זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

Summary

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

Abstract

הזרקה תוך ורידית היא אופן קליני רלוונטי כדי לספק תרופות. מכרסמים מבוגרים ובעלי חיים גדולים יותר, זריקות תוך-ורידית הן אפשריים מבחינה טכנית ושגרתיות. עם זאת, בחלק מדגמי העכבר יכול להיות התחלה מוקדמת של מחלה עם התקדמות מהירה שעושה ממשל של טיפולים פוטנציאליים קשה. הווריד הזמני (או פנים) הוא רק קדמי לניצן האוזן בעכברים והוא נראה בבירור ביומיים הראשונים שלאחר לידה בכל צד של הראש באמצעות מיקרוסקופ לנתח. במהלך חלון זה, הווריד הזמני יכול להיות מוזרק בנפחים של עד 50 μl. הזריקה היא בטוחה ונסבל היטב על ידי שני הגורים והסכרים. הליך הזרקה טיפוסי יושלם בתוך 1-2 דקות, לאחר שהגור חוזר לכלוב בבית. מהיום ליום שלאחר הלידה השלישי הווריד קשה לדמיין והליך ההזרקה הופך מבחינה טכנית לא אמין. טכניקה זו הייתה בשימוש למסירה של vect וירוס adeno הקשורים (AAV)ORS, אשר בתורו יכול לספק, ביטוי transgene יציב כמעט גוף-רחב לחייו של בעל החיים בהתאם לסרוטיפ הנגיפי נבחר.

Introduction

משלוח תרופות למערכת העצבים המרכזי (CNS) במודלים עכבריים למחלת ילדים עדיין מהווה אתגר. עכברים שמצבי מחלה שזה עתה נולדו מודל הם גוץ והתפתחותית בשלה, ולכן יכול להיות קשה להזריק ישירות במבנים מתאימים בתוך מערכת העצבים המרכזית. הזרקה תוך-של סוכנים טיפוליים היא שיטה לא פולשנית, נסבלת היטב כדי לספק תאים, תרופות, או וקטורים ויראליים לכל הגוף כולל מערכת העצבים המרכזית ^{ו1-5 3,5-9} רשתית. פרסומים קודמים לתאר הזרקת פנים וריד זמנית באמצעות transilluminator ^10,11, ללא מיקרוסקופ לנתיחה ^11,12, או דורשים שני אנשים להזריק ^10. טכניקת ההזרקה תוארה בפרוטוקול זה יש יתרון משום שאדם אחד יכול להזריק גורים, ומקור האור כדי לראות את הווריד הזמני לא נוגע בגור, ומבטל את הצורך בפלסטר או הקובץ המצורף של גור למשטח קבועכגון transilluminator ^11. משלוח של סוג adeno הקשורים וקטור ויראלי 9 (AAV9) בעכברים מייצר ביטוי חזק בתאי עצב והאסטרוציטים ברחבי המוח וחוט השדרה (איור 1). משלוח תוך-של וקטורים ויראליים לוריד פנים הזמני השטחי נעשה שימוש באופן אמין במחקרים שונים בעכברים בילוד לטיפול בהפרעה עצבית-שרירית בילדים בעמוד השדרה שרירים ניוון (SMA) ^2,4,13,14 וסופו של דבר הגדיל את תוחלת החיים של עכברים שטופלו.

הזרקה תוך-של עכברים בילוד המטרה גם ביעילות מערכת עצבים ההיקפית ואיברים היקפיים (איור 2). בעקבות הזרקה של AAV, התמרה של גרעיני שורש הגבי, כבד, לב, שריר שלד, ריאות, ומקלעת myenteric של המעי נצפתה ^1,3,6,7,15. התמרה נרחבת של מערכת העצבים המרכזית והפריפריה גורמת שיטה זו של אידאל הזרקה לטיפול במחלות הדורשות ביטוי הגלובלי שלtransgene, כגון המחלות של מחלת גושה ¹⁶ ואחסון lysosomal האחר ^17,18, מחלת באטן וlipofuscinoses ceroid העצבי קשור, ¹⁹ ותסמונת Bardet-Biedl, הפרעה רבה מערכתית גנטית עם הופעת תסמינים המתרחשים בילדות המוקדמת ^20. גם הזרקה תוך-לעכברים בילוד צריכה להיחשב כשיטת חדשנית למחלות ילדים מערכתיות דוגמנות. טכניקה זו תורגמה למודלים של בעלי חיים גדולים יותר ^5,21 והזרקה תוך-כבר קיים כשיטת קלינית מקובלת של מתן תרופות.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה, יעילה של אספקת סוכנים לעכברים בילוד דרך וריד הפנים זמניים השטחי, לא יאוחר מיום הזרקת 2. לאחר לידה יכולה להסתיים באחת, התאמן פרט ונסבל היטב על ידי שני הגורים והסכרים. גורים חווים מצוקה מינימאלית ולהתאושש במהירות. Importantly, זריקה מוצלחת תביא לאספקה ​​הגלובלית של הסוכן מנוהל. פרוטוקול זה מתאים למשלוח של וקטורים ויראליים, סוכנים או תאי תרופות לעכברים שזה עתה נולד.

