Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Скелетных мышц имеет важное значение для передвижения и является основным магазин белок органов. Измерения здоровья мышц внутри C. Элеганс описаны. Предполагаемые изменения в структуре и функции мышц оцениваются с использованием локализованного GFP и катионные красители.

Abstract

Мышцы это динамичная ткань, которая реагирует на изменения в питании, физических упражнений и болезненного состояния. Потеря мышечной массы и функции с болезнью и возраста значительные тяготы здравоохранения. В настоящее время мы понимаем, немного о генетической регуляции здоровья мышц с заболеванием или возрастом. Нематода C. Элеганс является признанным образцом для понимания геномной регуляции биологических процессов, представляющих интерес. Стенки тела мышцы этот червь отображают большую степень гомологии с мышц высших многоклеточных видов. Поскольку C. Элеганс является прозрачным организм, локализация GFP в митохондриях и саркомерах позволяет визуализировать этих структур в естественных условиях. Аналогичным образом, кормление животных катионные красители, которые накапливаются на основе существования митохондриальной мембранного потенциала, позволяет оценить митохондриальной функции в живом организме. Эти методы, а также оценка из мышечного белка homeostaSIS, в сочетании с оценкой всей животной мышечной функции, в виде движения анализов, чтобы позволить корреляцию субклеточных дефектов с функциональных показателей эффективности мышц. Таким образом, С. Элеганс представляет собой мощную платформу, с помощью которой для оценки влияния мутаций, генной нокдаун, и / или химических соединений на структуру и функции мышц. И, наконец, как GFP, катионных красителей, а движение анализов оцениваются неинвазивно, перспективные исследования структуры и функции мышц может быть проведена на всей жизни, конечно, и это в настоящее время не могут быть легко исследованы в естественных условиях и в любом другом организме.

Introduction

Мышцы это многофункциональный ткани, хорошо оценили за его роль в двигательной, постуральной поддержки и обмена веществ. Развитие и поддержание здорового мышцы требует координации нескольких клеточных процессов и компонентов. Либо через повреждение или болезнь, нарушение регуляции может произойти, в результате чего измененной структурой и / или мышечной функции. Связанное с возрастом снижение функции мышц представляет собой значительную нагрузку на бюджеты здравоохранения в западном мире, так как мышечная масса 1,2 и особенно мышечная сила и выносливость 3-5 отрицательную корреляцию со смертностью. Измерение аспектов, связанных с ухудшением функции мышц, такие как измененное митохондриальной функции или нарушения саркомера, может позволить большее понимание механизмов, лежащих в основе общего развития и здоровья мышц.

С aenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является микроскопические нематоды бест известно, потому что это был первый многоклеточный организм, чтобы иметь весь его геном последовательность 6, первый есть гены замолчать с помощью РНК-интерференции 7, и только метазоа иметь свои Вся клональные клеток 8 и нейроанатомии 9 определяется. C. Элеганс впервые была предложена в качестве модель для изучения генетического контроля поведения в 1974 году Сидней Бреннер 10 и важности этого и последующих работ была признана с первым из трех Нобелевских премий, присужденных C. Элеганс исследователей. Около 35% C. Элеганс гены определили ортологи в людях, с C. Элеганс является ключевым организм используются для понимания генетического контроля развития мышц 11. Почти каждый ген в C. Элеганс генома может быть сбит с помощью РНК-интерференции 7,12. Таким образом, сбивая генов в полностью развитой мышцы, генетические компоненты вклад в реgulation здоровья мышц могут быть исследованы с относительной простотой 13.

Комбинированный Возможность использования RNAi, мутанты, и химические соединения делает C. Элеганс ведущим системы для изучения генетической регуляции 7,14,15 структуры и функции мышц с возрастом 16 и в моделях болезни 17. Воздействие генной мутации нокдауна, и / или воздействием химических соединений от структуры и / или функции мышц может быть измерена с помощью нескольких аспектах. Здесь мы кратко опишем простые методы для оценки C. Элеганс структуру и функцию мышц, многие из которых могут быть использованы в перспективных исследований здоровья мышц.

Развитие зеленого флуоресцентного белка (GFP), 18 позволила визуализировать как местности специфических белков и общей структуры органелл в C. Элеганс. Здесь мы объясним, как GFP выразил специфичнуюfically в тела стены мышц митохондрий, ядра, или саркомеры может использоваться для определения того, дистрофия этих субклеточных структур присутствует. Как структура не всегда является надежным суррогатом функции, мы также объяснить, как использование катионных красителей в естественных условиях позволяет оценить нарушения митохондриального мембранного потенциала в мышцах. Когда красители используют в сочетании с GFP, они позволяют изучать архитектуру и функции в височной образом на протяжении срока службы. Наконец, мы также объяснить, как белка гомеостаз в мышцах может быть оценена и как все эти меры могут быть использованы для корреляции изменения в целый здоровья мышц животных посредством использования движения анализов. Эти методы, в сочетании с генной мутации, нокдаун, и / или химических соединений обеспечивают мощный арсенал для изучения того, как специфические гены или соединения влиять на здоровье мышц в естественных условиях. Параллели в структуре, метаболизме и валового функции мышцы между C. Элеганс имлекопитающие значит С. Элеганс представляет собой выдающийся пример организм для понимания регулирование мышцы у высших организмов, включая человека.

