Summary
소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.
Abstract
정맥 주사는 치료제를 제공하기 위해 임상 적으로 적용 가능한 방법이다. 성인 설치류 큰 동물의 경우, 정맥 주사는 기술적으로 가능하고 일상이다. 그러나 일부 마우스 모델은 잠재적 인 치료의 관리가 어려워 빠른 진행과 질병의 조기 발병을 가질 수 있습니다. 시간 (또는 안면) 정맥은 마우스에서 이어 버드에 전방 및 해부 현미경을 사용하여 머리의 어느 한쪽에 생후 명확 처음 이틀 동안 표시된다. 이 윈도우 동안, 시간적 정맥 50 μl의 최대 양으로 주입 될 수있다. 주사는 안전하고 잘 새끼와 어미 모두 허용합니다. 전형적인 주입 과정은 강아지가 홈 케이지로 복귀 된 후 1-2 분 이내에 완료된다. 제 생후함으로써 정맥 시각화 어렵고 주입 과정은 기술적으로 불안정해진다. 이 기술은 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) VECT의 전달을 위해 사용되어왔다차례로 선택한 바이러스 혈청 형에 따라 동물의 수명을 거의 몸 전체, 안정적인 형질 전환 유전자 발현을 제공 할 수 있습니다 ORS.
Introduction
소아 질병의 쥐 모델에서 중추 신경계 (CNS)에 대한 치료제의 배달는 도전 할 부분이 남아있다. 모델 신생아 질병 상태를 직접 CNS 내에서 적절한 구조에 삽입하기 어려울 수 있으므로 소형 및 발달 미숙 한 것을 마우스. 치료제의 혈관 내 주입 CNS 1-5과 3,5-9 망막을 포함한 몸 전체에 세포, 약물, 또는 바이러스 벡터를 제공 할 수있는 비 침습적, 내약성 방법이다. 이전 출판물은 해부 현미경 11, 12 않고, transilluminator가 10, 11을 사용하여 시간적 얼굴 정맥 주입을 설명, 또는 두 사람을 요구하는 것은 (10)를 삽입 할 수 있습니다. 한 개인이 새끼를 주입 할 수 있으며, 광원은 시간적 정맥이 강아지를 만지고 고정 표면 외과 테이프의 필요성 또는 강아지의 부착을 제거하지 않은 볼 때문에 프로토콜에서 설명 주입 기술은 유리한transilluminator가 11 등. 마우스에 아데노 - 관련 바이러스 벡터 혈청 형 9 (AAV9)의 전달은 뇌와 척수 (그림 1)를 통해 신경 세포와 성상 세포에 강력한 표현을 생성합니다. 피상적 시간적 안면 정맥 내로 바이러스 벡터의 전달을 확실하게 혈관 신경 근육 질환 소아 척수 근육 위축 (SMA) 2,4,13,14을 치료하는 신생아 마우스에서 다양한 연구에 사용 된 궁극적으로 처리 된 마우스의 수명을 증가되었다.
신생아 쥐의 혈관 내 주입도 효과적으로 말초 신경계 및 말초 기관 (그림 2)을 대상으로합니다. AAV의 주입 후, 후근 신경절, 간, 심장, 골격근, 폐, 그리고 창자의 myenteric 신경 얼기의 전달은 1,3,6,7,15을 관찰되었다. CNS와 주변의 대폭적인 전달은 글로벌 표현을 필요로하는 질병에 대한 분사 이상이 방법을 만든다이러한 고셔병 (16) 및 기타 리소좀 저장 질환 17, 18, 판자의 질병과 관련된 신경 ceroid lipofuscinoses, 19 Bardet-Biedl 증후군, 유아 (20)에서 발생하는 증상의 발병에 유전 적 다중 시스템 장애로 형질 전환 유전자,. 혈관 신생 생쥐에 주입은 모델링 시스템 전체 소아 질환의 신규 한 방법으로 고려되어야한다. 이 기술은 큰 동물 모델 5,21로 번역 한 내용 및 혈관 내 주입 이미 치료제를 전달 임상 적으로 허용되는 방법으로 존재한다.