Protocol

כל הנהלים המפורטים בפרוטוקול אושרו מכון לשימוש בבעלי חיים ובועדה לטיפול (IACUC) מאוניברסיטת מדינת אוהיו.

1. הכנת סביבת העבודה

1. לאסוף קרח רטוב כדי להרדים את גורי העכבר, כלוב ריק להפריד את הסכר מההמלטה, מיקרוסקופ לנתח, מקור אור שיכול להיות ממוקם בזווית להזרקה (שימוש במקור אור ב° 90   זווית על הזריקה מטשטשת את הווריד), משטח נקי למקום חי להזרקה, צמר גפן, 3/10 מזרק אינסולין סמ"ק עם 3/8 "30 מחט G (אחד לכל חיה) ו -1% אוונס הכחול צבע ( עשה עם מי מלח פוספט שנאגרו פתרון (PBS)) לאימונים.
2. הסר את הסכר לכלוב נפרד בעוד מניפולציה הגורים.

נוהל 2. הזרקה

1. הנח גור אחד ישירות על הקרח הרטוב במשך 30-60 שניות כדי להרדים את החיה. אל תשאיר tהוא חיה על זמן רב מדי קרח בשל סיכון לסיבוכים הקשורים היפותרמיה כוללים פרפור חדרים, היפוקסיה רקמות וחמצת מטבולית.
   הערה: הניסיון שלנו הוא ש30-60 שניות היא מספיק כדי להאט את תנועות הגור כדי לאפשר להזרקה. אם נדרש הרדמה עמוקה יותר, שאיפה כגון isoflurane 1-2% עשויה להיות מתאימה.
2. בעוד החיה על קרח, לטעון את המזרק עם 30 μl של צבע הכחול אוונס.
3. כאשר בעלי החיים הוא בהרדמה מלאה, שאושר על ידי חוסר התנועה על הקרח בזמן שעדיין נושם, להעביר אותו מתחת למיקרוסקופ. להזרקה ימנית, ולהתמודד עם לועו של בעל החיים לצד ימין. הנח את האצבע שמאלה על הלוע וזנב האצבע אמצעית משמאל לניצן האוזן כך שניצן האוזן הוא בין האצבע ואמה (איור 1).
4. לבחון רק קדמי לניצן האוזן לנימים שטחיות שזז כאשר העור הוא מניפולציה. נימים זה לא היעד, אולםזיהוי הוא חשוב לזיהוי וריד זמני. בשלב הבא, אתר וריד כהה, צללים נחותים הנימים שנשארה קבוע, ללא קשר לעמדת עור. הווריד הזמני מופיע צללים, פועל גב אל הגחון, והזנות לוריד הצוואר (איור 1).
5. הזן את הווריד הזמני עם השיפוע עד המחט. אם הוכנס בצורה נכונה, ניתן להציג את זווית הטית המחט להתמלא בדם דרך העור. ואז לוחץ על המתג לאט ופתק לבן לווריד בצד של הפנים.
6. לאפשר את המחט להישאר בווריד לשניות 10-15 הוסיפו כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant.