Protocol

1. Штаммы, культура, и микроскопия

  1. Обращении и обслуживании штаммы C. Элеганс, как описано выше 19. Штаммы доступны из генетики Центра Caenorhabditis (CGC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, используемые в этих экспериментах были CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-LacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) я; он-8 (e1489) IV) с GFP слитых белков, локализованных в митохондриях и ядрах; PJ727 (jls01 (мио-3 :: GFP, рол-6 (su1006)); UNC-54 :: LacZ V) с GFP слитых белков, локализованных в сократительного аппарата и PD55 (ccIs55 (SUP-7 (СТ5); unc- 54 :: LacZ) V) с β-галактозидазы слитых белков, локализованных в цитоплазме.
  2. Полные эксперименты РНК-интерференции, как ранее описанные для разных поколений экспериментов RNAi 13 и получить RNAi бактерии из последовательности проверяется библиотеку ORF-RNAi построенный Марком Видаль и др. 12.
  3. Построить штаммов, содержащих <EM> ИССА 4251, jls01 или ИССА 55 с использованием стандартных методов 20. Используйте эти трансгены создать напряжение для оценки митохондриальной структуры сети, миозин организацию или состояние proteostasis, соответственно. Крест штаммов в мутанта, где на одной из этих субклеточных отсеков в желании каждое животное.
  4. Использование ингибитора PtdIns-3-киназы, LY-294002 (LY), как описано выше 21. Вкратце, добавить LY-294002, в конечной концентрации 160 мкМ в верхней части сухих OP50 семенами NGM пластин.
  5. Захват всех изображений с использованием GFP фильтр для GFP основе экспериментов и микроскоп с тройным фильтром, который позволяет визуализации красного, зеленого и синего каналов одновременно для оценки в естественных условиях мембранного потенциала с C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, обычно продается как Mitotracker Красной CMXRos. Провести анализ изображения и подготовку рисунок в программное обеспечение для обработки изображений.

  1. Минимум 1 сутки до необходимости сделать M9 буфер - 22,04 мМ KH 2 PO 4, 42,27 ммоль Na 2 HPO 4, 85,56 ммоль NaCl (конечные концентрации), и стерилизовать в автоклаве. После охлаждения до 45 ° С, добавить стерильный MgSO 4 до 1 мМ, после обработки в автоклаве, чтобы предотвратить осаждение 22. Разрешить М9 остыть при 4 ° С и аликвоты в 50 мл пробирки.
  2. В день эксперимента, добавить 3 мл M9 буфер с одной пластиной 9 см с большим числом L1 личинок. Промыть пластины многократно путем аспирации жидкости M9 и пипетирования против поверхности агара с пластиной держать под углом.
  3. Промыть L1 от пластины, а затем передать M9 в пробирку на 10 мл с помощью пипетки.
  4. Оставьте в течение 2,5 мин, чтобы позволить большей взрослых и более поздние стадии личинки животных, чтобы упасть на дно пробирки и мелкие животные L1 остаются вблизи топ буфера M9.
  5. Удалить верхние 500 мкл M9 в пробирке с помощью пипетки. Затем пипетки М9, содержащей L1 личинок на новый NGM пластины затравку 500 мкл OP50 с помощью препаровальной лупы.
  6. Как правило, цель перенести ~ 200-300 L1 личинок на чашку. Монитор пластин ежедневно с взрослой жизни и, при необходимости, выбрать животных на свежих OP50 NGM пластин для предотвращения источником питания OP50 потребляется.
    Примечание: Это, как правило, 1-3 капли M9 с использованием пипетки P1000, хотя это зависит в значительной степени в зависимости от количества L1 на исходной пластине.
  7. Если перспективные исследования в отдельных животных желательны, когда животные достигают совершеннолетия, подобрать индивидуальные животных отделить сеяных NGM пластин. Передача животных каждый 24-48 ч, чтобы отделить от личинок животных.

3. Движение Анализы 19

  1. Минимум 2 ч до начала экспериментов, удалить 50 мл аликвоты M9 и позволить, чтобы уравновесить до комнатной температурытературы.
  2. Pick одну взрослое животное в 50 мкл буфера М9 на предметное стекло микроскопа.
  3. Подсчитайте количество левых и вправо изгибов тела в 10 сек, где один влево и один вправо изгиб равна одним ударом.
  4. Повторите подсчет ударов тела, чтобы дать в общей сложности не менее 5 измерений, из которых в среднем может быть принято. Умножьте эти цифры на шесть, чтобы дать скорость движения в минуту.
  5. С помощью пипетки, передать животное обратно в чашку Петри. Этот метод позволяет временную измерение движения на протяжении всего срока службы в С. elegan с.

Рисунок 1
Рисунок 1: Движение анализы. После того, как черви собирают в буфер, один влево (A) и один вправо (B) изгиб добавляются вместе, чтобы дать один полный движение(Инсульт).

4. Визуализация митохондриальных сетей и саркомеры в орган Уолл Muscle

  1. ПРИМЕЧАНИЕ: В тот же протокол применяется для визуализации как митохондрии и саркомерах.
  2. Синхронизация червей, как описано выше (раздел 1) и расти в течение 48-60 ч при 20 ° С, когда они достигнут молодом возрасте.
  3. Выберите 20 червей (представитель пластины) из пластин в 20 мкл M9 на предметное стекло.
  4. Нанесите покровное и перейти к изображению с помощью флуоресцентного микроскопа под GFP фильтр (460-500 нм, синий возбуждения свет) в 40-кратном увеличении.

