Summary
Les modèles animaux de la maladie pédiatrique peuvent éprouver précoce et la progression de la maladie agressive. Cliniquement l'administration du traitement pertinent de jeunes modèles de souris peut être techniquement difficile. Ce protocole décrit une méthode d'injection intraveineuse non-invasive pour les souris nouveau-nés dans les deux premiers jours après la naissance de la vie.
Abstract
L'injection intraveineuse est une manière cliniquement applicable à délivrer thérapeutique. Pour les rongeurs adultes et les grands animaux, des injections intraveineuses sont techniquement réalisables et routine. Toutefois, certains modèles de souris peuvent avoir l'apparition précoce de la maladie avec une progression rapide qui rend l'administration de thérapies potentielles difficile. La veine temporale (ou faciale) est juste en avant de l'oreille bourgeon chez la souris et est clairement visible pour les deux premiers jours après la naissance de chaque côté de la tête à l'aide d'un microscope à dissection. Au cours de cette fenêtre, la veine temporale peut être injecté avec des volumes allant jusqu'à 50 ul. L'injection est sûr et bien toléré par les deux petits et des barrages. Une procédure typique d'injection est achevé dans les 1-2 min, après quoi le chiot est renvoyée à la cage d'accueil. Le troisième jour après la naissance de la veine est difficile de visualiser et de la procédure d'injection devient techniquement fiables. Cette technique a été utilisée pour la livraison d'un virus adéno-associé (AAV) vectRUP, qui à son tour peut fournir, l'expression du transgène stable presque corps à l'échelle de la vie de l'animal en fonction du sérotype viral choisi.
Introduction
Livraison de médicaments pour le système nerveux central (SNC) dans des modèles murins de la maladie pédiatrique reste un défi. Les souris qui modèle états pathologiques nouveau-nés sont trop petits et des troubles de développement, et donc peut être difficile à injecter directement dans des structures appropriées au sein du CNS. Injection intravasculaire de produits thérapeutiques est une méthode bien toléré le non-invasive de produire des cellules, des médicaments ou des vecteurs viraux pour l'ensemble du corps, y compris le système nerveux central et de la rétine 1-5 3,5-9. Publications antérieures décrivent injection visage de veine temporale en utilisant un transilluminateur 10,11, sans un microscope de dissection 11,12, ou nécessitant deux personnes à injecter 10. La technique d'injection décrite dans le présent protocole est avantageuse car une seule personne peut injecter chiots, et la source de lumière pour voir la veine temporale ne touche pas le chiot, éliminant le besoin de ruban adhésif chirurgical ou la fixation d'un chiot à une surface fixecomme un transilluminateur 11. Livraison de adéno-associé de sérotype 9 vecteur viral (AAV9) chez la souris produit une expression robuste dans les neurones et les astrocytes dans le cerveau et la moelle épinière (Figure 1). Livraison intravasculaire de vecteurs viraux dans la veine temporale superficielle du visage a été utilisé de manière fiable dans diverses études chez la souris néonatale pour traiter le trouble neuromusculaire pédiatrique amyotrophie spinale (SMA) 2,4,13,14 et finalement augmenté la durée de vie des souris traitées.
L'injection intravasculaire de souris néonatales vise aussi efficacement le système nerveux périphérique et les organes périphériques (Figure 2). Après l'injection de l'AAV, la transduction des ganglions de la racine dorsale, le foie, le cœur, le muscle squelettique, du poumon et du plexus myentérique de l'intestin a été observé 1,3,6,7,15. Transduction généralisée du SNC et la périphérie rend cette méthode d'idéal d'injection pour les maladies nécessitant une expression globale deun transgène, comme la maladie et 16 autres lysosomales les maladies de Gaucher 17,18, la maladie de Batten et ceroid lipofuscinoses neuronales connexes, 19 et syndrome de Bardet-Biedl, une maladie génétique multisystémique avec apparition des symptômes qui se produisent dans la petite enfance 20. L'injection intravasculaire dans des souris nouveau-né doit également être considérée comme une nouvelle méthode de maladies pédiatriques de l'ensemble du système de modélisation. Cette technique a été traduit en plus grands modèles animaux 5,21 et injection intravasculaire existe déjà comme une méthode cliniquement acceptable de fournir des traitements.
Le protocole actuel décrit une méthode simple, efficace d'agents à des souris néonatales fournir par le superficiel visage temporelle veine plus tard postnatal jour 2. Injection peut être complété par un seul individu pratiqué et est bien toléré par les deux petits et des barrages. Les chiots de détresse est minime et se rétablissent rapidement. ImportanTLY, injection réussie se traduira par la livraison globale de l'agent administré. Ce protocole est approprié pour la livraison de vecteurs viraux, les agents pharmaceutiques ou des cellules à des souris nouveau-nés.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans le protocole ont été approuvés Institut pour l'utilisation des animaux et du Comité de protection (IACUC) de l'Université d'État de l'Ohio.