3. לאחר הזרקה

1. לאחר הזרקה נכונה, הגור צריך להפוך לכחול באופן כמעט מיידי. הסר את המחט ולהשתמש בכוח עדין ליישם מקלון צמר גפן לזריקה עד שקרישי הדם.
2. צג הגור לסימני מצוקה. לאפשר דקות הגור 2-3 להתאושש ולחמם, recognize כאשר הגור הוא בהכרה, זקוף ומרגש, לפני ההחזרה לכלוב. גביע הגורים בידיים בכפפות של החוקר כדי לספק חום מתאים כדי לסייע בהחלמה במידת צורך. לחלופין, הנח כרית חימום מתחת לכלוב בבית כדי להקל על התחממות הגור מוזרק. בדרך כלל לאחר הזרקת צבע הכחול אוונס, להרדים גורים. אינו כולל צבע כאשר הזרקת חומר למבחן.
3. הנח את הגור בחזרה לכלוב בבית ולהבטיח את הגור מצופה מצעים ו / או nestlet כדי להבטיח reacceptance על ידי הסכר.
4. השתמש במזרק חדש וקלון צמר גפן לכל גור לשמור על סטריליות.

Representative Results

במהלך הזרקה נכונה, הווריד לרגע להפוך, או לחלוט ברורים. אם הזרקה לצבוע כל הגור צריך להפוך לכחול בתוך שניות. אם הזרקה לא תקינה התרחשה, לעתים קרובות יש בולוס תת עורי מרוכז בראש או בצוואר וinjectant עלול לדלוף מאתר ההזרקה. זריקות לא נכונה יכולות גם לגרום להופעה של שטפי דם בצוואר. גורים המקבלים זריקות תת עורית (כלומר ההזרקה לא נמסרה באופן מלא בווריד) חווים בדרך כלל אין תופעות לוואי שליליות ובאופן שיגרתי מגיבים לטיפול כמו העכברים שהוזרקו כהלכה לעשות.

בהתאם לטיפול נמסר, זריקה מוצלחת עלולה לגרום למסירה נרחבת למערכת העצבים המרכזית ואיברים היקפיים. כאשר הזרקת סרוטיפ עצמי חינם adeno הקשורים הווירוס 9 לבטא חלבון ניאון ירוק (GFP) עם β אקטין עוף אמרגן היברידי (CB) (להלן יחד "scAAV9 CB GFP"), טרנסביטוי גנים נמצא בתאים ונוירונים גליה על פני אזורי מוח רבים ובתוך חוט השדרה (איורים 2 א-2C). הזרקה תוך-של scAAV9 CB GFP גם תוצאות ביטוי נפוץ בכל רחבי הפריפריה, עם ביטוי בולט בלב וברקמת כבד (איורים 3 א-3D).

איור 1: פלטפורמת הזרקה מאולתרת עשויה ממשטח סופג ("חיתול") () כרוך סביב מדף קלקר מאריזה 50 מיליליטר חרוטי. הפלטפורמה מאפשרת לחוקר להניח את ידם על השולחן הסמוך לפלטפורמה. דבר זה מאפשר לחוקר לבצע את ההזרקה בלהחמיא זווית ביחס לגור העכבר. תמונה (B) מראה חוסר תנועת גור בין קדמת הבמה והאצבעות האמצעיות. ( אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: ביטוי גנים במערכת עצבים מרכזי לאחר הזרקה תוך ורידית של ילוד AAV9 המשלים העצמי לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (scAAV9 CB GFP) יום אחרי לידה 1 גורים (P1) עכבר הוזרקו לוריד עם 1 x 10 ¹¹ הגנום וקטור (טוב מאוד) של עצמי. משלים (SC) scAAV9 CB GFP. ארבעה שבועות לאחר הזרקה, עכברים הוקרבו וperfused עם paraformaldehyde 4%. רקמות נאספו, פרוס ומוכתם לביטוי של GFP. throug הביטוי של GFP נראה בכל רחבי המוח, כולל סטריאטום הקדמי ()h פונס והמוח קטן (ב). תאי GFP חיוביים הם בדרך כלל נוירונים והאסטרוציטים. הביטוי של GFP הוא גם זוהה בחוט השדרה (C). הנוירונים מוטוריים בעמוד השדרה והנוירונים גרעיני שורש הגבי הם ביעילות transduced באמצעות משלוח IV ילוד. כלי דם GFP חיוביים והאסטרוציטים גם נצפו בחומר אפור בעמוד השדרה. כל הברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: ביטוי של GFP באיברים היקפיים לאחר הזרקה תוך ורידית של ילוד עצמי AAV9 GFP המשלים (scAAV9 CB GFP) immunofluorescence GFP ניתן לזהות בלב העכבר הבוגר (A) והכבד (C). (ב) וכבד (ד ') של עכברי uninjected. כל הברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר.