5. Оценка мембранного потенциала с помощью в естественных условиях Накопления Пробирной с Mitotracker Красной CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Синхронизация CB5600 (раздел 1), все помечены GFP в митохондриях мышц, и расти, чтобы в начале взрослой жизни на NGM содержащей OP50 для 48-60 часов при температуре 20 ° С.
  2. Добавить 100 мкл ДМСО к 50 мкг аликвотой C 32 H 32 Cl 2 N 2 O с получением концентрированного раствора 940,692 мкМ.
  3. Принимать по 1 мкл исходного раствора 940,692 мкМ и ресуспендируйте в 199 мкл M9 создать рабочий раствор 4,70 мкМ (4,70346 мкм). Подготовить этот в коричневых 1,5 мл пробирки, потому что C 32 H 32 Cl 2 N 2 O является светочувствительная.
  4. Подготовка 20 мкл аликвоты 4,70 мкМ рабочий раствор (20 взрослых червей в 20 мкл аликвоты).
  5. Выберите 20 взрослых животных в 20 мкл 4,70 мкМ С 32 Н 32 Cl 2 N 2 O в коричневых 1,5 мл пробирки. Инкубируют при 20 ° С в течение 1 часа.
  6. После 1 ч инкубации, добавить 1 мл M9 с коричневыми 1,5 мл пробирки, содержащие червей, центрифуги в 2000 мкг в течение 10 сек, а затем удалите супернатант. Повторите эту стирки шаг до ресуспендированием червя осадок и передачи оставшихся 20 μл (содержащий червей) на слайде для визуализации.
  7. Возьмите образы митохондриях с 40-кратном увеличении, используя тройной фильтр, который позволяет визуализировать обе красные, синие и зеленые каналов одновременно. Изображений с использованием тройной фильтр показывает совместной локализации C 32 H 32 Cl 2 N 2 O с GFP локализованный в митохондриях, появляющихся как апельсин.
  8. Приняв образ оранжевой митохондрий, фото-отбеливание животное в течение 10 сек, используя свет с длиной волны 540/25-нм на максимальных настройках со всеми снятыми фильтрами. Это будет отбеливать красный внутри митохондрий и выявить митохондриальную GFP в покое, чтобы подтвердить колокализацию в мышечных митохондрий.

6. Оценка мышечного белка деградации в С. Элеганс

  1. Синхронизация PD55s (или любой штамм, содержащий трансген LacZ) на на NGM пластин затравку OP50 (раздел 1). Растут в молодом возрасте для 48-60 часов при 2От 0 ° C.
  2. Pick 20 взрослых червей в 20 мкл DDH 2 O на предметное стекло микроскопа. Будьте осторожны, чтобы попытаться выбрать только червя, а не любые бактерии с выбором. Этикетка микроскопа карандашом.
  3. Поместите в эксикаторе в течение 30 мин, чтобы высушить и трещины кутикулу животных. Убедитесь, герметичное уплотнение на эксикаторе с использованием смазки вокруг уплотнения.
  4. Проверьте усыхание был эффективным при вскрытии рамки (рисунок 2).
  5. Погрузите стекло микроскопа в ледяной ацетоне в течение 3,5 мин затем оставить стекло микроскопа на бумажном полотенце при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы позволить ацетон на слайде испаряться. В этот момент растопить X-Gal и окислению буфер и позволяют уравновешивания до комнатной температуры.
  6. Добавить 2 мкл X-гал до 100 мкл буфера окисления и вихря осторожно, чтобы обеспечить это однородная. Это X-гал / окисления буфер мастер микс.
  7. Добавить 20 мкл X-гал / окисления буфер мастер микс друг опервоначально оплащенной площадью 20 червей. Осмотр с помощью препаровальной лупы, чтобы обеспечить Master Mix полностью охватывает все животные полностью. Осторожно наклоните стекло микроскопа для перемещения основной смеси над районами, где животные не распространяется.
  8. Поместите стекло микроскопа во влажной камере в течение 1-2,5 ч при 20 ° С. Image животные, когда темно-синий цвет присутствует в стенки тела мышц контрольных животных. Оценка контрольных животных с помощью препаровальной лупы каждые 15 мин, чтобы определить, когда животные должны быть отображены.

Рисунок 2
Рисунок 2: Оценка деградации белков мышечной использованием β-галактозидазы анализов. (A) Животные, содержащие LacZ трансген собирают с чашек Петри с 20 мкл DDH 2 O на слайде микроскопии (B). Животные обезвоживанию и стать перелом (D). После того, как ацетон испаряется X-гал / окисление буфер Master Mix добавляется (Е). Развитие синего цвета у контрольных животных не оценивали с интервалом 15 мин (FL) с Т = 0 мин (F), пока синий цвет получается по всей длине животных (L). Изображения червей принимаются на 2.5 x увеличение в AE и 8X в штат Флорида. Наезд C, D, F, G и L являются 4X оригинал увеличения.