현재의 프로토콜은 출생 후 하루 2 사출 늦어도 피상적 인 시간적 얼굴 정맥을 통해 신생아 쥐에 에이전트를 도출하는 간단하고 효율적인 방법을 설명하는 하나의 완성 할 수있다, 개인 연습을 잘 새끼와 어미 모두 허용됩니다. 새끼 최소한의 고통을 경험하고 신속하게 복구 할 수 있습니다. ImportanTLY, 성공적인 주입은 관리 에이전트의 글로벌 배달 될 것입니다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터, 신생아 쥐에 제약 제제 또는 세포의 전달에 적합하다.
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Protocol
프로토콜에 나열된 모든 절차는 오하이오 주립 대학의 동물 사용 및 관리위원회 (IACUC) 연구소 승인되었습니다.
작업 1. 준비
- 깔짚, 해부 현미경, 90 °로 주사 (광원의 사용 각도로 위치 될 수 광원으로부터 댐을 분리하는, 빈 케이지 마우스 새끼 마취 젖은 얼음 수집 주사 부위에 각도는 정맥), 주사에 대한 동물을 배치 깨끗한 표면, 면봉, 3/8 "30 G 바늘 (동물 당), 1 % 에반스 블루 염료 3/10 CC 인슐린 주사기 (가린다 교육을위한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)) 솔루션을했다.
- 새끼를 조작하면서 별도의 케이지에 댐을 제거합니다.
2. 사출 절차
- 동물을 마취하는 30 ~ 60 초 동안 얼음물에 직접 하나의 강아지를 놓습니다. t 방치하지 마십시오인해 심실 세동, 조직의 저산소증과 대사성 산증을 포함하여 저체온증과 관련된 합병증의 위험에 너무 오래 얼음에 그는 동물.
참고 : 우리의 경험은 30 ~ 60 초 분사를 허용하는 강아지의 움직임을 느리게하기에 충분하다는 것이다. 깊은 마취가 요구되는 경우, 예컨대 1 ~ 2 %의 이소 플루 란과 같은 흡입제가 적절할 수있다. - 동물이 얼음에 있지만, 에반스 블루 염료의 30 μL와 주사기를로드합니다.
- 동물이 완전히 마취되면, 여전히 호흡하는 동안 얼음에 운동 부족에 의해 확인 현미경으로 이동합니다. 오른손 주입 들어, 오른쪽으로 동물의 총구에 직면한다. 이어 버드는 색인과 중간 손가락 (그림 1) 사이가되도록 이어 버드에 총구와 왼쪽 가운데 손가락 꼬리에 왼쪽 검지 손가락을 놓습니다.
- 단지 피부가 조작 될 때 이동하는 표면 모세 혈관의 이어 버드로 전방 검사합니다. 이 모세관하지만, 대상이 아니다식별은 시간 정맥 식별을 위해 중요하다. 다음에 관계없이 피부의 위치에 고정되어 모세관 열등 어두운 그림자가 정맥을 찾습니다. 시간 정맥, 그림자가 나타납니다 지느러미에 복부 실행하고, 경정맥 (그림 1)에 공급한다.
- 바늘 베벨 위로 시간적 정맥을 입력합니다. 올바르게 삽입하면 바늘 베벨 피부를 통해 혈액으로 채워 볼 수있다. 그런 다음 천천히 플런저를 우울하게하고 노트는 얼굴의 측면 아래 정맥의 창백.
- 바늘이 주입 물 역류를 방지하기 위해 첨가 10-15 초 동안 정맥 내 유지하도록 허용.
3. 주입 후
- 적절한 주입 한 후, 강아지는 거의 즉시 파란색 설정해야합니다. 바늘을 제거하고 혈액 응고 될 때까지 주사 부위에 면봉을 적용하는 부드러운 힘을 사용합니다.