Discussion

משלוח תוך-סוכנים למערכת העצבים המרכזית או בכל הגוף קשה במודלים עכבריים יילודים של מחלה. הפרוטוקול המתואר הוא דרך מהירה, יחסית לא פולשנית לניהול לוריד פתרונות לעכברי יילודים עם דרישות ציוד מינימליות. למרות וריד הפנים הזמני ניתן לראות בעין בלתי מזוינת, ייתכן שיש לי זריקות דיוק רב יותר בשימוש במיקרוסקופ ומקור אור בסיבים אופטיים, במיוחד להזרקה בלתי מיומנת. יש זריקות תוך-בעכברים בילוד שיעור הצלחה גבוה ^12, ואת הולכת AAV נצפתה בגורים מוקדמים, גם אם חלק מinjectant מנוהל תת עורי. ההזרקה נסבלת היטב על ידי גורי העכבר, וסכרים על FVB / N או C57BL / 6 רקע לסבול מניפולציה של הגורים יפים מאוד. עם זאת, במקרים נדירים סכרים יכולים להרוס כל המלטות. זריקות אלו יכולות להתבצע בהצלחה בעכברים קטנים כמו 0.8 גרם דרך 1.6 גר '. Injectio האלטרנטיביn מסלולים לעכברים ילודים פורסמו על ידינו ואחרים כוללים רטרו מסלולית, intrajugular ^ו10,15,22 הקפאין. אנחנו מעדיפים את מסלול הזריקה שתואר כאן כי זה רלוונטי קליני, תוכל להתבצע על ידי הנסיין אחת ללא דרישות ציוד מיוחדות ומאפשר מגוון רחב של נפחים להינתן.

בעיה נפוצה חוותה בעת ביצוע זריקות הוא קשיים בצפייה בווריד הזמני ולכן מיקום שגוי של המחט. מקור אור הסיבים אופטיים צריך להיות ממוקם ב< 90 מעלות ומבריקות כלפי מטה על הראש כשמוחזק לצפייה הטובה ביותר של הווריד. מרססים צריכים לקחת את הזמן כדי להתאים את מקור האור כדי להתאים לצרכימים שלהם. תצפית וריד זמנית היא ירד באופן משמעותי, אם גורים הם גדולים מדי, מאופיין כמבוגר אז P2 או גדול מ 2.0 g. בעיה שנייה ניתן לקבוע אם שיפוע המחט נכנס לווריד. וריד הפנים הזמני הוא superficial, כך יש להקפיד גם להימנע מכניסים מתחת לווריד. הבטחה שפוע המחט נכנסת במקביל לווריד תמנע ניקוב דרך הווריד. מיקום מחט מאומת הטוב ביותר בזריקה איטית ולבנת בדיעבד של הווריד.

הווריד הזמני השטחי נראה משני צדי הראש. אנשים-שמאל מסר עשויים לגלות כי מול בעלי החיים לשמאלו של החוקר עשוי להיות ארגונומית יותר טוב ויש לקבוע עבור כל חוקר פרטי. צריך הווריד לא יהיה גלוי או mistargeted על ניסיונות ראשוניים, מיקוד הווריד בצד השני של הראש מתאים. אם הווריד הוא ניקב משני צידי הראש, דליפה כמה עלולה להתרחש דרך האתר הראשון בזריקה לתוך האתר השני. בהתאם למרחק העבודה של מיקרוסקופ, זה עשוי להיות מתאים לבנות פלטפורמה קטנה שעליו להזריק לבעלי החיים; לדוגמא, מיכל קלקר ריק מחרוטי 50 מיליליטראריזת שפופרת (איור 1). הדבר זה מאפשר לחוקר למצב את בעלי החיים בקרבת קצה הרציף, כך שיד ההזרקה של החוקר יכולה לנוח ישירות על השולחן. זה יכול לשפר את זווית הכניסה לווריד ולמזער חסימת אור.