Representative Results

Движение Анализы для Количественная Движения дефекты

Снижение Движение является хорошим предиктором смертности в С. Элеганс 16, со снижением ставки, указывающие проблемы с нервно-мышечной системы. Изменения в движении, по оценке движения анализов, может быть результатом РНК-интерференции в отношении конкретного гена или лекарственной терапии (рис 3-5) или в мутантных животных 13, 23. Снижение движения могут возникнуть в результате измененного развития, например, следующее развития сбить генов транспортных электронных кодирующих сложную I, III, IV или V 24. Кроме того, конкретные меры могут быть проверены на только взрослых C. Элеганс в целях изучения влияния на физиологию после развития. Например, у животных, обработанных РНК-интерференции против UNC-112, который кодирует C. Элеганс ортолог Kindlin-1, который локализуется в интегрину содержащийкрепления мышц комплексы (Рисунки 3 и 4), или газ-1, который кодирует компонент комплексной I в электрон-транспортной цепи (рисунок 4), отображать прогрессивное снижение движения против контроля со 48-72 ч после совершеннолетия. Это может свидетельствовать о проблемах с мышечной физиологии. Точно так же, потеря движения с 24 - 72 часов наблюдается в ответ на лечение, как правило, разработанных взрослых с лечения с PI3K ингибитора LY-294002 (рисунок 5). Возможно также, чтобы проверить эффект лечения на второй RNAi, мутации, или препарата в восстановлении движение в животных отображения восстановленного движение в ответ на первоначальный вмешательства. Например, unc- 112 мутанты отображения количественному снижение движения по сравнению с животными дикого типа, что ослабляется в присутствии второго мутации в DIM-1 13. Таким образом, движение анализы могут выявить как вмешательства, которые изменяют neuromuscuРазвитие лар и / или функции, а также те, которые улучшают и / или восстановления нервно-мышечной функции.

Оценка саркомера Срыв

Определив дефект движение, часто желательно, чтобы определить, является ли причиной дефекта движения можно объяснить проблем в нервах, мышцах, или обоих. Саркомеры являются мульти-белковых комплексов в пределах мышцы, которые позволяют сокращения и тем самым заставить поколения и движение. Благодаря использованию животных, выражающих миозина GFP слитых белков, локализованных в сократительного аппарата, степень разрушения, чтобы миозина и саркомерах можно наблюдать относительно неинвазивным и перспективно в отдельных животных через развитие и / или в зрелом возрасте. Животных дикого типа отображения одевался саркомеры, которые появляются как несколько зеленых параллельные прямые в пределах каждого стенки тела мышцы (рисунок 3). Срыв этих нормальных массивов могут быть сравнительно незначительными свыстроенные саркомеры появляющиеся объединить, а не остается параллельно. Этот фенотип, видно с UNC-112 РНК-интерференции при Т = 24 ч или 48 ч (Рисунок 3), сравнима с Z-линии потокового актиновых участков присоединения в мышцах млекопитающих. Точно так же, небольшими порциями массивов может рухнуть или они могут полностью исчезнуть, например, лечение с UNC-112 РНК-интерференции при Т = 48 ч или т = 72 ч (Рисунок 3). Наличие дефектов саркомера в мышцах животных, которые отображают дефект движения (Рисунок 3) достаточно, чтобы учесть дефекта движения, но не обязательно исключить другие проблемы с мышцы, нервы и / или других тканей в ответ на вмешательство ,

Оценка Митохондриальная сетевой структуры

При наличии дефекта движения иногда желательно изучить мышцы для других дефектов, которые могут вызвать или способствовать движению дефект. Митохондрии обеспечивают основную часть клеточной энергии и снижение в движении, может быть результатом пониженного предоставления АТФ, уменьшая энергию, доступную для сокращения мышц. Таким образом, структура митохондрий может быть проверены на предмет аномалий. Важно, чтобы не анестезировать животных с азида натрия как он вызывает быстрое митохондриальной фрагментации; животные в этих экспериментах были иммобилизованы посредством давления, приложенного к покровным стеклом. В дикого типа C. Элеганс стена мышцы тела, митохондрии содержатся в организованных сетей (рисунок 4) и митохондрии существуют и функционируют как ретикулума 25. Срыв сети митохондрий представляет как фрагментации сети (газ-1 РНК-интерференции, 4Б) 26. Дробление может стать достаточно серьезным, что ни один подобие организованных сетей не остается, таких как обработка UNC-112 (RNAi фиг.4В и С) 13. Как Wiго нарушения в структуре саркомера, дефекты в мышечной структуры митохондрий в животных, которые показывают дефект движение может быть достаточно, чтобы объяснить дефекта движения, но это не обязательно исключить другие проблемы с мышцей, нервов и / или других тканей. Например, UNC-112 мутанты 13 и лечение с UNC-112 РНК-интерференции (3 и 4) дисплей обоих разрушенных саркомерах и нарушается митохондриальной структуры.

Оценка функции митохондрий в естественных условиях

Митохондриальная мембранный потенциал определяет способность митохондрий по созданию протонного движущую силу и генерируют АТФ 27, поэтому способность оценивать митохондриальной мембранный потенциал в естественных условиях свидетельствует о способности этого животного для получения АТФ. Как митохондриальные структурные нарушения могут или не могут изменять митохондриальной функциональную способность, он может быть Дезитны оценить функцию митохондрий в животных, отображающих изменениями митохондрий структуру. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O накапливается в митохондриях, из всех типов клеток, где мембранный потенциал присутствует и пятна митохондрии 28 (рис 4в). Чтобы конкретно оценить функцию митохондрий в мышцах, можно использовать C 32 H 32 Cl 2 N 2 O и GFP помечены мышечные митохондрии продемонстрировать последствия вмешательства специально при мышечных митохондрий (рис 4в). Например, утрата митохондриальной мембранного потенциала после обработки UNC-112 RNAi предотвращает C 32 H 32 Cl 2 N 2 O от входа в матрицу. Митохондрии поэтому показывают мало, если таковые красный окрашивание митохондрий в дополнение к GFP маркировки митохондрий (фиг.4С). Фото-отбеливание также может быть использован для подтверждения того, что наблюдаетсяМитохондрии являются особенно те, в мышце (фиг.4С). Идентификация пониженной мощности для производства АТФ является достаточным для объяснения наблюдаемого дефекта движения, но не исключает другие проблемы в мышцы, нервы, и / или другие ткани. Несмотря на это, как снижается объем производства АТФ связан с болезненными состояниями у человека 29 и старения 30, ​​идентификация такого дефекта в ответ на вмешательство обеспечивает платформу для скрининга соединений и / или РНК-интерференции лечения, которые улучшают ATP производственные мощности, и они могут затем дальнейшего изучения для терапевтического потенциала.

Оценка белка деградации

В присутствии дефекта движения и нормальных саркомеров и митохондрий иногда желательно, чтобы изучить мышцы для других дефектов, которые могут вызвать или способствовать дефекта движения. Способность поддерживать белковый гомеостаз является подпись, нимал здоровья, в то время как к снижению синтеза белка и / или увеличению деградации белков является следствием старения 31 и множественных болезненных состояний 32,33. Поэтому может быть желательно, чтобы изучить мышцах животных с дефектом движение за измененного гомеостаза белка. Это может быть достигнуто с помощью оценки уровней цитозольных белков мышц. Использование трансгенно кодируемых белков позволяет оценить мышечной специфической proteostasis. Например, использование животных, содержащих β-галактозидазы, слитый с N-концевой части миозина, который синтезируется под контролем промотора миозина и энхансер позволяет оценить содержание белка в цитозоле мышц 19. Наличие синевы у взрослых дикого типа демонстрирует наличие активной β-галактозидазы и отсутствие патологического цитозольным деградации белков. Потеря окрашивания в ответ на лечение предполагает ухудшение патологический белок происходит (фиг.5 13,14,19. Например, необработанные животных дикого типа отображения интенсивный синий краситель 72 часа после совершеннолетия, в то время как LY-249002 обработанных животных отображать отсутствие пятен (рисунок 5). Как и дефектов в структуре саркомера и функции митохондрий, наличие патологического деградации мышечного белка достаточно, чтобы счет за наблюдаемого дефекта движения, но не обязательно исключить другие проблемы с мышц, нервов, и / или других тканей.

Рисунок 3
На рисунке 3: (А) UNC-112 RNAi вызывает значительное движение дефект при Т = 72 ч (В) Оценка упорядоченной структурой-диапазона в пределах стенки тела мышцы.. В жт, А-полосы в мышцах появляются как прямые линии на юношеском возрасте (т = 0 ч) и не остаются в значительной степени однородным, пока за 72 часа взрослости (см зум вес). UNC-112 РНК-интерференции вызывает саркомеры потерять архитектуру в небольших районах мышца (т = 24 ч), рухнула, и недостающие саркомеры (т = 48 ч), агрегация (т = 72 ч верхняя панель и зум) и потеря линейности саркомерах (т = 72 ч нижней панели и зумом). Шкала бары представляют 25 мкм и частое изменение 2.5X.

Рисунок 4
Рисунок 4: (А) UNC-112 или газа-1 RNAi вызывает дефект движения (В) Оценка митохондриальной структуры внутри тела стенки мышцы.. Митохондрии в мышцах появляются как сетевые прямые линии на юношеском возрасте (вес). Лечение животных UNC-112 РНК-интерференции приводит mitochondrриала фрагментация как наблюдалось ранее между 24 ч и 72 ч взрослости (зумирования и стрелкой) 13. Точно так же, РНК-интерференции против газа -1 приводит к фрагментации митохондрий сетей как ранее наблюдалось 26. Они присутствуют в виде небольших зазоров в митохондриальной сети при Т = 24 ч и прогресса распространенной дезорганизации в 72 ч (см зум и стрелку). (С) оценки митохондриальной мембранного потенциала в естественных условиях. У животных также содержащих GFP локализуется в митохондриях, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O накапливается в стенки тела мышечных митохондрий и цвет на оранжевый под тройной фильтр от юношеском возрасте (т = 0 ч) до 72 ч после совершеннолетия. Лечение с помощью UNC-112 RNAi вызывает прогрессирующую потерю мембранного потенциала, как показано на 72 ч, где остальные митохондрии, показывают меньшую накопление C 32 H 32 Cl 2 N 2 O по сравнению мас. Фотообесцвечивания для 10 таковойС помощью 540/25 нм луч просветляет красный от Mitotracker и раскрывает GFP локализованный в мышечных митохондрий (+ Фото отбеливания). Шкала бары представляют 25 мкм и масштабирование являются 2.5X.

Рисунок 5
Рисунок 5: (а) обработку LY-294002 животных индуцирует недостаток движения (B) оценка деградации белка с использованием β-галактозидазы анализа.. Возраст синхронизированы мас L1 личинок выращивают в юношеском возрасте при 20 ° С (Т = 0 ч) до передачи в NGM затравку (OP50 управления мас) или NGM затравку LY-294002 (PI3K лечения ингибитором) в течение 24 ч при 20 ° С , В А, примерно 20-30 животных окрашивают для β-галактозидазы (синий) при Т = 0 ч и после 24 часов, 48 часов и 72 часов.