- 고통의 흔적이 강아지를 모니터링합니다. 강아지 2 ~ 3 분 복구하고 rewarm 허용, R강아지가 케이지에 반환하기 전에, 의식 수직 및 이동 때 ecognize. 컵 탐정의 장갑을 낀 손에 새끼 필요한 경우 복구에 도움이되는 적절한 온기를 제공합니다. 선택적으로, 주입 된 새끼 온난화 촉진하는 홈 케이지 하에서 가열 패드를 배치. 일반적으로 에반스 블루 염료를 주입 한 후, 새끼를 안락사. 시험 물질을 주입 할 때 염료를 포함하지 마십시오.
- 다시 홈 케이지에 강아지를 놓고 강아지가 댐에 의해 reacceptance을 보장하기 위해 침구 및 / 또는 nestlet로 코팅되어 있는지 확인합니다.
- 불임을 유지하기 위해 각각의 강아지에 대한 새 주사기와 면봉을 사용합니다.
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Representative Results
적절한 주입하는 동안, 정맥은 순간적으로 분명, 또는 희게을 설정해야합니다. 염료 주입하면 전체 강아지 초 이내에 파란색 설정해야합니다. 부적절한 분사가 발생한 경우, 종종 주사 부위 밖으로 누출 될 머리 또는 목 주입 물에서 농축 피하 볼 러스있다. 부적절한 주사는 또한 목 주위에 멍이의 모양이 발생할 수 있습니다. (분사가 완전히 정맥에 배달되지 않은 IE) 일반적으로 더 아픈 부작용을 경험하지 않고 적절하게 주입 된 쥐처럼 일상적으로 치료에 반응 피하 주사를받을 새끼.
제공되는 치료에 따라, 성공적인 주입은 중추 신경계 및 말초 기관에 광범위하게 전달 될 수 있습니다. 닭 β 액틴 혼성 프로모터 (CB)와 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 자기 무료 아데노 - 관련 바이러스 혈청 형 (9)를 주입하면, 트랜스 (함께 "scAAV9 CB GFP"이라한다)유전자 발현은 다수의 뇌 영역에 걸쳐 신경 교세포 및 신경 및 척수 (도 2A-2C) 내에서 발견된다. scAAV9 CB GFP의 혈관 내 주입은 또한 심장과 간 조직 (그림 3A-3D)에서 눈에 띄는 표정으로 주변에 걸쳐 광범위하게 발현을 초래한다.
그림 1 : (A) absorbant 패드 ( "기저귀")에서 만든 임시 주입 플랫폼은 50 ML 원뿔 포장 스티로폼 랙 감싸. 이 플랫폼은 연구자가 플랫폼 옆에있는 테이블에 손을 휴식 할 수 있습니다. 이 연구자는 마우스 강아지에 평평한 각도로 주입을 수행 할 수 있습니다. (B) 이미지가 앞과 중간 손가락으로 강아지의 고정을 표시합니다. (
녹색 형광 단백질 (scAAV9 CB GFP)을 표현 자체 보완 AAV9의 신생아 정맥 주사 다음과 같은 중추 신경계의 유전자 발현 1 (P1) 마우스 새끼는 정맥 자체의 1 × 11 벡터 게놈 (VG) 주사 하였다 출생 후의 일 : 그림 2. 보완 (SC) scAAV9 CB GFP. 사주 주입하면, 마우스를 희생하고 4 % 파라 포름 알데히드 관류. 조직은 수집 슬라이스 및 GFP 발현을 위해 염색 하였다. GFP 발현 전방 선조체 포함한 뇌에 걸쳐 볼 수있다 (A) 통해 서시간 뇌교와 소뇌 (B). GFP 양성 세포는 일반적으로 뉴런과 아스트로 사이트이다. GFP 발현은 또한 척수 (C)에서 검출된다. 척추 운동 뉴런과 후근 신경절 신경 세포를 효율적으로 신생아 IV 전달을 사용하여 형질 도입된다. GFP 양성 혈관 및 성상 세포는 척수 회백질을 통해 볼 수 있습니다. 모든 스케일 바는 200 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 자기의 신생아 정맥 주사 보완 AAV9 GFP (scAAV9 CB GFP) GFP의 면역은 성인 마우스 마음 (A)과 간 (C)에서 검출 할 다음과 같은 말초 기관에서 GFP 표현 (B) 및 간 (D)에 존재하지 않는다. 모든 스케일 바는 100 μm의 =.
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Discussion
CNS 또는 몸 전체 에이전트의 혈관 배달 질환의 신생아 쥐 모델에서 어렵다. 설명 프로토콜은 정맥 최소한의 장비 요구 사항에 신생아 쥐에 솔루션을 관리 할 수있는 빠르고, 비교적 비 침습적 방법입니다. 시간적 얼굴 정맥을 육안으로 볼 수 있지만, 주사는 특히 unpracticed 인젝터, 현미경 및 광섬유 광원의 사용과 높은 정확도를 가질 수있다. 신생아 마우스에서 혈관 내 주사는 높은 성공률 (12)을 가지며, AAV 형질 도입은 주입 물 중 일부가 피하 투여해도 이른 새끼에서 관찰되었다. 주입은 잘 마우스 새끼에 의해 허용 및 FVB / N 또는 C57BL / 6 배경에 댐 아주 잘 새끼의 조작을 허용한다. 그러나 드문 경우에 댐 전체 새끼를 파괴 할 수 있습니다. 이러한 주사 성공적 1.6 g 내지 0.8 g 정도로 작은 마우스에서 수행 될 수있다. 대체 injectioN 신생아 쥐 루트는 미국과 복고풍 궤도, intrajugular 및 복강 내 10,15,22를 포함하여 다른 사람에 의해 발표되었다. 이 특별한 장비 요구 단일 실험자에 의해 수행 될 임상 관련성 수 있으며, 투여되는 볼륨의 광범위한 허용하기 때문에 여기서는 설명 주입 경로를 선호한다.
주사를 수행하는 어려움 시간적 정맥을보고 바늘의 그러므로 잘못 배치 때 일반적인 문제는 경험. 광섬유 광원 <90 °에 위치하여 정맥의 가장 좋은보기 위해 개최되는 때 머리에 아래로 빛나는되어야한다. 인젝터는 자신의 필요에 맞게 광원을 조정하기 위해 시간이 걸릴 것이다. 시간적 정맥 관찰이 크게 새끼가 너무 큰 2.0 g보다 P2 다음 세 이상으로 특징있는 경우 감소합니다. 바늘 베벨은 정맥을 입력 한 경우 두 번째 문제는 결정 할 수있다. 시간적 얼굴 정맥 superfi입니다인공,주의를 정맥 아래에 입력하지 않도록주의해야합니다 그래서. 바늘 베벨은 정맥에 평행하게 입력되는 것을 보장하는 것은 정맥을 통해 천공을 방지 할 수 있습니다. 니들 배치는 가장 느린 주입과 정맥의 후속 치면 확인됩니다.
피상적 인 시간적 정맥은 머리의 양쪽에 볼 수 있습니다. 왼손잡이 개인 연구자의 왼쪽에있는 동물을 직면하는 것은 인체 공학적으로 잘 할 수 있고, 각각의 개별 조사 결정되어야 함을 알 수 있습니다. 정맥 보이지 않아야 또는 헤드의 반대측에 정맥 타겟팅 초기 시도에 mistargeted 것은 적절하다. 정맥이 헤드의 양측에 천공되는 경우, 일부 누설 번째 사이트 내로 주입 중에 제 사이트를 통해 발생할 수있다. 현미경의 작동 거리에 따라, 동물을 주입하기에 작은 플랫폼을 구축하는 것이 적절할 수있다; 50 ML 원뿔에서 예를 들어, 빈 스티로폼 용기튜브 포장 (그림 1). 이 연구자의 주입 손 테이블에 직접 놓을 수 있도록 조사자 플랫폼의 가장자리 근처에 동물을 배치 할 수있다. 이는 정맥 진입 각도를 개선하고 광 방해를 최소화 할 수있다.
주입량, 주입 용 연령 창과 댐 응답의 예측 불가능 성을 포함한 프로토콜 유틸리티 몇 가지 제한이있다. 새끼에 대한 주입량 50 μL로 제한됩니다. 우리는 이전에 100 μL로 동물을 투여했지만, 낮은 볼륨 주사에 비해 증가 주입과 관련된 사망률을 관찰하지만, 다른 사람은 성공적으로 100 μL (10, 12)을 제공하는 보고서입니다. 또한, 증가 된 주입량이 혈액 뇌 장벽 (23)에 손상을 줄 수 있음이 제안되었다. 종종 실험 시약 50 μl의 일정한 주입 부피를 유지하기 위해 PBS와 혼합된다. 우리는 연구의 인식하지 못하고있다 examini신생아 마우스 전반에 걸쳐 확산에 주입 볼륨의 효과를 ng를, 경험적 연구가 주어진 용량으로 새로운 시약 주입량에 대한 영향을 파악하기 위해 수행되어야한다. 두 번째 제한은 표재성 정맥 시간적 상기 제 1 및 제 2 일 산후에 쉽게 볼 수 있다는 것이다. 동물의 크기, 피부 색소 침착 및 두께에 대한 변경 사항은 다른 사람들이 출생 후 6 일째 (10, 12)을 통해 정맥에 접근보고하고 있지만 나중에 나이에 정맥을 모호하게 결합한다. 또한, 우리는 P5의 순환과 P10 동물 4 바이러스 벡터를 제공하기 위해 초음파 유도 심장 주사를 사용했다. 마지막으로, 절차의 마우스 댐의 수용은 예측할 수 없다. 우리는 신경 근육 질환과 자폐증 스펙트럼 장애의 마우스 모델에서 FVB / N, C57BL / 6 B6SJL 마우스를 처리했다. FVB / N 마우스는 C57BL / 6 배경에 긴장이 때때로 개인의 새끼 또는 전체 새끼를 파괴 할 수있는 동안 가장 관대하지만이 드문. 그러나,이실험에 대한 충분한 n에 대해 계획 할 때 고려되어야한다. 댐 수용 더욱 어떤 질환 마우스 균주 인 모델링에 의해 영향을받을 수있다. 예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애의 모델은 배경 균주에 기초하여 예상보다 강아지 거절의 훨씬 더 높은 속도를 가지고 있었다. 댐 수용이 문제가되는 경우 새끼를 육성하는 것이 고려 될 수있다. 거절을 제한하는 다른 방법은 초음파 발성을 강아지하고, 댐의 코를 문질러 및 / 또는 천으로 새끼가 어떤 조사 향기에 마스크를 70 % 에탄올에 적신에 대한 액세스를 제한하기 위해 댐과는 별도의 방에 주사를 수행하는 것을 포함한다. 새끼는 수용에 도움이 더러운 침대에 문질러해야합니다.
이 프로토콜은 성공적 SMA의 마우스 모델을 치료하는 데 사용되어왔다. SMA는 기본적으로 척수의 하위 운동 신경에 영향을 소아 신경 퇴행성 질환이다. 치료를하지 않으면,이 마우스 모델은 평균 출생 후 15 일까지 죽는다. AF일일 된 마우스에서 AAV 유전자 치료의 터 정맥 주사, 생존 기재된 사출 프로토콜 2,4,14의 안전성과 내약성을 보여, 1 년 연장되었다. 유사한 결과가 또한 안티센스 올리고 뉴클레오티드 8,9의 IV 주입 다음 동일한 SMA 마우스 모델에서 얻어졌다. 미래의 응용 프로그램은 다른 세포 및 유전자 치료제의 전달뿐만 아니라 외생의 cDNA 또는 RNAi의 카세트 (24)을 표현하는 CNS와 주변의 발달 장애에 대한 신생아 모델의 생성을 포함한다. 정맥 주사는 전달의 승인 된 임상 방법이다; 따라서,이 기술의 활용은 에이전트의 다양한 임상 시험에서 유리할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 금융 지원을위한 SMA의 NINDS, FightSMA, 가족을 인정하고 싶습니다. SEGL은 NINDS 훈련 보조금 # 5T32NS077984-02에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
References
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