יש כמה מגבלות לשירות של הפרוטוקול הכולל את עוצמת הזריקה, חלון גיל זריקות והבלתי-הצפוי של תגובת הסכר. כרכי הזרקה לגורים מוגבלים ל -50 μl. יש לנו במינון בעבר בעלי חיים עם 100 μl, אבל הבחנו תמותת הזרקה קשורה גדלה בהשוואה לזריקות בנפח נמוכה, אבל אחרים דו"ח אספקת 100 μl ^10,12 בהצלחה. יתר על כן, הוצע כי כרכי הזרקה מוגברות עלולים לגרום נזק למחסום דם מוח ^23. לעתים קרובות מגיב הניסיוני מעורבב עם PBS לשמור קבוע 50 μl נפח הזרקה. אנחנו מודעים ללימודי examining ההשפעה של נפח הזרקה על התפשטות בכל רחבי עכברי הילוד, ויש לבצע מחקרים אמפיריים לזהות השפעות על נפח הזרקה לחומרים כימיים חדשים במינון שניתן. מגבלה שנייה היא שהווריד הזמני השטחי גלוי בקלות בימים שלאחר הלידה הראשון והשני. שינויים בגודל בבעלי החיים, פיגמנטציה של עור והעובי לשלב לטשטש את הווריד בגילים מאוחרים יותר שאחרים מדווחים על הגישה הווריד דרך יום לידה 6 ^10,12. לחלופין, השתמשנו בזריקות לב אולטרסאונד מונחה לספק וקטור ויראלי למחזור בP5 וP10 בעלי החיים ^4. לבסוף, הקבלה של סכרי העכבר של ההליך היא בלתי צפויה. יש לנו מטופלים FVB / N, C57BL / 6 ועכברים B6SJL פני מודלים של עכברים של הפרעות מחלה וספקטרום האוטיזם עצביות-שרירית. עכברי FVB / N הם סובלניים ביותר בעת זנים על רקע C57BL / 6 לעתים יכולים להרוס את גורי אדם או כל המלטות, אבל זה נדיר. עם זאת, זהצריך להיות שיקול בעת תכנון עבור n מספיק לניסוי. קבלת סכר יכולה להיות מושפעת יותר על ידי מה שמחל זן העכבר הוא דוגמנות. לדוגמא, מודל של הפרעה בספקטרום האוטיזם היה שיעור דחיית גור הרבה יותר גבוה מהצפוי על בסיס מתח הרקע. טיפוח גורים יכול להיות שיקול אם קבלת סכר היא דאגה. גישות אחרות כדי להגביל את הדחייה כוללות ביצוע זריקות בחדר נפרד מהסכר כדי להגביל את הגישה לגור קולות קוליים, ולשפשף את אפו של הסכר ו / או את הגורים עם מטלית לחה עם 70% אתנול כדי להסוות כל ריח חוקר. גורים גם צריכים להיות שפשף עם מצעים מלוכלכים כדי לסייע בקבלה.

פרוטוקול זה שמש בהצלחה לטיפול במודל עכבר של SMA. SMA הוא מחלה ניוונית של מערכת עצבים בילדים שפוגעת בעיקר בתאי עצב מוטוריים תחתון של חוט השדרה. ללא טיפול, מודל העכבר הזה מת ב -15 ימים לאחר הלידה בממוצע. אפזריקות תוך-ורידית ter של ריפוי גנטי AAV בעכברי 1 בן יומו, הישרדות הוארכה לשנה אחת, המעידה על הבטיחות וסבילות של פרוטוקול ההזרקה תאר ^2,4,14. תוצאות דומות התקבלו גם באותו מודל עכבר SMA לאחר הזרקת IV של אוליגונוקלאוטידים antisense ^8,9. יישומים עתידיים כוללים משלוח של טיפולים בתאים וגנים אחרים, כמו גם יצירת מודלים בילוד לפרעות התפתחותיות של מערכת העצבים המרכזית והפריפריה לבטא cDNA או קלטת RNAi ²⁴ אקסוגני. הזרקה תוך ורידית היא שיטה קלינית שאושרה על מסירה; לכן, ניצול של טכניקה זו עשויה להיות יתרון במחקרים פרה-קליניים עבור מגוון רחב של סוכנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope