apropriado para a entrega de vectores virais, agentes farmacêuticos ou de células para ratinhos recém-nascidos.
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Protocol
Todos os procedimentos listados no protocolo foram aprovados Instituto para uso animal e comissão Care (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio.
1. Preparação da área de trabalho
- Reunir gelo triturado, para anestesiar os filhotes de rato, uma gaiola vazia para segregar a represa da ninhada, um microscópio de dissecação, uma fonte de luz que pode ser posicionado a um ângulo em relação à injecção (utilização de uma fonte de luz em um 90 ° ângulo em relação ao local da injecção obscurece a veia), uma superfície limpa para colocar o animal para a injecção, cotonetes, 3/10 cc seringa de insulina com 3/8 "de 30 L de agulha (um por animal) e 1% de corante azul de Evans ( feita com) solução salina tamponada com fosfato (PBS) para a formação.
- Retire a barragem de uma gaiola separada ao manipular os filhotes.
2. Injecção Procedimento
- Coloque um único filhote diretamente no gelo molhado por 30-60 seg para anestesiar o animal. Não deixe tele animais no gelo por muito tempo devido a um risco de complicações associadas à hipotermia relacionada, incluindo a fibrilação ventricular, hipóxia tecidual e acidose metabólica.
NOTA: A nossa experiência é que 30-60 segundos é suficiente para abrandar os movimentos filhote de permitir a injecção. Se a anestesia mais profunda é necessária, inalantes, tais como 1-2% de isoflurano pode ser apropriada. - Enquanto o animal é em gelo, carregar a seringa com 30 ul de corante azul de Evans.
- Quando o animal é completamente anestesiados, confirmada pela falta de movimento no gelo enquanto ainda em respirar, movê-lo sob o microscópio. Para uma injecção destro, enfrentar o focinho do animal para a direita. Coloque o dedo indicador esquerdo no focinho eo caudal dedo médio esquerdo à orelha broto para que a orelha broto é entre o indicador eo dedo médio (Figura 1).
- Examine apenas anterior à orelha broto de um capilar superficial que se move quando a pele é manipulado. Este capilar não é o alvo, no entantoidentificação é importante para a identificação da veia temporal. Em seguida, localize um escuro, sombrio veia inferior ao capilar que permanece fixo, independentemente da posição da pele. A veia temporal, aparece sombreada, corre para ventral dorsal, e alimenta-se na veia jugular (Figura 1).
- Digite a veia temporal com a agulha de bisel para cima. Se inserido corretamente, é possível visualizar os bisel da agulha se enchem de sangue através da pele. Em seguida, pressionar o êmbolo devagar e com nota branqueamento da veia para o lado do rosto.
- Permitir que a agulha para permanecer dentro da veia para um agregado de 10-15 seg para evitar o refluxo do injectant.
3. Pós-injecção
- Após uma injecção adequada, o filhote deve ficar azul quase que imediatamente. Remover a agulha e usar a força suave para aplicar um cotonete para o local de injecção até que os coágulos de sangue.
- Monitorar o filhote para sinais de sofrimento. Permitir que o filhote 2-3 min para recuperar e reaquecer, recognize quando o filhote está consciente, de pé e em movimento, antes de voltar para a jaula. Taça dos filhotes nas mãos enluvadas do investigador para fornecer calor adequado para ajudar na recuperação, se necessário. Como alternativa, coloque uma almofada de aquecimento sob a gaiola para facilitar o aquecimento do filhote injetado. Geralmente depois de uma injeção de corante azul de Evans, eutanásia filhotes. Não incluem corante ao injetar o material de teste.
- Coloque o filhote de volta para a gaiola e garantir que o filhote é revestido com roupa de cama e / ou nestlet para garantir reacceptance pela barragem.
- Use uma seringa nova e cotonete para cada cachorro para manter a esterilidade.
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Representative Results
Durante uma injecção adequada, a veia deve momentaneamente virar clara, ou branquear. Se injetar tingir todo o filhote deve ficar azul em segundos. Se uma injecção indevida tenha ocorrido, há muitas vezes um bolus subcutâneo concentrada na cabeça ou pescoço e injectant pode verter para fora do local de injecção. Injecções impróprios também pode resultar no aparecimento de nódoas negras em torno da garganta. Os filhotes que recebem injeções subcutâneas (ou seja, a injeção não foi totalmente entregue na veia) geralmente não têm quaisquer efeitos secundários nocivos e rotineiramente responder ao tratamento que os camundongos injetados fazer corretamente.