Discussion

Эти методы позволяют разведку мышцы от macrophysiology движения для идентификации субклеточных дефекты, которые достаточно, чтобы вызвать дефект движения. В сочетании эти методы позволяют детальный анализ мышцы. Понимание получила позволяет дальнейшее тестирование мышц-ориентированных гипотез, относящихся к общей физиологии, патофизиологии и старения.

Движение Анализы

Дефект движение указывает на нарушение нормальной нервно-мышечной функции. Это могут быть специфическими для нервов или мышц, или он может быть общим между несколькими тканей. Самые трудные этапы комплектующих анализов движения выбираете червей, которые являются репрезентативными для населения и / или лечения, а также обеспечение того, чтобы экспериментатор не травмировать животное при переходе на М9. Важно иметь большой размер выборки, чтобы получить представительную и точную оценку движения. Когда анализируя высоко пероetrant эффекты, например, как часто можно увидеть в мутантов, размер выборки из десяти животных каждый оценивается для движения в десять раз достаточно найти статистически значимых различий в сравнении дикого типа. Тем не менее, простота анализов движения и легкости культивирования C. Элеганс означает, что сотни червей быстро можно оценить с тем чтобы обеспечить количественно надежные результаты. Когда анализируя эффекты, которые появляются присутствует только в части популяции важно, чтобы определить, какая часть населения по-видимому, будут затронуты, а также от тяжести дефекта в наиболее пораженных животных. В таких ситуациях большее число животных должна быть оценена, чтобы обеспечить минимальные данные для части населения пострадавших. Часто оба препарата и РНК-интерференции лечения будет производить тяжелые дефекты движения в небольшой части населения. В некоторых случаях увеличение дозы лечения и или способа доставки будет увеличивать долю AFFected животные и кривые зависимости ответа от дозы бег может быть полезен при определении оптимальной концентрации лекарственного средства или РНК-интерференции. Второе ограничение этого движения анализе является то, что черви манипулировать, чтобы оценить движение. Таким образом, черви и стимулируется и подвергают какой-то степени осмотического стресса при получении в жидкость. Степень осмотического стресса может быть ограничен с помощью M9 или BU буфера 19, в отличие от воды. Некоторые из этих ограничений смягчаются путем измерения привычный движение на пластинах с использованием коммерчески доступных системы слежения 34 или бесплатные плагины для ImageJ 35. Измерение скорости движения животного могут предоставить важную информацию о здоровье в целом мышц, в том числе изменения в функции, которые можно измерить на протяжении всей жизни и не-инвазивность этого метода является ключевым для потенциальных пожизненных исследований функции мышц.

Визуализация сократительного аппарата

<р класса = "jove_content"> Штамм червь используется здесь для структуры изображения сократительного аппарата был PJ727 36 выражающее миозина GFP слитый белок, который ограничен к саркомерах в стенки тела мышц. Использование этого штамма позволяет визуализировать структуры саркомера в живых животных. Аналогично движению анализа, описанного выше, ключевым преимуществом использования GFP помечены саркомеры оценить структуру саркомера является то, что метод является относительно неинвазивным и, следовательно, может быть использован для перспективно следовать структуру саркомера в отдельных животных на протяжении всей жизни. Наибольшую трудность этого метода является то, что черви, которые изображаемого живы и поэтому движется, что делает его трудно получить хорошо сфокусированные изображения. Несколько методов могут быть использованы, чтобы уменьшить движение и сделать более простым визуализации; они включают обезболивающее или парализует червей и иммобилизации через давление, всасывания или использованием высокой решения вязкости. Каждый из этих методов immobilizция имеет тот недостаток, что он может сам изменять нервно-мышечную функцию. Таким образом, крайне важно, чтобы включать в себя соответствующие необработанными контрольными в анализе. Он также может быть целесообразно использовать по крайней мере два независимых методов иммобилизации, чтобы подтвердить результаты не из-за проблем с методом иммобилизации, в зависимости от того, как широко используемый метод иммобилизации выбранные для изучаемого вопроса. Здесь мы использовали простой давление от покровного стекла на червя, чтобы вызвать пониженное движение. После размещения покровное, жидкость под покровным испарится и покровное будет, следовательно, начинают производить больше давление на червей, как правило, это занимает 2-5 минуты, чтобы произвести достаточное снижение движение, чтобы позволить легкий изображений.

Важно следить за червей тесно после покровное была введена как давление в конечном итоге увеличить достаточно, чтобы вызвать червей лопнуть от избыточного давления, как правило, 10-15 минут после сотрудничестваverslip дополнение. Дополнительная буфера могут быть введены с помощью наконечника пипетки вокруг краев покровного стекла, чтобы избежать травм на раздавливание червей. Окрашивание ногтей может быть использован для герметизации краев покровным стеклом и предотвратить испарение, хотя это предотвращает извлечение животных из-под покровным стеклом, при желании. Точно так же, использование силиконовых шариков в растворе может помочь уменьшить количество давлением покровного места на червей.

Так же, как с оценкой за дефекта движения, важно рассмотреть пенетрантность эффекта. Пенетрантность можно считать высокой, если 80-100% животных отображения фенотип на NGM пластины, частичное если 21-79% и низкой, если ≤20% от дисплея населения влияет. Для сильно проникающих эффектов, меньшие размеры выборки могут быть использованы для производства значительных количественных данных о саркомера дефектов. В тех случаях, когда эффект имеет низкую пенетрантность, выбор животных, что четкое отображение дефект движение в ответ на лекарстваили лечение RNAi, могут быть полезны в опробования саркомера дефекты у животных, наиболее пострадавших от лечения. Тем не менее, это не обязательно так, что степень эффективности лечения на движения и субклеточном структуре такой же. Таким образом, может быть желательно, чтобы исследовать степень дефектов, присутствующих в большой популяции, например 100 животных. Это дает возможность понимания распределения дефектов по всей популяции. Он также может быть желательно, чтобы изучить степень дефекта в наиболее пострадавших животных и / или изучить корреляцию между степенью саркомера дефекта и степени дефекта движения. Потенциальные трудности в сторону, этот метод быстрее и проще, чем другие методы оценки структуры саркомера. Эта скорость и легкость, однако, при условии ключевого ограничения, саркомеры слитые белки, содержащие GFP не совсем нормально 37 и, следовательно, оценка разрушенных саркомеров должен быть подтвержден с использованием дополнительных более трудоемких методов.Эти методы включают в себя использование поляризованного света 38, фаллоидином окрашивания 39 и непрямой иммунофлюоресценции 40. Из этих методов, только поляризованный свет является относительно неинвазивным; другие методы требуют фиксации и, следовательно, не могут быть использованы в перспективных исследований отдельных животных, а они могут быть использованы только для подтверждения, пересекают сечении, результаты таких исследований.

Визуализация митохондриальных Networks

Штамм червь используется для митохондриальных экспериментов было визуализации CB5600 7, который выражает GFP слитый белок локализован в митохондриях и GFP β-галактозидазы слитого белка, локализованного в ядрах, как в теле стеновых мышц. Как с использованием PJ727 для визуализации саркомерах, использование данного штамма позволяет визуализировать митохондриальной структуры сети в живых животных. Таким образом, этот штамм может быть использован для оценки динамических изменений, которые происходят, например, снижается mitochondrial слияние и / или увеличение митохондрий деления 41. Также как и для визуализации саркомерах, самая большая трудность при этом способе является то, что черви изображаемого живы и перемещения, что делает его трудно получить хорошо сфокусированные изображения. В то время как несколько методов, как описано более подробно выше, могут быть использованы, чтобы уменьшить движение, митохондрии появляются особенно чувствительны к вмешательств, которые индуцируют уменьшенную движение. Например, наиболее часто используемый анестетики целевые компоненты дыхательной цепи митохондрий и, следовательно, должны использоваться с осторожностью в исследованиях нормальной митохондриальной структуры и функции. Точно так же большинство паралитические агенты должны использоваться с осторожностью в исследованиях нормальной митохондриальной структуры и функции, как большинство паралитические агенты вызывают меньше сигнал проходит через нервно-мышечного соединения и функциональной денервации мышцы достаточно, чтобы вызвать митохондриальную фрагментации. Эксперименты в этом исследовании использовали давление, чтобы иммобилизовать животноеS, но другие успешно использован левамизол 42, хотя это имеет важное значение для изображения животных сразу.

Наконец, различные бактериальные загрязняющие вещества в культурах, например Б. Сенная, может вызвать митохондриальную фрагментации; Поэтому очень важно, чтобы включить соответствующие необработанные управления в анализе. Для сильно проникающих эффектов, меньшие размеры выборки могут быть использованы для производства значительные количественные данные о сетевых митохондриальных дефектов. Тем не менее, из-за распространенности незначительными дефектами в митохондриальной сети, это небольшое количество животных, вероятно, будет в два раза больше количества, необходимого для оценки структуры саркомера. В тех случаях, когда эффект имеет низкую пенетрантность, выбор животных четко отображать дефект движение в ответ на лекарства или лечения RNAi, могут быть полезны в опробования митохондриальные дефекты у животных, наиболее пострадавших от лечения. Тем не менее, как упоминалось выше, это не всегда так, чтоСтепень эффекта лечения на движения и субклеточном структуре такой же. Таким образом, может быть желательно, чтобы изучить степень дефектов, имеющихся в большой популяции, например 150-200 животных, а также степень нарушения в наиболее сильно пострадавших животных и наличие или отсутствие степени нарушения со степенью дефект движение. Другие штаммы с флуоресцентно меченый митохондрий может быть использована, чтобы подтвердить результаты, полученные в CB5600, однако, использование различных флуоресцентных белков могут влиять на базовой сети митохондрий. Например, использование Томма-20 RFP слитого белка для визуализации митохондрий появляется, чтобы вызвать увеличение базовой митохондриальной фрагментации по сравнению с использованием митохондриально локализованного GFP 17. В то время как другие методы, такие как иммунофлюоресценции и электронной микроскопии может быть использован для оценки митохондриальной структуры, они не позволяют оценку в естественных условиях митохондриальных динамики, потому что шаг крепление требуетd. Другие методы, такие как использование митохондрии локализованных красителей можно использовать без фиксации и, следовательно, также могут быть использованы вместо использования митохондриально локализованного GFP. Как обсуждается в следующем разделе, использование таких красителей позволяет сырой оценку в естественных условиях функции митохондрий.