1. Préparation de l'espace de travail
- Rassemblez glace humide pour anesthésier les souriceaux, une cage vide pour séparer le barrage de la litière, un microscope de dissection, une source de lumière qui peut être positionné à un angle à l'injection (utilisation d'une source lumineuse à un 90 ° angle au site d'injection obscurcit la veine), une surface propre à placer l'animal pour l'injection, des cotons-tiges, 3/10 cc seringue à insuline avec 3/8 "30 aiguille G (une par animal) et Evans à 1% de bleu de méthylène ( fait avec du tampon phosphate salin (PBS)) solution pour la formation.
- Retirez le barrage à une cage séparée tout en manipulant les chiots.
2. Procédure d'injection
- Placez un seul petit directement sur la glace humide pendant 30-60 secondes pour anesthésier l'animal. Ne laissez pas til animale sur la glace trop longtemps en raison d'un risque de complications liées à l'hypothermie, y compris une fibrillation ventriculaire, une hypoxie tissulaire et une acidose métabolique.
NOTE: Notre expérience est que 30-60 sec est suffisant pour ralentir les mouvements de chiot pour permettre l'injection. Si une anesthésie profonde est nécessaire, des substances inhalées tels que 1-2% d'isoflurane peut être appropriée. - Alors que l'animal est sur la glace, charger la seringue avec 30 pi de colorant bleu Evans.
- Lorsque l'animal est complètement anesthésié, confirmé par l'absence de mouvement sur la glace tout en respirant, le déplacer sous le microscope. Pour une injection droitier, face à museau de l'animal vers la droite. Placer l'index gauche sur le museau et la caudale médius gauche à l'œuf de l'oreille afin que le bourgeon oreille est entre l'index et le majeur (figure 1).
- Examinez juste en avant de l'oreille bourgeon pour un capillaire superficiel qui se déplace lorsque la peau est manipulé. Ce capillaire est pas la cible, maisidentification est importante pour l'identification de veine temporale. Ensuite, localisez un endroit sombre, sombre veine inférieure au capillaire qui reste fixe indépendamment de la position de la peau. La veine temporale apparaît sombre, fonctionne dorsal à ventral, et se jette dans la veine jugulaire (figure 1).
- Entrez le veine temporale avec l'aiguille biseau vers le haut. Si inséré correctement, il est possible de voir le biseau de l'aiguille se remplissent de sang à travers la peau. Puis appuyer sur le piston lentement et la note de blanchiment de la veine sur le côté du visage.
- Laisser l'aiguille reste à l'intérieur de la veine pour une ajoutée 10-15 secondes pour empêcher le reflux de la solution injectée.
3. Post-injection
- Après une injection proprement dite, le chiot doit virer au bleu presque immédiatement. Retirez l'aiguille et utiliser la force douce à appliquer un coton-tige pour le site d'injection jusqu'à ce que les caillots de sang.
- Surveiller le chiot pour des signes de détresse. Laisser le chiot 2-3 min à récupérer et réchauffer, recognize lorsque le chiot est conscient, debout et en mouvement, avant de revenir à la cage. Coupe des chiots dans des mains gantées de l'enquêteur apporter de la chaleur approprié pour aider à la récupération si nécessaire. Sinon, placez un coussin chauffant sous la cage d'accueil pour faciliter le réchauffement du chiot injecté. Généralement après une injection de colorant bleu Evans, euthanasier les chiots. Ne pas inclure colorant lors de l'injection du matériel d'essai.
- Placez le chiot dans la cage de la maison et assurer le chiot est recouvert d'une literie et / ou nestlet pour assurer réacceptation par le barrage.
- Utilisez une nouvelle seringue et un coton-tige pour chaque chiot pour maintenir la stérilité.
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Representative Results
Lors d'une injection correcte, la veine doit momentanément tourner clair, ou blanchir. Si l'injection de colorant l'ensemble du chiot doit virer au bleu en quelques secondes. Si une injection incorrecte a eu lieu, il ya souvent un bolus sous-cutané concentré dans la tête ou du cou et injectant peut fuir du site d'injection. Injections inappropriées peuvent également entraîner l'apparition d'ecchymoses autour de la gorge. Les chiots qui reçoivent des injections sous-cutanées (par exemple l'injection n'a pas été entièrement livré dans la veine) connaissent généralement pas d'effets néfastes secondaires et répondre systématiquement à un traitement que les souris injectées font correctement.
Selon le traitement administré, injection réussie peut entraîner livraison généralisée du SNC et les organes périphériques. Lors de l'injection auto gratuit sérotype adéno-associé 9 exprimant la protéine verte fluorescente (GFP) avec un β-actine promoteur hybride de poulet (CB) (ci-après dénommées "scAAV9 CB GFP"), transl'expression du gène se trouve dans les cellules gliales et les neurones dans de multiples régions du cerveau et de la moelle épinière (Figures 2A-2C). Injection intravasculaire de scAAV9 CB GFP se traduit également par l'expression répandue sur toute la périphérie, avec l'expression sensible dans le cœur et le tissu hépatique (figures 3A-3D).
Figure 1: (A) Une plate-forme par injection de fortune fabriqué à partir d'un tampon absorbant ("à couches") enroulé autour d'un support de mousse de polystyrène de 50 ml d'emballage conique. La plate-forme permet à l'enquêteur de se reposer de leur main sur la table à côté de la plate-forme. Ceci permet à l'enquêteur d'effectuer l'injection à un angle plat par rapport à la chiot de la souris. (B) Image montrant chiot immobilisation entre la index et le majeur. (
Figure 2: expression centrale de gènes du système nerveux après injection intraveineuse nouveau-né de l'auto AAV9 complémentaire exprimant la protéine fluorescente verte (scAAV9 CB GFP) jours après la naissance 1 (P1) souriceaux ont été injectés par voie intraveineuse avec 1 x 10 11 génomes de vecteur (vg) de soi. complémentaire (sc) scAAV9 CB GFP. Quatre semaines après l'injection, les souris ont été sacrifiées et perfusé avec 4% de paraformaldehyde. Les tissus ont été prélevés, découpés et colorées pour l'expression de la GFP. expression de la GFP est vu à travers le cerveau, y compris le striatum antérieur (A) through la protubérance et cervelet (B). Les cellules positives à la GFP sont généralement les neurones et les astrocytes. expression de la GFP est également détecté dans la moelle épinière (C). Motoneurones spinaux et les neurones des ganglions de la racine dorsale sont efficacement transduites en utilisant livraison IV nouveau-né. Vasculaire et astrocytes positif GFP sont également considérés tout au long de la matière grise de la moelle. Toutes les barres d'échelle = 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Expression de GFP dans les organes périphériques après injection intraveineuse de néonatale auto complémentaire AAV9 GFP (GFP scAAV9 CB) immunofluorescence la GFP est détectable dans le cœur de souris adulte (A) et le foie (C). (B) et le foie (D) de souris non-injecté. Toutes les barres d'échelle = 100 um.
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Discussion
Livraison intravasculaire de produits à la CSN ou dans tout le corps est difficile dans les modèles murins de la maladie néonatale. Le protocole décrit est un moyen rapide, relativement non invasive à administrer par voie intraveineuse à des souris nouveau-né solutions avec les besoins en équipement minimum. Bien que le visage veine temporale peut être vu par l'œil nu, les injections peuvent avoir une plus grande précision à l'aide du microscope et la source lumineuse à fibre optique, en particulier pour un injecteur unpracticed. Injections intravasculaires chez les souris néonatales ont un taux de réussite élevé 12, et AAV transduction a été observée au début de chiots même si une partie de la solution injectée est administré par voie sous cutanée. L'injection est bien toléré par les souriceaux et les barrages sur FVB / N ou C57BL / 6 milieux tolère manipulation des chiots très bien. Cependant, dans de rares cas barrages peuvent détruire portées entières. Ces injections peuvent être réalisées avec succès chez la souris aussi petites que 0,8 g à 1.6 g. Alternative à injectern itinéraires pour les souris nouveau-nés ont été publiés par nous et les autres, y compris rétro-orbitaire, intrajugulaire et 10,15,22 intrapéritonéale. Nous préférons la voie d'injection décrits ici, car il est cliniquement pertinente, capable d'être exécutée par un seul expérimentateur avec aucune exigence d'équipements spéciaux et permet une large gamme de volumes à administrer.
Un problème commun lors de l'exécution des injections est la difficulté à voir la veine temporale et donc mauvais placement de l'aiguille. La source lumineuse à fibre optique doit être positionné à <90 ° et brillant vers le bas sur la tête lorsqu'il est tenu pour un meilleur affichage de la veine. Injecteurs devraient prendre le temps de régler la source de lumière en fonction de leurs besoins. L'observation de la veine temporale est considérablement réduit si les chiots sont trop grandes, caractérisé comme plus alors P2 ou supérieure à 2,0 g. Un second problème peut être déterminer si le biseau de l'aiguille a pénétré dans la veine. La veine faciale temporelle est superficial, si les soins doivent être prises pour éviter d'entrer sous la veine. Veiller à ce que le biseau de l'aiguille est entrée parallèle à la veine permettra d'éviter la perforation par la veine. Placement aiguille est mieux vérifiée par injection lente et le blanchiment subséquent de la veine.
La veine temporale superficielle est visible des deux côtés de la tête. Individus gauchers peuvent trouver que face à l'animal à la gauche de l'enquêteur peut être mieux ergonomique et doit être déterminé pour chaque chercheur. Si la veine ne pas être visible ou est un mauvais ciblage sur les tentatives initiales, le ciblage de la veine sur le côté opposé de la tête est appropriée. Si la veine est perforé sur les deux côtés de la tête, une fuite peut se produire par l'intermédiaire du premier site lors de l'injection dans le second site. En fonction de la distance de travail du microscope, il peut être approprié de construire une petite plate-forme sur laquelle l'animal à injecter; par exemple, une mousse de polystyrène contenant vide de 50 ml coniqueemballage du tube (Figure 1). Cela permet à l'enquêteur de positionner l'animal à proximité du bord de la plate-forme afin que la main d'injection de l'enquêteur peut reposer directement sur la table. Cela peut améliorer l'angle d'entrée dans la veine et de minimiser l'obstruction de la lumière.
Il existe quelques limitations à l'utilitaire de protocole y compris le volume d'injection, la fenêtre d'âge pour les injections et l'imprévisibilité de la réponse du barrage. Les volumes d'injection pour chiots sont limités à 50 pi. Nous avons déjà les animaux traités avec 100 pi, mais nous avons observé la mortalité liées à l'injection accrue par rapport à des injections de faible volume, mais d'autres rapportent avoir réussi à amener 100 pi 10,12. En outre, il a été suggéré que l'augmentation des volumes d'injection peuvent endommager la barrière hémato-encéphalique 23. Souvent, le réactif expérimental est mélangé avec du PBS afin de maintenir un volume d'injection de 50 ul constante. Nous ne connaissons pas d'études examining l'effet du volume d'injection sur la propagation à travers les souris nouveau-nés, et les études empiriques devraient être effectuées pour déterminer les effets sur le volume d'injection de nouveaux réactifs à une dose donnée. Une seconde limitation est que la veine temporale superficielle est facilement visible sur les premier et deuxième jours après la naissance. Les modifications apportées à la taille des animaux, la pigmentation de la peau et l'épaisseur se combinent pour occulter la veine à un âge plus avancé que les autres disent accéder à la veine par jour postnatal 6 10,12. Sinon, nous avons utilisé l'échographie guidée injections cardiaques à livrer vecteur viral à la circulation en P5 et P10 animaux 4. Enfin, l'acceptation des barrages de souris de la procédure est imprévisible. Nous avons traité FVB / N, C57BL / 6 et souris B6SJL dans des modèles murins de maladies et troubles du spectre autistique neuromusculaires. Souris FVB / N sont les plus tolérants alors que les souches sur le C57BL / 6 arrière-plan peuvent parfois détruire chiots individuels ou portées entières, mais cette rare. Toutefois, cettedoit être une considération lors de la planification pour n suffisamment pour une expérience. Dam acceptation peut être également influencée par ce que la maladie de la souche de souris est la modélisation. Par exemple, un modèle d'un trouble du spectre de l'autisme a un taux beaucoup plus élevé de rejet des petits que prévu sur la base de la souche de fond. Favoriser chiots peut être une considération si barrage acceptation est une préoccupation. D'autres approches visant à limiter le rejet comprennent l'exécution d'injections dans une pièce séparée à partir du barrage de limiter l'accès à en pop vocalisations ultrasoniques, et de se frotter le nez du barrage et / ou les chiots avec un chiffon imbibé d'éthanol à 70% pour masquer toute odeur de chercheur. Les chiots doivent également être frottées avec de la literie sale pour aider à l'acceptation.
Ce protocole a été utilisé avec succès pour traiter un modèle de souris de SMA. SMA est une maladie neurodégénérative qui affecte principalement pédiatrique neurones moteurs inférieurs de la moelle épinière. Sans traitement, ce modèle de souris meurt de 15 jours après la naissance en moyenne. Afinjections intraveineuses ter de la thérapie génique AAV chez la souris un jour âgés, la survie a été prolongée d'un an, démontrant l'innocuité et la tolérabilité du protocole d'injection décrit 2,4,14. Des résultats similaires ont également été obtenus dans le même modèle de souris SMA suivant l'injection IV d'oligonucléotides antisens à 8,9. Les futures applications comprennent la fourniture d'autres thérapies cellulaires et géniques, ainsi que la création de modèles néonatales pour des troubles du développement du système nerveux central et la périphérie pour exprimer un ADNc exogène ou une cassette ARNi 24. L'injection intraveineuse est une méthode clinique approuvé de livraison; Par conséquent, l'utilisation de cette technique peut être avantageux dans des études précliniques pour une variété d'agents.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le NINDS, FightSMA, et les familles de SMA pour un soutien financier. SEGL est pris en charge par la formation NINDS subvention # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
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