Dependendo da terapia entregue, injecção bem sucedido pode resultar na entrega generalizada para o SNC e órgãos periféricos. Ao injetar auto cortesia vírus sorotipo adeno-associado 9, expressando a proteína fluorescente verde (GFP) com um β-actina de frango promotor híbrido (CB) (em conjunto referidas como "scAAV9 CB GFP"), transa expressão do gene é encontrado em células gliais e neurónios em várias regiões do cérebro e na medula espinhal (Figuras 2A-2C). Injecção intravascular de scAAV9 CB GFP também resulta na expressão disseminada por toda a periferia, com expressão perceptível no tecido do fígado e do coração (Figuras 3A-3D).
Figura 1: (A) Uma plataforma de injecção improvisada feita a partir de uma almofada absorvente ("fralda") envolvida em torno de uma cremalheira de isopor a partir de 50 ml de embalagem cónico. A plataforma permite ao investigador para descansar a sua mão sobre a mesa adjacente à plataforma. Isto permite ao investigador para realizar a injecção com um ângulo mais plana em relação ao filhote de rato. (B) Imagem mostrando imobilização pup entre o primeiro plano e os dedos médios. (
Figura 2: a expressão do gene do sistema nervoso central após a injeção intravenosa neonato de auto AAV9 complementar expressando a proteína fluorescente verde (GFP scAAV9 CB) dia pós-natal 1 (P1) filhotes de rato receberam injeção com 1 x 10 11 genomas de vetores (VG) de si mesmo. complementar (sc) scAAV9 CB GFP. Quatro semanas após a injecção, os ratos foram sacrificados e perfundidos com paraformaldeído a 4%. Os tecidos foram coletados em lâminas e submetidos para a expressão GFP. Expressão da GFP é visto ao longo do cérebro, incluindo o estriado anterior (A) through ponte e cerebelo (B). As células positivas para GFP são tipicamente neurónios e astrócitos. Expressão da GFP também é detectado na medula espinhal (C). Neurônios motores espinhais e neurônios dos gânglios da raiz dorsal são eficientemente transduzidas com entrega neonato IV. GFP vasculatura positivo e astrócitos também são vistos em toda a matéria cinzenta da medula. Todas as barras de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de GFP em órgãos periféricos a seguir à injecção intravenosa neonatal de auto complementar AAV9 GFP (GFP scAAV9 CB) imunofluorescência é detectável GFP no coração de ratinho adulto (A) e no fígado (C). (B) e fígado (D) de ratos não injectados. Todas as barras de escala = 100 pm.
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Discussion
A entrega intravascular de agentes para o SNC ou por todo o corpo é difícil em modelos murinos de doença neonatal. O protocolo descrito é uma maneira rápida, relativamente não-invasivo para administrar por via intravenosa soluções em camundongos neonatal com requisitos mínimos de equipamento. Embora a cara veia temporal, podem ser vistos a olho nu, as injecções podem ter maior precisão com o uso do microscópio e fonte luminosa de fibra óptica, especialmente para um injector sem prática. Injeções intravenosas em ratos recém-nascidos têm uma alta taxa de sucesso de 12, e transdução AAV tem sido observado nos primeiros filhotes, mesmo que parte da injectant é administrado por via subcutânea. A injecção é bem tolerada pelos filhotes de rato, e represas sobre FVB / N ou C57BL / 6 fundos tolerar a manipulação dos filhotes muito bem. No entanto, em casos raros barragens podem destruir ninhadas inteiras. Estas injecções podem ser realizadas com sucesso em ratinhos tão pequenas quanto 0,8 g por meio de 1,6 g. Injectio Alternativan rotas para ratos neonatos foram publicadas por nós e outros, incluindo retro-orbital, intrajugular e 10,15,22 intraperitoneal. Nós preferimos a via de injecção descrito aqui, porque é clinicamente relevante, capaz de ser realizada por um único experimentador com equipamentos não há requisitos especiais e permite uma grande variedade de volumes a serem administrados.
Um problema comum experimentado ao realizar injeções é a dificuldade de visualização da veia temporal e, portanto, extravio da agulha. A fonte de luz de fibra óptica deve ser posicionado a <90 ° e brilhando para baixo na cabeça ao ser realizada para uma melhor visualização da veia. Injetores deve ter tempo para ajustar a fonte de luz para atender às suas necessidades. Observação veia temporal é significativamente reduzida se os filhotes são muito grandes, velhos, em seguida caracterizada como P2 ou superior a 2,0 g. Um segundo problema pode ser determinante se o bisel da agulha tenha entrado na veia. A veia facial temporal é superficial, por isso deve-se tomar cuidado para evitar entrar por baixo da veia. Assegurar que o bisel da agulha está a entrar paralelo à veia irá impedir a punção através da veia. Colocação da agulha é melhor verificada por injecção lenta e branqueamento posterior da veia.
A veia temporal superficial é visível em ambos os lados da cabeça. Indivíduos canhotos podem achar que enfrenta o animal à esquerda do investigador pode ser ergonomicamente melhor e deve ser determinado para cada investigador individual. Caso a veia não ser visível ou é mistargeted em tentativas iniciais, a segmentação da veia no lado oposto da cabeça é apropriado. Se a veia é perfurada em ambos os lados da cabeça, poderão ocorrer algumas fugas através do primeiro local durante a injecção no segundo local. Dependendo da distância de trabalho do microscópio, pode ser apropriado para construir uma pequena plataforma sobre a qual a injectar o animal; por exemplo, um recipiente de isopor vazio a partir de 50 mL cónicoembalagem do tubo (Figura 1). Isto permite ao investigador para posicionar o animal perto da borda da plataforma, de modo que a mão de injecção do investigador pode assentar directamente sobre a mesa. Isto pode melhorar o ângulo de entrada para dentro da veia e minimizar a obstrução da luz.
Há algumas limitações para a utilidade do protocolo, incluindo o volume de injecção, a janela de idade para injecções e a imprevisibilidade da resposta barragem. Os volumes de injecção para filhotes estão limitados a 50 ul. Temos animais previamente tratados com 100 l, mas têm observado aumento da mortalidade relacionada com a injeção em comparação com injeções de volume mais baixos, mas outros relatam sucesso de entregar 100 l 10,12. Além disso, tem sido sugerido que o aumento dos volumes de injecção pode danificar a barreira hemato-encefálica 23. Muitas vezes, o reagente experimental é misturado com PBS para manter um volume de injecção de 50 ul constante. Não temos conhecimento de estudos examining o efeito do volume de injeção de propagação ao longo dos camundongos recém-nascidos, e estudos empíricos devem ser realizados para identificar os efeitos sobre o volume de injeção de novos reagentes a uma determinada dose. Uma segunda limitação é que a veia temporal superficial é facilmente visível no primeiro e segundo dias pós-natais. Alterações no tamanho do animal, a pigmentação da pele e espessura combinam para obscurecer a veia em idades posteriores embora outros relatam acessar a veia através de dia pós-natal 6 10,12. Alternativamente, foi utilizado ultra-som guiada injeções cardíacas para entregar vetor viral para a circulação em P5 e P10 animais 4. Finalmente, a aceitação das barragens de rato o procedimento é imprevisível. Temos tratado FVB / N, C57BL / 6 e camundongos B6SJL através modelos de ratos de transtornos do espectro do autismo e doenças neuromusculares. Camundongos FVB / N são os mais tolerantes, enquanto tensões no C57BL / 6 fundo pode ocasionalmente destruir filhotes individuais ou ninhadas inteiras, mas esta uma ocorrência rara. No entanto, estedeve ser uma consideração durante o planejamento para n suficiente para uma experiência. Aceitação Dam pode ser mais influenciada pela qual a doença que a cepa de rato é a modelagem. Por exemplo, um modelo de uma desordem do espectro autista tinha uma taxa muito mais elevada do que o esperado filhote rejeição com base na estirpe de fundo. Fomentar filhotes pode ser uma consideração se a aceitação da barragem é uma preocupação. Outras abordagens para limitar rejeição incluem a realização de injeções em uma sala separada da barragem para limitar o acesso a vocalizações ultra-sônicas dos cachorros, e esfregar o nariz da barragem e / ou os filhotes com um pano umedecido com álcool 70% para mascarar qualquer odor investigador. Os filhotes também devem ser friccionada com roupa de cama suja para ajudar na aceitação.
Este protocolo tem sido usado com sucesso para tratar um modelo de ratinho de SMA. SMA é uma doença neurodegenerativa que afecta principalmente pediátrica neurónios motores inferiores da medula espinal. Sem tratamento, este modelo de rato morre por 15 dias após o nascimento, em média. Afinjecções intravenosas tro de terapia génica de AAV em murganhos um dia de idade, a sobrevivência foi prolongada até um ano, o que demonstra a segurança e tolerabilidade do protocolo de injecção descrito 2,4,14. Resultados semelhantes também foram obtidos no mesmo modelo de rato a seguir à injecção IV de SMA de oligonucleótidos anti-sentido 8,9. As aplicações futuras incluem a entrega de outras terapias celulares e de genes, bem como a criação de modelos neonatais para alteração do desenvolvimento do sistema nervoso central e da periferia exogenamente para expressar um ADNc ou uma cassete de RNAi 24. A injeção intravenosa é um método clínico aprovado da entrega; por conseguinte, a utilização desta técnica pode ser vantajoso em estudos pré-clínicos para uma variedade de agentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o NINDS, FightSMA e Famílias de SMA para apoio financeiro. SEGL é suportado por formação NINDS concessão # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
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