Оценка митохондриальной мембране потенциала в Vivo в С. Элеганс

Разнообразие красителей доступны для маркировки митохондрий 28. Эти красители обеспечивают альтернативный метод визуализации митохондрий структуру сети в живых C. Элеганс. Многие из этих красителей также позволить сырой оценку митохондриальной функциональности в естественных условиях, так как они накапливаются в митохондриях, основанных на митохондриальной мембранного потенциала. Здесь мы использовали C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, которая попадает в организм черезпищеварительного тракта, при этом некоторые дополнительно ввод червя через кутикулы из-за проницаемости, предоставляемой растворения в 0,5% ДМСО. После вступления в клетке C 32 H 32 Cl 2 N 2 O окисляется и поглощенных по митохондрии, где он связывается серосодержащих аминокислот (например, метионина и цистеина). Образование этих красителей комплексов пептид-C означает 32 H 32 Cl 2 N 2 O остается в митохондриях раз меченых 28. Основной трудностью при использовании красителей митохондриальных является то, что они будут маркировать все митохондрии в животном. Поэтому мы провели маркировку в CB5600, и того же штамма, описанного выше для оценки мышечной митохондриальной структуры сети. Используя красную митохондриальной краситель, штамм червей, выражающих GFP в мышечной митохондрий, и тройной фильтр, это относительно просто изображение только митохондрии в мышцах, находя митохондрии, которые являются уплотнительныеДиапазон по колокализации красным красителем и GFP меченных митохондрий. Самым сложным этапом в выполнении этой колокализации подход является визуализация потому краситель фото выгоревшие в течение нескольких секунд при высокой интенсивности флуоресцентного света. Этот эффект может быть ограничен, сохраняя флуоресценцию на малой мощности до тех пор, экспериментатор не будет готов к изображению, а затем регулировки интенсивности флуоресценции, соответственно. После того, как один испытывают с использованием красителей и другой подход заключается в использовании конфокальной микроскопии с Z-стеки в образ только митохондрии в правой ткани; митохондриальные сети в мышце совершенно различны по сравнению с другими тканями. К сожалению, неспособность C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, чтобы оставить митохондрии 28 означает, что, в отличие от методики саркомера, и митохондриальной изображений обсуждалось выше, он не может быть использован, чтобы перспективно следовать потерю функции митохондрий со временем, если C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oдобавляется в дискретные моменты времени, чтобы отделить популяции животных. Это ограничение можно преодолеть, используя красители, такие как JC-10, что делать оставить митохондрии от распада мембранного потенциала 43. Митохондрии также могут быть выделены из С. Элеганс 30 для последующих биохимических анализов. Такая добыча позволяет количественно оценить митохондриальной мембранного потенциала путем количественного определения скорости поглощения липофильных катионный краситель с помощью проточной цитометрии или люминесцентной ридере 44. Установив нарушенную митохондриальный мембранный потенциал, можно также определить, если потеря протонного градиента приводит к потере производства АТФ с помощью чувствительного bioluminometric люциферазы на основе метода 45.

Оценивая белка деградации в С. Элеганс

Штамм червь используется здесь для оценки деградации мышечных белков был PD55, который содержит мышц конкретный βгалактозидазу что постоянно синтезируется в ходе развития до зрелого возраста не будет достигнут и который остается стабильным в цитозоле для следующего 72-96 часов 19. Таким образом, измерение уровня β-галактозидазы в процессе разработки преимущественно указывает на воздействие мероприятий на синтез из миозина промоутера в то время как потеря β-галактозидазы в зрелом возрасте показывает вмешательство вызвало увеличилось деградации цитозольный белка 19. Ключевым шагом в оценке β-галактозидазы является обеспечение эффективного высыхания. Несоблюдение эффективно пересушивает животных приводит к плохому предоставления X-гал субстрата и, следовательно, плохой синего цвета в тело-стеновых мышц животных. Для обеспечения хорошего высыхания печать на эксикаторе должны быть проверены и образец должен быть проверен на 5-10-минутными интервалами на протяжении высыхания для оценки прогресса (т.е. образца 20 мкл следует высохли в пределах 10 минут, а оставшиеся 20 минявляется обеспечение всестороннего высыхания). Β-галактозидазы анализ является анализ активности Поэтому соответствующий контроль имеет важное значение. Кроме того, снизилась окрашивание взрослых в состояние обращение относительно контроля не доказывает, что деградация происходит; а это указывает на снижение ферментативной активности в ответ на лечение. Чтобы подтвердить, деградации, более трудоемкий Вестерн-блоттинга должны быть завершены к β-галактозидазы 13, и это позволяет деградации количественное белка в небольших популяциях, подсчитанных червей. Блот плотности западные группы может быть определена количественно с помощью ImageJ 46. Другим ограничением этого метода является то, что использование трансгенных белков не сообщает, как в физиологических мишеней деградации и для таких ответов протеомические и / или целевые гипотеза приводом Вестерн-блоты должны быть использованы 13. И, наконец, как синтез белка в трансгенных используемого в этих исследованиях выключается в юношеском возрасте 19 C. Элеганс мышцы; например, стабильные или радиоактивные изотопные методы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

Tags

Биология развития выпуск 93 физиологии, Мышцы митохондрии саркомеры старение
Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в<em&gt; С. Элеганс</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter