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Biology

तरीके में पेशी के subcellular डिब्बों का आकलन करने के लिए Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

कंकाल की मांसपेशी हरकत के लिए आवश्यक है और शरीर की मुख्य प्रोटीन की दुकान है. सी एलिगेंस भीतर स्नायु स्वास्थ्य माप वर्णित हैं. मांसपेशी संरचना और कार्य करने के लिए भावी परिवर्तनों स्थानीयकृत GFP और cationic रंजक का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं.

Abstract

स्नायु पोषण, व्यायाम, और रोग राज्य में परिवर्तन का जवाब है कि एक गतिशील ऊतक है. बीमारी और उम्र के साथ मांसपेशियों और समारोह के नुकसान महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ हैं. वर्तमान में हम रोग या उम्र के साथ मांसपेशियों के स्वास्थ्य की आनुवंशिक विनियमन के बारे में कम समझते हैं. निमेटोड सी एलिगेंस ब्याज की जैविक प्रक्रियाओं के जीनोमिक विनियमन को समझने के लिए एक स्थापित मॉडल है. यह कीड़ा शरीर दीवार मांसपेशियों उच्च metazoan प्रजातियों की मांसपेशियों के साथ अनुरूपता का एक बड़ा डिग्री प्रदर्शित करते हैं. सी एलिगेंस एक पारदर्शी जीव है, माइटोकॉन्ड्रिया और sarcomeres को GFP के स्थानीयकरण vivo में इन संरचनाओं के दृश्य की अनुमति देता है. इसी तरह, जानवरों एक mitochondrial झिल्ली क्षमता के अस्तित्व पर आधारित संचित जो cationic रंजक, खिला, विवो में mitochondrial समारोह के मूल्यांकन की अनुमति देता है. प्रोटीन मांसपेशियों homeosta की इन विधियों, साथ ही मूल्यांकनबहन, मांसपेशियों में प्रदर्शन के कार्यात्मक उपायों के साथ उप सेलुलर दोष के सहसंबंध अनुमति देने के लिए, आंदोलन assays के रूप में, पूरे पशु मांसपेशी समारोह के आकलन के साथ संयुक्त कर रहे हैं. इस प्रकार, सी एलिगेंस मांसपेशी संरचना और समारोह पर उत्परिवर्तन, जीन पछाड़ना, और / या रासायनिक यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के साथ जो एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है. अन्त में, GFP, cationic रंजक, और आंदोलन assays के रूप में मूल्यांकन कर रहे हैं गैर invasively, मांसपेशियों संरचना और समारोह के भावी पढ़ाई पूरी जिंदगी पाठ्यक्रम भर में आयोजित किया जा सकता है और वर्तमान में यह आसानी से किसी भी अन्य जीव में vivo में जांच नहीं की जा सकती.

Introduction

स्नायु अच्छी तरह से हरकत, आसनीय समर्थन और चयापचय में अपनी भूमिका के लिए सराहना की एक multifunctional ऊतक, है. स्वस्थ मांसपेशियों के विकास और रखरखाव के कई सेलुलर प्रक्रियाओं और घटकों के समन्वय की आवश्यकता है. या तो क्षति या बीमारी के माध्यम से, अनियंत्रण बदल मांसपेशी संरचना और / या समारोह में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है. 1,2 जन और विशेष रूप से मांसपेशियों की शक्ति और सहनशीलता 3-5 मांसपेशी नकारात्मक मृत्यु दर के साथ सहसंबद्ध होते हैं क्योंकि मांसपेशी समारोह में उम्र जुड़े गिरावट, पश्चिमी दुनिया में स्वास्थ्य देखभाल के बजट के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ प्रस्तुत करता है. ऐसे बदल mitochondrial समारोह या sarcomere विघटन के रूप में बिगड़ती मांसपेशी समारोह से संबंधित पहलुओं की माप समग्र मांसपेशी विकास और स्वास्थ्य underpinning तंत्र का अधिक से अधिक समझ अनुमति दे सकते हैं.

सी aenorhabditis एलिगेंस (सी एलिगेंस) एक सूक्ष्म निमेटोड bes हैयह अपने पूरे जीनोम 6 अनुक्रम के लिए सबसे पहले बहुकोशिकीय जीव, आरएनएआई 7 का उपयोग कर खामोश जीन को पहली बार, और पहले के रूप में प्रस्तावित किया गया था उसके पूरे सेल वंश 8 और neuroanatomy 9 निर्धारित किया. सी एलिगेंस है करने के लिए केवल metazoan था क्योंकि टी जाना जाता है सिडनी ब्रेनर 10 द्वारा 1974 में व्यवहार के आनुवंशिक नियंत्रण और इस का महत्व और बाद में काम के अध्ययन के लिए एक मॉडल सी एलिगेंस शोधकर्ताओं को सम्मानित किया तीन नोबेल पुरस्कार के पहले से मान्यता प्राप्त थी. सी के लगभग 35% जीन सी एलिगेंस मांसपेशी विकास 11 की आनुवंशिक नियंत्रण को समझने के लिए इस्तेमाल किया एक प्रमुख जीव होने के साथ मनुष्य में orthologues की पहचान की है एलिगेंस. लगभग सी एलिगेंस जीनोम में हर जीन आरएनएआई 7,12 के माध्यम से नीचे गिरा दिया जा सकता है. इस प्रकार, पूरी तरह से विकसित की मांसपेशी में जीन नीचे दस्तक द्वारा, आनुवंशिक घटक पुनः के लिए योगदानपेशी स्वास्थ्य की gulation रिश्तेदार सादगी 13 के साथ जांच की जा सकती है.

आरएनएआई, म्यूटेंट, और रासायनिक यौगिकों का उपयोग करने के लिए संयुक्त क्षमता सी उम्र 16 के साथ और रोग मॉडल 17 में पेशी संरचना और समारोह के आनुवंशिक विनियमन 7,14,15 की खोज के लिए एक प्रमुख प्रणाली एलिगेंस बनाता है. मांसपेशी संरचना और / या समारोह पर रासायनिक यौगिकों को जीन पछाड़ना, उत्परिवर्तन, और / या जोखिम के प्रभाव कई पहलुओं के माध्यम से मापा जा सकता है. यहाँ हम संक्षेप में पेशी स्वास्थ्य की भावी अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जिनमें से कई सी एलिगेंस मांसपेशी संरचना और समारोह, का आकलन करने के लिए सरल तकनीक का वर्णन.

हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का विकास (GFP) के 18 विशिष्ट प्रोटीन के इलाके और सी एलिगेंस में अंगों की सामान्य संरचना दोनों के दृश्य के लिए सक्षम है. यहाँ हम GFP तकनीक और नवीनता व्यक्त की व्याख्या कैसेfically शरीर दीवार मांसपेशियों माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर, नाभिक, या sarcomeres इन उप सेलुलर संरचनाओं की डिस्ट्रोफी मौजूद है, तो यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संरचना हमेशा समारोह के लिए एक विश्वसनीय किराए की नहीं है, हम भी इन विवो में cationic रंजक का उपयोग पेशी के भीतर बिगड़ा mitochondrial झिल्ली क्षमता के आकलन के लिए अनुमति देता है कि कैसे समझा. रंगों GFP के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, वे जीवन भर एक लौकिक ढंग से वास्तुकला और समारोह के अध्ययन की अनुमति. अन्त में, हम भी इन उपायों के सभी आंदोलन assays के उपयोग के माध्यम से पूरे जानवरों की मांसपेशियों स्वास्थ्य में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे मांसपेशियों के भीतर प्रोटीन समस्थिति मूल्यांकन किया जा सकता है और कैसे समझा. जीन पछाड़ना, म्यूटेशन, और / या रासायनिक यौगिकों के साथ संयुक्त इन तकनीकों, विशिष्ट जीन या यौगिकों विवो में पेशी स्वास्थ्य को प्रभावित कैसे अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली शस्त्रागार प्रदान करते हैं. सी एलिगेंस और बीच संरचना, चयापचय और मांसपेशियों की सकल समारोह में समानताएंस्तनधारियों सी एलिगेंस मानव सहित उच्च जीवों में पेशी के विनियमन को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है मतलब है.

Protocol

1. तनाव, संस्कृति, और माइक्रोस्कोपी

  1. सी एलिगेंस की संभाल और बनाए रखने के स्ट्रेन के रूप में पहले 19 में वर्णित है. स्ट्रेन Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC) से उपलब्ध हैं.
    नोट: माइटोकांड्रिया और नाभिक के लिए स्थानीय GFP संलयन प्रोटीन के साथ इन प्रयोगों में इस्तेमाल उपभेदों CB5600 (उसे -8 (e1489) चतुर्थ; Pmyo -3 :: Mtgfp) मैं ccIs4251 (Pmyo -3 :: Ngfp-lacZ) थे; Unc-; सिकुड़ा तंत्र और PD55 (ccIs55 (समर्थन-7 (ST5) के लिए स्थानीय GFP संलयन प्रोटीन के साथ; PJ727 (UNC-54 :: lacZ वी jls01 (Myo -3 :: GFP, rol-6 (su1006))) 54 :: lacZ cytosol के लिए स्थानीय β-galactosidase संलयन प्रोटीन के साथ) वी).
  2. पहले से अनुक्रम से आरएनएआई बैक्टीरिया multigenerational आरएनएआई प्रयोगों 13 के लिए वर्णित और प्राप्त के रूप में पूरा आरएनएआई प्रयोगों मार्क विडाल एट अल. 12 द्वारा निर्मित ओआरएफ-आरएनएआई पुस्तकालय सत्यापित.
  3. युक्त स्ट्रेन का निर्माण <उन्हें> सीसीआईएस 4251, jls01 या सीसीआईएस 55 मानक तकनीक 20 का उपयोग करते हुए. क्रमशः, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क संरचना, मायोसिन संगठन या proteostasis की स्थिति का आकलन करने के लिए एक तनाव पैदा करने के लिए इन transgenes का प्रयोग करें. हर जानवर वांछित है में इन उप सेलुलर डिब्बों में से एक को देख जहां एक उत्परिवर्ती में स्ट्रेन पार.
  4. PtdIns-3-kinase अवरोध का प्रयोग, भंडारण-294002 (भंडारण) के रूप में पहले 21 में वर्णित है. संक्षेप में, शुष्क OP50 वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों के ऊपर 160 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में भंडारण-294002 जोड़ें.
  5. सामान्यतः, GFP-आधारित प्रयोगों के लिए एक GFP फिल्टर और सीएल 2 एन 2 ओ एच 32 सी 32 के साथ विवो झिल्ली क्षमता में आकलन करने के लिए एक साथ, लाल, हरे और नीले चैनलों की इमेजिंग की अनुमति देता है जो एक ट्रिपल-पास फिल्टर के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग सभी छवियों पर कब्जा Mitotracker लाल CMXRos के रूप में विपणन. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में छवि विश्लेषण और आंकड़ा तैयारी आचरण.

  1. पहले की जरूरत है 1 दिन का न्यूनतम, M9 बफर बनाने - 22.04 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 42.27 मिमी ना 2 HPO 4, 85.56 मिमी NaCl (अंतिम सांद्रता), और autoclaving द्वारा बाँझ. एक बार 45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा, वर्षा 22 को रोकने के लिए वाष्पदावी के बाद 1 मिमी MgSO 4 बाँझ जोड़ें. M9 के 50 मिलीलीटर ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस और विभाज्य पर शांत करने की अनुमति दें.
  2. प्रयोग के दिन, एल 1 लार्वा की उच्च संख्या के साथ एक एकल 9 सेमी की थाली के लिए 3 मिलीलीटर M9 बफर जोड़ें. एक कोण पर आयोजित की थाली के साथ अगर की सतह के खिलाफ M9 के तरल और pipetting aspirating द्वारा बार बार प्लेट धो लें.
  3. थाली से एल 1 के धो लें और फिर एक पिपेट का उपयोग कर एक 10 एमएल टेस्ट ट्यूब को M9 के हस्तांतरण.
  4. बड़े वयस्क और बाद में लार्वा चरण जानवरों टेस्ट ट्यूब की तह तक गिर करने के लिए अनुमति देने के लिए 2.5 मिनट के लिए छोड़ दें और छोटे एल 1 जानवरों टी के पास रहते हैंM9 बफर के सेशन.
  5. एक पिपेट का उपयोग टेस्ट ट्यूब में M9 के शीर्ष 500 μl निकालें. फिर एक विदारक गुंजाइश के तहत 500 μl OP50 के साथ वरीयता प्राप्त एक नया एन जी एम थाली के लिए M9 युक्त एल 1 लार्वा पिपेट.
  6. आमतौर पर, प्रति प्लेट ~ 200-300 एल 1 लार्वा हस्तांतरण करना है. यदि आवश्यक हो, OP50 खाद्य स्रोत का सेवन किया जा रहा रोकने के लिए नए सिरे से OP50 एन जी एम प्लेटों पर जानवरों लेने, वयस्कता से दैनिक प्लेटों पर नजर रखने और.
    नोट: इस मूल प्लेट पर एल 1 की संख्या के आधार पर काफी हद तक बदलता है, हालांकि यह आमतौर पर एक P1000 पिपेट का उपयोग M9 की 1-3 बूंदें है.
  7. व्यक्तिगत जानवरों में भावी अध्ययनों वांछित हैं तो पशुओं वयस्कता तक पहुँचने, एक बार, वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों अलग करने के लिए अलग-अलग जानवरों लेने. स्थानांतरण जानवरों हर 24-48 घंटा लार्वा जानवरों से अलग करने के लिए.

3. आंदोलन Assays 19

  1. प्रयोग शुरू होने से पहले 2 घंटे की एक न्यूनतम, M9 के 50 मिलीलीटर विभाज्य को हटाने और कमरे में अस्थायी को संतुलित करने की अनुमतिerature.
  2. एक खुर्दबीन स्लाइड पर 50 μl M9 बफर में एक भी वयस्क जानवर उठाओ.
  3. एक बाई ओर और एक दाहिनी ओर मोड़ एक स्ट्रोक के बराबर है जहां 10 सेकंड में छोड़ दिया और दाहिनी ओर शरीर झुकता की संख्या की गणना.
  4. एक औसत लिया जा सकता है जिसमें से कम से कम 5 माप की कुल देने के लिए शरीर स्ट्रोक की गिनती दोहराएँ. न्यूनतम प्रति आंदोलन दर देने के लिए छह से इन आंकड़ों के गुणा.
  5. एक विंदुक का प्रयोग, पेट्री डिश के लिए वापस पशु हस्तांतरण. इस विधि सी elegan एस में पूरे जीवन काल के दौरान आंदोलन के अस्थायी माप सक्षम बनाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1: आंदोलन assays के. कीड़े बफर में चुना जाता है एक बार, एक बाई ओर (ए) और एक दाहिनी ओर (बी) मोड़ एक पूरा आंदोलन देने के लिए एक साथ जोड़ रहे हैं(स्ट्रोक).

Mitochondrial नेटवर्क और Sarcomeres 4. इमेजिंग शरीर दीवार स्नायु में

  1. नोट: एक ही प्रोटोकॉल माइटोकांड्रिया और sarcomeres दोनों की इमेजिंग के लिए लागू होता है.
  2. वे युवा वयस्कता तक पहुंच जाएगा जब पहले (खंड 1) में वर्णित है और 20 डिग्री सेल्सियस पर 48-60 घंटे के लिए बढ़ने के रूप में कीड़े सिंक्रनाइज़.
  3. एक खुर्दबीन स्लाइड पर 20 μl M9 में प्लेटों से 20 कीड़े (थाली के प्रतिनिधि) उठाओ.
  4. एक कवर पर्ची लागू करें और 40x बढ़ाई एक GFP फिल्टर (460-500 एनएम, नीले प्रकाश उत्तेजना) के तहत एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि के लिए आगे बढ़ें.

5. Mitotracker लाल CMXRos साथ एक Vivo संचय परख (सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 ओ) का उपयोग करके झिल्ली क्षमता का आकलन

  1. CB5600 (खंड 1), मांसपेशियों के माइटोकॉन्ड्रिया में GFP के साथ लेबल सभी सिंक्रनाइज़, और 20 डिग्री सेल्सियस पर 48-60 घंटे के लिए एन जी एम युक्त OP50 पर जल्दी वयस्कता के लिए बढ़ता है.
  2. 940.692 माइक्रोन का एक शेयर समाधान बनाने के लिए सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 हे के 50 माइक्रोग्राम प्रति विभाज्य μl DMSO के 100 जोड़ें.
  3. 940.692 माइक्रोन स्टॉक समाधान के 1 μl लो और 4.70 माइक्रोन (4.70346 माइक्रोन) की एक काम समाधान बनाने के लिए 199 μl M9 में resuspend. सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 हे सहज है क्योंकि ब्राउन 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में यह तैयार करें.
  4. समाधान (20 μl विभाज्य प्रति 20 वयस्क कीड़े) काम कर 4.70 माइक्रोन के 20 μl aliquots तैयार करें.
  5. ब्राउन 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 4.70 माइक्रोन सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 ओ के 20 μl में 20 वयस्क जानवरों उठाओ. 1 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  6. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, 10 सेकंड के लिए 2,000 XG पर कीड़े, अपकेंद्रित्र युक्त ब्राउन 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को 1 मिलीलीटर M9 जोड़ने और फिर सतह पर तैरनेवाला हटायें. शेष 20 μ कीड़ा गोली resuspending और स्थानांतरित करने से पहले इस धोने कदम दोहराएँएल इमेजिंग के लिए एक स्लाइड के लिए (कीड़े युक्त).
  7. 40X बढ़ाई दोनों एक साथ, लाल, नीले और हरे रंग चैनलों के दृश्य की अनुमति देता है जो एक ट्रिपल पास फिल्टर का उपयोग के साथ माइटोकॉन्ड्रिया की छवियों को ले लो. ट्रिपल-पास फिल्टर का उपयोग इमेजिंग नारंगी के रूप में प्रदर्शित होने के माइटोकॉन्ड्रिया के लिए स्थानीय सी 32 एच 32 सीएल 2 GFP के साथ 2 एन ओ के सह स्थानीयकरण से पता चलता है.
  8. नारंगी माइटोकॉन्ड्रिया की एक छवि के बाद लिया, हटाया सभी फिल्टर के साथ अधिकतम सेटिंग्स पर तरंग दैर्ध्य 540/25 एनएम के प्रकाश का उपयोग कर 10 सेकंड के लिए पशु फोटो ब्लीच. इस माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर लाल ब्लीच और मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया में colocalization पुष्टि करने के लिए अकेले माइटोकॉन्ड्रियल GFP खोलेगा.

सी एलिगेंस में प्रोटीन मांसपेशियों गिरावट के 6. आकलन

  1. एन जी एम प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ PD55s (या lacZ transgene युक्त किसी भी तनाव) OP50 (खंड 1) के साथ वरीयता प्राप्त. 2 में 48-60 घंटे के लिए युवा वयस्कता के लिए आगे बढ़ें0 डिग्री सेल्सियस.
  2. एक खुर्दबीन स्लाइड पर 20 μl DDH 2 ओ में 20 वयस्क कीड़े उठाओ. कोशिश करते हैं और केवल कीड़ा और लेने के साथ नहीं किसी भी बैक्टीरिया लेने के लिए सावधान रहें. पेंसिल में खुर्दबीन स्लाइड लेबल.
  3. 30 मिनट के लिए सूखी और जानवरों की छल्ली दरार करने के लिए desiccator में रखें. सील के आसपास तेल का उपयोग desiccator पर एक तंग सील सुनिश्चित करें.
  4. सुखाना जाँचें एक विदारक गुंजाइश (चित्रा 2) के तहत प्रभावी किया गया है.
  5. 3.5 मिनट तो स्लाइड पर एसीटोन लुप्त हो जाना करने की अनुमति के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कागज तौलिया पर खुर्दबीन स्लाइड छोड़ के लिए ठंडा एसीटोन में खुर्दबीन स्लाइड डूब. इस बिंदु पर एक्स-लड़की और ऑक्सीकरण बफर पिघलना और कमरे के तापमान को equilibrating अनुमति देते हैं.
  6. धीरे इस समरूप है यह सुनिश्चित करने के लिए ऑक्सीकरण बफर और भंवर μl 100 2 μl एक्स-लड़की जोड़ें. यह एक्स-लड़की / ऑक्सीकरण बफर मास्टर मिश्रण है.
  7. ओ प्रत्येक के लिए एक्स-लड़की / ऑक्सीकरण बफर मास्टर मिश्रण के 20 μl जोड़ें20 कीड़े की riginal क्षेत्र. मास्टर मिश्रण पूरी तरह से पूरी तरह से सभी जानवरों को शामिल किया गया सुनिश्चित करने के लिए एक विदारक गुंजाइश के तहत निरीक्षण किया. धीरे जानवरों शामिल नहीं हैं जहां क्षेत्रों पर मास्टर मिश्रण स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड झुकाव.
  8. 20 डिग्री सेल्सियस पर 1-2.5 घंटे के लिए एक आर्द्रता चैम्बर में खुर्दबीन स्लाइड रखें. छवि जानवरों एक गहरे नीले रंग नियंत्रण जानवरों के शरीर दीवार की मांसपेशियों में मौजूद है. जानवरों imaged किया जाना चाहिए जब निर्धारित करने के लिए एक विदारक गुंजाइश के तहत हर 15 मिनट नियंत्रण जानवरों का आकलन करें.

चित्रा 2
चित्रा 2: β-galactosidase assays का उपयोग मांसपेशी प्रोटीन गिरावट का आकलन. एक lacZ transgene युक्त (ए) पशु एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड (बी) पर 20 μl DDH 2 ओ को पेट्री डिश से चुना जाता है. पशु शोषित हैं और खंडित हो जाते हैं (डी) में धो रहे हैं. एसीटोन (ई) एक्स-लड़की / ऑक्सीकरण बफर मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है evaporates एक बार. नियंत्रण पशुओं में नीले रंग का विकास एक गहरे नीले रंग जानवरों (एल) की लंबाई भर में प्राप्त की है जब तक टी = 0 मिनट (एफ) से 15 मिनट के अंतराल (फ्लोरिडा) में मूल्यांकन किया है. कीड़े की छवियां फ्लोरिडा में एई और 8X में 2.5X बढ़ाई लिया जाता है. सी, डी, एफ, जी, और एल ज़ूम मूल बढ़ाई 4X हैं.

Representative Results

आंदोलन Assays आंदोलन दोष यों

आंदोलन गिरावट सी में मृत्यु दर का एक अच्छा कारक है एलिगेंस 16, साथ नयूरोमुस्कुलर प्रणाली के साथ समस्याओं का संकेत दरों में कमी आई. आंदोलन में परिवर्तन, आंदोलन assays के द्वारा मूल्यांकन के रूप में, 23, एक विशिष्ट जीन या दवा उपचार (आंकड़े 3-5) के खिलाफ या उत्परिवर्ती जानवरों 13 में आरएनएआई से परिणाम कर सकते हैं. आंदोलन में गिरावट जटिल मैं, तृतीय, चतुर्थ या वी 24 एन्कोडिंग इलेक्ट्रॉन परिवहन जीन के नीचे विकासात्मक दस्तक निम्नलिखित उदाहरण के लिए बदल विकास से परिणाम कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, विशिष्ट हस्तक्षेप के बाद विकास के शरीर क्रिया विज्ञान पर प्रभाव की जांच करने के क्रम में केवल वयस्क सी एलिगेंस पर परीक्षण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जानवरों encodes जो UNC-112, के खिलाफ आरएनएआई के साथ इलाज सी युक्त Integrin के लिए स्थानीय है जो Kindlin-1 की orthologue एलिगेंसपेशी लगाव परिसरों (आंकड़े 3 और 4), या गैस-1, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (चित्रा 4) के जटिल मैं का एक घटक encodes, जो 48-72 घंटा के बाद वयस्कता से नियंत्रण बनाम आंदोलन में एक प्रगतिशील कमी प्रदर्शित करते हैं. यह मांसपेशियों के शरीर क्रिया विज्ञान के साथ समस्याओं का संकेत हो सकता है. इसी प्रकार, 24 से आंदोलन का घाटा - 72 घंटा PI3K अवरोध भंडारण-294002 (चित्रा 5) के साथ इलाज के साथ सामान्य रूप से विकसित वयस्कों के इलाज के जवाब में मनाया जाता है. यह एक दूसरा आरएनएआई उपचार, उत्परिवर्तन, या एक प्रारंभिक हस्तक्षेप के जवाब में कम आंदोलन प्रदर्शित पशुओं में आंदोलन को बहाल करने में एक दवा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए भी संभव है. उदाहरण के लिए, unc- 112 म्यूटेंट मंद-1 13 में एक दूसरे उत्परिवर्तन की उपस्थिति में तनु है कि जंगली प्रकार के पशुओं की तुलना में आंदोलन में एक quantifiable कमी प्रदर्शित करते हैं. इसलिए, आंदोलन assays के neuromuscu बदल कि दोनों उपायों की पहचान कर सकते हैंLAR विकास और / या समारोह के रूप में भी सुधार लाने और / या neuromuscular समारोह बहाल है कि लोगों को.

Sarcomere व्यवधान के आकलन

एक आंदोलन दोष पहचान करने के बाद, यह आंदोलन दोष के कारण नसों, मांसपेशियों, या दोनों के भीतर समस्याओं से समझाया जा सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए अक्सर वांछनीय है. Sarcomeres पीढ़ी और आंदोलन के लिए मजबूर इस प्रकार संकुचन के लिए अनुमति देते हैं और कि मांसपेशियों के भीतर बहु-प्रोटीन परिसरों हैं. सिकुड़ा तंत्र के लिए स्थानीय मायोसिन GFP संलयन प्रोटीन व्यक्त उपयोग जानवरों द्वारा, मायोसिन तंतु और sarcomeres को विघटन की हद तक विकास और / या वयस्कता के माध्यम से अलग-अलग जानवरों में अपेक्षाकृत गैर invasively और भावी मनाया जा सकता है. जंगली प्रकार पशुओं प्रत्येक शरीर दीवार मांसपेशियों के भीतर के रूप में कई हरे समानांतर सीधे लाइनों (चित्रा 3) दिखाई देते हैं कि arrayed sarcomeres प्रदर्शित करते हैं. इन सामान्य सरणियों को विघटन के साथ अपेक्षाकृत मामूली हो सकता हैसमानांतर में शेष बजाय मर्ज करने के लिए प्रदर्शित होने arrayed sarcomeres. टी में UNC-112 आरएनएआई साथ दिखाई इस phenotype, = 24 घंटा या 48 घंटा (चित्रा 3), स्तनधारी मांसपेशियों में actin लगाव साइटों के Z-लाइन स्ट्रीमिंग के बराबर है. इसी प्रकार, सरणियों के छोटे हिस्से को संक्षिप्त कर सकते हैं या वे 48 घंटे या टी = 72 घंटा (चित्रा 3) = टी में UNC-112 आरएनएआई के साथ इलाज के रूप में पूरी तरह से इस तरह गायब हो सकता है. एक आंदोलन दोष प्रदर्शित कि जानवरों की मांसपेशियों के भीतर sarcomere दोषों की उपस्थिति (चित्रा 3) आंदोलन दोष के लिए खाते में करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन जरूरी नहीं कि एक हस्तक्षेप के जवाब में पेशी, तंत्रिका, और / या अन्य ऊतकों के साथ अन्य समस्याओं से इंकार नहीं करता .

Mitochondrial नेटवर्क संरचना का आकलन

एक आंदोलन दोष की उपस्थिति में यह कारण या आंदोलन डे के लिए योगदान कर सकते हैं कि अन्य दोष के लिए मांसपेशियों की जांच करने के लिए कभी कभी वांछनीय हैfect. माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर ऊर्जा के थोक प्रदान करने और मांसपेशियों में संकुचन के लिए उपलब्ध ऊर्जा को कम करने, कम एटीपी प्रावधान का नतीजा हो सकता है आंदोलन में गिरावट आती है. इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रिया की संरचना असामान्यताओं के लिए जांच की जा सकती है. यह तेजी से mitochondrial विखंडन लाती रूप में सोडियम azide के साथ पशुओं चतनाशून्य करना महत्वपूर्ण नहीं है; इन प्रयोगों में जानवरों कवर पर्ची द्वारा लागू दबाव से स्थिर किया गया. जंगली प्रकार सी एलिगेंस के भीतर शरीर दीवार मांसपेशियों, माइटोकॉन्ड्रिया संगठित नेटवर्क के भीतर (चित्रा 4) समाहित कर रहे हैं और माइटोकॉन्ड्रिया एक जालिका 25 के रूप में मौजूद है और समारोह. माइटोकॉन्ड्रिया के नेटवर्क का विघटन नेटवर्क (गैस -1 आरएनएआई, चित्रा 4 बी) 26 के विखंडन के रूप में प्रस्तुत करता है. विखंडन संगठित नेटवर्क की कोई झलक UNC-112 आरएनएआई (चित्रा 4 बी और सी) 13 के साथ उपचार के रूप में ऐसी बनी हुई है कि काफी गंभीर हो सकते हैं. वाई के रूप मेंsarcomere संरचना में वें अवरोधों, एक आंदोलन दोष प्रदर्शित कि पशुओं में पेशी माइटोकॉन्ड्रियल संरचना में दोष आंदोलन दोष के लिए खाते में पर्याप्त हो सकता है लेकिन यह जरूरी मांसपेशियों, तंत्रिका, और / या अन्य ऊतकों के साथ अन्य समस्याओं से इंकार नहीं करता. उदाहरण के लिए, UNC-112 म्यूटेंट 13 और उपचार UNC-112 आरएनएआई (आंकड़े 3 और 4) प्रदर्शन दोनों बाधित sarcomeres साथ और mitochondrial संरचना बाधित.

Vivo में mitochondrial समारोह का आकलन

mitochondrial झिल्ली संभावित इसलिए, विवो में mitochondrial झिल्ली क्षमता का आकलन करने की क्षमता प्रोटॉन मकसद बल बना सकते हैं और एटीपी 27 उत्पन्न करने के माइटोकॉन्ड्रिया की क्षमता निर्धारित करता एटीपी के उत्पादन के लिए है कि पशु की क्षमता को दर्शाता है. माइटोकॉन्ड्रियल संरचनात्मक अवरोधों या माइटोकॉन्ड्रियल कार्यात्मक क्षमता को बदल नहीं हो सकता है, यह देसी हो सकता हैrable बदल माइटोकॉन्ड्रियल संरचना प्रदर्शित पशुओं में mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए. सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 हे एक झिल्ली क्षमता मौजूद है और माइटोकॉन्ड्रिया 28 (चित्रा 4C) दाग जहां सभी प्रकार की कोशिकाओं, के, माइटोकॉन्ड्रिया में जम जाता है. विशेष रूप से मांसपेशियों में mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए, एक विशेष रूप से पेशी माइटोकांड्रिया (चित्रा 4C) पर एक हस्तक्षेप के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए सी 32 एच 32 एन ओ 2 सीएल 2 और GFP लेबल पेशी माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, UNC-112 आरएनएआई साथ mitochondrial झिल्ली संभावित इलाज के बाद के नुकसान मैट्रिक्स में प्रवेश करने से एच 32 सीएल 2 2 एन ओ सी 32 से बचाता है. माइटोकॉन्ड्रिया इसलिए, छोटे दिखाने अगर माइटोकॉन्ड्रिया की GFP लेबलिंग (चित्रा 4C) के अलावा माइटोकॉन्ड्रिया के किसी भी लाल धुंधला हो जाना. फोटो-विरंजन भी मनाया कि पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमाइटोकॉन्ड्रिया विशेष रूप से मांसपेशियों (चित्रा 4C) में होते हैं. एक कम क्षमता की पहचान एटीपी एक मनाया आंदोलन दोष के लिए खाते में करने के लिए पर्याप्त है लेकिन मांसपेशियों, तंत्रिका भीतर अन्य समस्याओं से इंकार नहीं करता उत्पादन, और / या अन्य ऊतकों के लिए. कम एटीपी उत्पादन क्षमता मनुष्य के 29 और 30 की उम्र बढ़ने में रोग राज्यों के साथ जुड़ा हुआ है के रूप में भले ही,, एक हस्तक्षेप के जवाब में इस तरह के एक दोष की पहचान एटीपी उत्पादन क्षमता में सुधार और ये तो हो सकता है कि यौगिकों और / या आरएनएआई उपचार के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करता है आगे चिकित्सीय क्षमता के लिए पता लगाया जाना.

प्रोटीन गिरावट का आकलन

एक आंदोलन दोष और सामान्य sarcomeres और माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति में यह कारण या आंदोलन दोष के लिए योगदान कर सकते हैं कि अन्य दोष के लिए मांसपेशियों की जांच करने के लिए कभी कभी वांछनीय है. प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने की क्षमता की एक हस्ताक्षर है और न हीमल स्वास्थ्य, प्रोटीन संश्लेषण और / या प्रोटीन गिरावट में वृद्धि में कमी जबकि 31 उम्र बढ़ने और कई रोग राज्यों 32,33 का परिणाम है. इसलिए यह बदल प्रोटीन समस्थिति के लिए एक आंदोलन दोष के साथ जानवरों की मांसपेशियों की जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है. इस साइटोसोलिक मांसपेशी प्रोटीन के स्तर का आकलन के माध्यम से पूरा किया जा सकता है. transgenically इनकोडिंग प्रोटीन का उपयोग पेशी विशिष्ट proteostasis के मूल्यांकन की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, मायोसिन की एक एन टर्मिनल भाग के लिए जुड़े हुए β-galactosidase, जिसमें पशुओं के उपयोग, कि एक मायोसिन प्रमोटर के नियंत्रण में संश्लेषित और बढ़ाने साइटोसोलिक प्रोटीन मांसपेशियों सामग्री 19 के मूल्यांकन की अनुमति देता है. जंगली प्रकार वयस्कों में नीला दाग की उपस्थिति सक्रिय β-galactosidase की उपस्थिति और वैकृत साइटोसोलिक प्रोटीन गिरावट के अभाव को दर्शाता है. उपचार के जवाब में धुंधला का नुकसान वैकृत प्रोटीन गिरावट (चित्रा 5 उत्पन्न हो रही है पता चलता है 13,14,19 में 96 घंटा पद वयस्कता. भंडारण-249002 पशुओं का इलाज दाग की कमी को प्रदर्शित जबकि उदाहरण के लिए, अनुपचारित जंगली प्रकार के जानवरों, वयस्कता के बाद (चित्रा 5) एक गहन नीला दाग 72 घंटा प्रदर्शित करते हैं. Sarcomere संरचना और mitochondrial समारोह में दोष के साथ के रूप में, वैकृत प्रोटीन मांसपेशियों का क्षरण की उपस्थिति एक मनाया आंदोलन दोष के लिए खाते के लिए पर्याप्त है, लेकिन जरूरी मांसपेशियों, तंत्रिका, और / या अन्य ऊतकों के साथ अन्य समस्याओं से इंकार नहीं करता.

चित्रा 3
चित्रा 3:. (ए) UNC-112 आरएनएआई टी = 72 घंटा में एक महत्वपूर्ण आंदोलन दोष का कारण बनता है शरीर दीवार मांसपेशियों के भीतर arrayed ए-बैंड संरचना का (बी) के आकलन. डब्ल्यू मेंटी, मांसपेशियों में एक-बैंड (WT जूम देखें) युवा वयस्कता (टी = 0 घंटा) के रूप में सीधे लाइनों दिखाई देते हैं और वयस्कता के 72 घंटा से परे तक काफी हद तक एक समान रहते हैं. UNC-112 आरएनएआई के छोटे क्षेत्रों में वास्तुकला खोने के लिए sarcomeres का कारण बनता है पेशी (टी = 24 घंटा), ढह गई और लापता sarcomeres (टी = 48 घंटा), एकत्रीकरण (टी = 72 घंटा शीर्ष पैनल और ज़ूम) और sarcomeres के linearity (टी = 72 घंटा नीचे पैनल और जूम) की हानि. स्केल सलाखों 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं और zooms 2.5X हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4:. (ए) 112-UNC या गैस-1 आरएनएआई एक आंदोलन दोष का कारण बनता है शरीर दीवार मांसपेशियों के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का (बी) के आकलन. मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया युवा वयस्कता (WT) पर ही नेटवर्क सीधे लाइनों दिखाई देते हैं. UNC-112 आरएनएआई के साथ पशुओं के उपचार mitochondr में परिणामपहले 24 घंटा और वयस्कता (zooms और तीर) 13 से 72 घंटे के बीच मनाया रूप ial विखंडन. इसी तरह, के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के विखंडन में आरएनएआई गैस खिलाफ -1 परिणाम पहले 26 मनाया. इन 72 घंटा (ज़ूम और तीर देखें). विवो में mitochondrial झिल्ली क्षमता (सी) के आकलन में बड़े पैमाने पर गड़बड़ी करने के लिए टी = 24 घंटा और प्रगति में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क में छोटे अंतराल के रूप में मौजूद हैं. भी GFP के माइटोकॉन्ड्रिया के लिए स्थानीय वाले पशुओं में, 2 एन ओ सी 32 एच 32 सीएल 2 शरीर दीवार मांसपेशियों माइटोकॉन्ड्रिया में जम जाता है और 72 घंटे बाद वयस्कता जब तक युवा वयस्कता (टी = 0 घंटा) से एक तीन-पास फिल्टर के तहत नारंगी प्रकट होता है. शेष माइटोकॉन्ड्रिया एन 2 हे बनाम WT सीएल 2 एच 32 सी 32 का कम संचय दिखा जहां 72 घंटा में दिखाया के रूप में UNC-112 आरएनएआई के साथ उपचार झिल्ली क्षमता का एक प्रगतिशील नुकसान का कारण बनता है. 10 एसई के लिए Photobleachingसी 540/25 एनएम प्रकाश विरंजकों Mitotracker से लाल का उपयोग और मांसपेशियों माइटोकांड्रिया (फोटो ब्लीच) के लिए स्थानीय GFP का पता चलता है. स्केल सलाखों 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं और 2.5X हैं ज़ूम.

चित्रा 5
चित्रा 5: (ए) के उपचार भंडारण-294002 जानवरों के साथ एक आंदोलन दोष लाती एक β-galactosidase परख का उपयोग प्रोटीन गिरावट का (बी) के आकलन.. एल 1 लार्वा WT सिंक्रनाइज़ आयु OP50 (WT नियंत्रण) या एन जी एम के साथ वरीयता प्राप्त एन जी एम के लिए स्थानांतरित करने से पहले 20 डिग्री सेल्सियस (टी = 0 घंटा) में युवा वयस्कता हो गई 20 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए भंडारण-294002 (PI3K अवरोध करनेवाला उपचार) के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं . एक में लगभग 20-30 जानवरों टी = 0 घंटा में β-galactosidase गतिविधि (नीला) के लिए और 24 घंटा, 48 घंटा और 72 घंटे के बाद दाग रहे हैं.

Discussion

इन तरीकों एक आंदोलन दोष पैदा करने के लिए पर्याप्त हैं कि subcellular दोषों की पहचान करने के लिए आंदोलन की macrophysiology से पेशी के अन्वेषण अनुमति देते हैं. जब संयुक्त इन तरीकों पेशी के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. प्राप्त की अंतर्दृष्टि सामान्य फिजियोलॉजी, pathophysiology और उम्र बढ़ने से संबंधित पेशी उन्मुख परिकल्पना की आगे की जांच की अनुमति देता है.

आंदोलन Assays

एक आंदोलन दोष सामान्य नयूरोमुस्कुलर समारोह के विघटन इंगित करता है. यह नसों या मांसपेशियों के लिए विशिष्ट हो सकता है या यह कई ऊतकों के बीच आम हो सकता है. पूरा आंदोलन assays के सबसे कठिन चरणों जनसंख्या और / या उपचार के प्रतिनिधि हैं जो कीड़े का चयन, और भी प्रयोगकर्ता M9 के लिए हस्तांतरण पर पशु घायल नहीं करता कि सुनिश्चित कर रहे हैं. यह आंदोलन का एक प्रतिनिधि और सटीक आकलन प्राप्त करने के लिए एक बड़ा नमूना आकार होना बहुत जरूरी है. अत्यधिक कलम परख करने की क्रिया जबउदाहरण के लिए etrant प्रभाव, के रूप में अक्सर म्यूटेंट में देखा, दस जानवरों का एक नमूना आकार एक आंदोलन के लिए दस बार का मूल्यांकन जंगली प्रकार बनाम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को खोजने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, आंदोलन assays और संवर्धन सी एलिगेंस की आसानी के सादगी कीड़े के सैकड़ों जल्दी से मात्रात्मक मजबूत परिणाम सुनिश्चित करने के क्रम में मूल्यांकन किया जा सकता है कि इसका मतलब. आबादी के केवल एक हिस्से में मौजूद दिखाई देने वाले प्रभाव परख करने की क्रिया जब यह सबसे अधिक प्रभावित पशुओं में दोष की गंभीरता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित हो गया लगता है जनसंख्या का अनुपात क्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसी स्थितियों में जानवरों की बड़ी संख्या प्रभावित आबादी के अनुपात के लिए कम से कम डेटा उपलब्ध कराने के क्रम में मूल्यांकन किया जाना चाहिए. अकसर दवा और आरएनएआई उपचार दोनों आबादी के एक छोटे से अनुपात में गंभीर आंदोलन दोषों का उत्पादन होगा. कुछ मामलों में AFF के अनुपात में वृद्धि होगी उपचार और या प्रसव की विधि की खुराक में वृद्धिected जानवरों और चल खुराक प्रतिक्रिया घटता एक दवा या आरएनएआई का इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने में उपयोगी हो सकता है. इस आंदोलन परख का एक दूसरा सीमा कीड़े आंदोलन का आकलन करने के लिए चालाकी से किया जाता है. इस प्रकार, कीड़े दोनों उत्तेजित और तरल में उठाया जब आसमाटिक तनाव के कुछ डिग्री के अधीन हैं. आसमाटिक तनाव की डिग्री M9 या बीयू पानी के लिए विरोध के रूप में बफर 19 का उपयोग करके सीमित किया जा सकता है. इन सीमाओं के कुछ ImageJ 35 के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रैकिंग सिस्टम 34 या मुफ्त प्लग इन का उपयोग प्लेटों पर अभ्यस्त आंदोलन को मापने के द्वारा क्रमशः समाप्त कर रहे हैं. एक जानवर के आंदोलन की दर को मापने उम्र भर मापा और इस विधि के गैर invasiveness मांसपेशी समारोह के भावी जीवन भर के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है कि हो सकता है समारोह में परिवर्तन सहित समग्र मांसपेशी स्वास्थ्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं.

सिकुड़ा उपकरण की इमेजिंग

<पी वर्ग = "jove_content"> छवि सिकुड़ा तंत्र की संरचना करने के लिए यहां इस्तेमाल कीड़ा तनाव शरीर दीवार की मांसपेशियों के भीतर sarcomeres के लिए स्थानीय है कि एक मायोसिन GFP संलयन प्रोटीन व्यक्त जो PJ727 36 था. इस तनाव का प्रयोग रहने वाले जानवरों में sarcomere संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. ऊपर वर्णित आंदोलन परख के लिए इसी प्रकार, sarcomere संरचना का आकलन करने के लिए GFP लेबल sarcomeres का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ विधि अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव है और इसलिए भावी जीवन भर व्यक्ति पशुओं में sarcomere संरचना का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि के साथ सबसे बड़ी कठिनाई imaged किया जा रहा है कि कीड़े यह मुश्किल अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित छवियों को प्राप्त करने के लिए बनाता है, जो अब भी घूम रहा है इसलिए जिंदा है और हो रहा है. कई तरीकों आंदोलन को कम करने और सरल इमेजिंग बनाने के लिए नियोजित किया जा सकता है; इन anesthetizing या दबाव, सक्शन, या एक उच्च चिपचिपापन समाधान के उपयोग के माध्यम से कीड़े और स्थिरीकरण लकवाग्रस्त शामिल हैं. Immobiliz के इन तरीकों में से प्रत्येकसमझना यह खुद नयूरोमुस्कुलर समारोह को बदल सकते हैं कि खामी है. इसलिए, यह विश्लेषण में उपयुक्त अनुपचारित नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. यह भी चुना स्थिरीकरण विधि अध्ययन के तहत प्रश्न के लिए कितना व्यापक रूप से इस्तेमाल पर निर्भर करता है, के कारण स्थिरीकरण विधि के साथ समस्याओं का परिणाम नहीं हैं पुष्टि करने के लिए स्थिरीकरण के कम से कम दो स्वतंत्र तरीकों का उपयोग करने के लिए विवेकपूर्ण हो सकता है. यहाँ हम कम आंदोलन को प्रेरित करने के लिए कीड़ा पर coverslip से सरल दबाव का इस्तेमाल किया है. Coverslip के रखने के बाद, coverslip के नीचे तरल लुप्त हो जाएगा और coverslip फलस्वरूप आम तौर पर यह आसान इमेजिंग सक्षम करने के लिए पर्याप्त कम आंदोलन का उत्पादन करने के लिए 2-5 मिनट लगते हैं, कीड़े पर अधिक दबाव का उत्पादन शुरू हो जाएगा.

Coverslip के अंत में, सह के बाद आम तौर पर 10-15 मिनट के अत्यधिक दबाव से फट करने के लिए कीड़े पैदा करने के लिए पर्याप्त वृद्धि होगी दबाव के रूप में पेश किया गया है बारीकी के बाद यह कीड़े नजर रखने के लिए आवश्यक हैverslip अलावा. अतिरिक्त बफर कीड़े को कुचलने की चोट से बचने के लिए coverslip के किनारों के आसपास एक pipet टिप की सहायता से पेश किया जा सकता है. अगर वांछित यह कवर पर्ची के नीचे से जानवरों की बहाली को रोकता है, हालांकि नेल वार्निश, कवर पर्ची के किनारों को सील और वाष्पीकरण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह, समाधान में सिलिकॉन मोतियों का उपयोग दबाव की राशि कीड़े पर coverslip स्थानों कम करने में मदद कर सकते हैं.

बस एक आंदोलन दोष के लिए आकलन करने के साथ ही, यह प्रभाव का अंतर्वेधन विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. 80-100% जानवरों आबादी प्रदर्शन के ≤20% एक को प्रभावित अगर 21-79% अगर आंशिक और कम, एन जी एम प्लेट पर एक phenotype प्रदर्शित अगर अंतर्वेधन उच्च माना जा सकता है. अत्यधिक व्याप्ति प्रभाव के लिए, छोटे नमूना आकार sarcomere दोषों पर महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा का उत्पादन किया जा सकता है. प्रभाव दवा के जवाब में एक स्पष्ट आंदोलन दोष प्रदर्शित कि जानवरों की एक कम अंतर्वेधन, चयन किया है जहां मामलों मेंया आरएनएआई उपचार सबसे उपचार से प्रभावित पशुओं में sarcomere दोष परख करने की क्रिया में उपयोगी हो सकता है. हालांकि, यह आंदोलन और subcellular संरचना पर उपचार प्रभाव की हद तक एक ही है कि जरूरी मामला नहीं है. इस प्रकार, यह उदाहरण के लिए, 100 पशुओं को एक बड़ी आबादी में उपस्थित दोषों की हद तक जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है. यह आबादी भर में दोष के वितरण की समझ में सक्षम बनाता है. यह भी सबसे गंभीर रूप से प्रभावित पशुओं में दोष की हद तक की जांच और / या sarcomere दोष की हद और आंदोलन दोष की हद के बीच संबंध की जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है. संभावित कठिनाइयों तरफ, इस विधि sarcomere संरचना का आकलन करने के अन्य तरीकों की तुलना में जल्दी और आसान है. यह गति और आसानी, हालांकि, एक प्रमुख सीमा के अधीन है, GFP संलयन प्रोटीन युक्त sarcomeres बाधित sarcomeres के 37 और इसलिए मूल्यांकन अतिरिक्त अधिक श्रम प्रधान तरीकों का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए पूरी तरह से सामान्य नहीं हैं.इन विधियों 39 धुंधला phalloidin ध्रुवीकृत प्रकाश 38 का उपयोग, और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस 40 में शामिल हैं. इन तरीकों में से केवल ध्रुवीकृत प्रकाश अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव है; अन्य तरीकों निर्धारण की आवश्यकता होती है और इसलिए अलग-अलग जानवरों की भावी अध्ययनों में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता, बल्कि वे ही, इस तरह के अध्ययन से परिणाम, पुष्टि sectionally पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Mitochondrial नेटवर्क की इमेजिंग

माइटोकॉन्ड्रियल इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कीड़ा तनाव शरीर दीवार की मांसपेशियों में दोनों, माइटोकॉन्ड्रिया और नाभिक के लिए स्थानीय एक GFP β-galactosidase संलयन प्रोटीन के लिए स्थानीय एक GFP संलयन प्रोटीन व्यक्त जो CB5600 7 था. इमेजिंग sarcomeres के लिए PJ727 के उपयोग के साथ के रूप में, इस तनाव का उपयोग रहने वाले जानवरों में mitochondrial नेटवर्क संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. इस प्रकार, इस तनाव उदाहरण कम mitocho के लिए, हो जो गतिशील परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैndrial फ्यूजन और / या बढ़ा माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन 41. इसके अलावा इमेजिंग sarcomeres के लिए, के रूप में इस विधि के साथ सबसे बड़ी कठिनाई imaged किया जा रहा कीड़े यह मुश्किल अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित छवियों को प्राप्त करने के लिए कर रही है, अभी भी जीवित है और आगे बढ़ रहे हैं. ऊपर अधिक से अधिक विस्तार में चर्चा के रूप में कई तरीकों, आंदोलन को कम करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, माइटोकॉन्ड्रिया कम आंदोलन को प्रेरित है कि हस्तक्षेप करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील दिखाई देते हैं. उदाहरण के लिए, सबसे अधिक mitochondrial श्वसन श्रृंखला की एनेस्थेटिक्स लक्ष्य घटकों का इस्तेमाल किया और इसलिए सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और समारोह के अध्ययन में सावधानी से किया जाना चाहिए रहे हैं. सबसे लकवाग्रस्त एजेंट कम संकेत neuromuscular जंक्शन और मांसपेशियों के कार्यात्मक वितंत्रीभवन के माध्यम से पारित करने के कारण के रूप में इसी तरह, सबसे लकवाग्रस्त एजेंटों mitochondrial विखंडन प्रेरित करने के लिए, सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और समारोह के अध्ययन में सावधानी के साथ पर्याप्त है इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस अध्ययन में प्रयोगों पशु स्थिर दबाव कार्यरतयह तुरंत छवि पशुओं के लिए आवश्यक है, हालांकि एस लेकिन दूसरों को सफलतापूर्वक, levamisole 42 का इस्तेमाल किया है.

अन्त में, उदाहरण के बी subtilis के लिए संस्कृतियों में विभिन्न बैक्टीरियल contaminants, mitochondrial विखंडन पैदा कर सकते हैं; इसलिए यह विश्लेषण में उपयुक्त अनुपचारित नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. अत्यधिक व्याप्ति प्रभाव के लिए, छोटे नमूना आकार माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क दोषों पर महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा का उत्पादन किया जा सकता है. हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क में छोटे दोष के प्रसार के कारण, जानवरों की इस छोटी संख्या sarcomere संरचना के मूल्यांकन के लिए आवश्यक दो बार संख्या होने की संभावना है. प्रभाव एक कम अंतर्वेधन है जहां मामलों में, स्पष्ट रूप से दवा या आरएनएआई उपचार के जवाब में एक आंदोलन दोष प्रदर्शित पशुओं का चयन सबसे उपचार से प्रभावित पशुओं में mitochondrial दोष परख करने की क्रिया में उपयोगी हो सकता है. उपरोक्त के रूप में हालांकि, यह मामला जरूरी नहीं है किआंदोलन और subcellular संरचना पर उपचार प्रभाव की हद तक ही है. इस प्रकार, यह उदाहरण के लिए, 150-200 पशुओं के लिए, साथ ही सबसे गंभीर रूप से प्रभावित पशुओं में व्यवधान की हद और की हद से विघटन की हद तक की उपस्थिति या अनुपस्थिति एक बड़ी आबादी में उपस्थित दोषों की हद तक जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है आंदोलन दोष. Fluorescently लेबल माइटोकॉन्ड्रिया के साथ अन्य उपभेदों CB5600 में प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग mitochondria की आधारभूत नेटवर्किंग प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया कल्पना करने के लिए एक TOMM-20 आरएफपी संलयन प्रोटीन का उपयोग mitochondrially स्थानीयकृत GFP 17 का उपयोग बनाम आधारभूत mitochondrial विखंडन वृद्धि हुई पैदा करने के लिए प्रकट होता है. ऐसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य तरीकों माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जबकि एक नियतन कदम की आवश्यकता होती है, क्योंकि वे माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के vivo मूल्यांकन की अनुमति नहीं देतेडी. ऐसे mitochondrially स्थानीयकृत रंगों के प्रयोग के रूप में अन्य विधियों निर्धारण के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए भी mitochondrially स्थानीयकृत GFP के उपयोग के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है. अगले भाग में चर्चा की, इस तरह के रंगों का प्रयोग भी इन विवो mitochondrial समारोह के कच्चे मूल्यांकन की अनुमति देता है.

सी एलिगेंस में vivo में mitochondrial झिल्ली क्षमता का आकलन

रंगों की एक किस्म लेबलिंग माइटोकॉन्ड्रिया 28 के लिए उपलब्ध हैं. इन रंगों लाइव सी एलिगेंस में mitochondrial नेटवर्क संरचना visualizing का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करते हैं. वे mitochondrial झिल्ली क्षमता पर आधारित माइटोकॉन्ड्रिया में जमा क्योंकि इन रंगों के कई लोग भी विवो में mitochondrial कार्यक्षमता के कच्चे मूल्यांकन अनुमति देते हैं. के माध्यम से किया जाता है जो यहाँ हम इस्तेमाल किया है सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 हेकुछ अतिरिक्त क्योंकि 0.5% DMSO में भंग किया जा रहा द्वारा afforded permeabilization की छल्ली के माध्यम से कीड़ा प्रवेश करने के साथ पाचन तंत्र,. सेल सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 ओ में प्रवेश के बाद ऑक्सीकरण और यह अमीनो एसिड (जैसे methionine और सिस्टीन) युक्त सल्फर बांध जहां माइटोकॉन्ड्रिया से तनहा है. इन डाई-पेप्टाइड परिसरों के गठन एच 32 सीएल 2 एन 2 हे एक बार 28 लेबल माइटोकॉन्ड्रिया में रहता सी 32 का मतलब है. माइटोकॉन्ड्रियल रंगों के उपयोग के साथ एक प्रमुख कठिनाई वे पशु के सभी माइटोकॉन्ड्रिया लेबल होगा. इसलिए हम CB5600, मांसपेशियों माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क संरचना का आकलन करने के लिए ऊपर वर्णित एक ही तनाव में लेबलिंग प्रदर्शन किया है. एक लाल माइटोकॉन्ड्रियल डाई, मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया में GFP व्यक्त कीड़े के एक तनाव, और एक ट्रिपल पास फिल्टर का उपयोग करके, यह छवि के लिए कर रहे हैं कि माइटोकॉन्ड्रिया ओ खोजने के द्वारा पेशी में केवल माइटोकॉन्ड्रिया अपेक्षाकृत सरल हैलाल डाई और GFP लेबल माइटोकॉन्ड्रिया की colocalization द्वारा सीमा. डाई फोटो प्रक्षालित उच्च तीव्रता फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत सेकंड के भीतर है क्योंकि इस colocalization दृष्टिकोण प्रदर्शन में सबसे कठिन कदम इमेजिंग है. इस आशय प्रयोगकर्ता छवि के लिए तैयार है जब तक कम बिजली पर प्रतिदीप्ति रखने और फिर उसके अनुसार प्रतिदीप्ति तीव्रता का समायोजन करके सीमित किया जा सकता है. एक रंगों के उपयोग के साथ अनुभवी हो जाने के बाद एक और दृष्टिकोण सही ऊतक में छवि केवल माइटोकॉन्ड्रिया को जेड के ढेर के साथ confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए है; मांसपेशियों में mitochondrial नेटवर्क अन्य ऊतकों की तुलना में काफी अलग हैं. दुर्भाग्य से, माइटोकॉन्ड्रिया 28 छोड़ने के लिए सी 32 की अक्षमता एच 32 सीएल 2 एन 2 हे sarcomere और mitochondrial इमेजिंग तकनीक के ऊपर चर्चा के विपरीत, यह भावी एच 32 सी 32 है, जब तक समय के साथ mitochondrial समारोह के नुकसान का पालन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, इसका मतलब है कि सीएल 2 एन 2 हेजानवर आबादी को अलग करने के असतत समय बिंदुओं पर जोड़ा जाता है. इस सीमा में इस तरह के 43 संभावित झिल्ली के पतन पर माइटोकॉन्ड्रिया छोड़ कर कि जे.सी.-10 के रूप में रंगों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. माइटोकॉन्ड्रिया भी सी से अलग किया जा सकता बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एलिगेंस 30. इस तरह की निकासी प्रवाह cytometry का उपयोग lipophilic cationic डाई तेज या एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक 44 की दर बढ़ाता द्वारा mitochondrial झिल्ली क्षमता की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. एक बिगड़ा mitochondrial झिल्ली क्षमता स्थापित करने के बाद, यह प्रोटॉन ढाल का नुकसान एक संवेदनशील bioluminometric luciferase आधारित विधि 45 का उपयोग करते हुए एटीपी उत्पादन का नुकसान में तब्दील निर्धारित करने के लिए भी संभव है.

सी में प्रोटीन गिरावट का आकलन एलिगेंस

प्रोटीन मांसपेशियों गिरावट का आकलन करने के लिए यहां इस्तेमाल कीड़ा तनाव एक मांसपेशी विशिष्ट β जिसमें PD55 था,वयस्कता पहुंच गया और अगले 72-96 घंटे 19 के लिए cytosol में स्थिर बनी हुई है, जो है, जब तक -galactosidase कि लगातार विकास भर में संश्लेषित है. वयस्कता के दौरान β-galactosidase का नुकसान एक हस्तक्षेप साइटोसोलिक प्रोटीन गिरावट 19 की वृद्धि हुई शुरू हो गया है इंगित करता है जबकि इस प्रकार, विकास के दौरान β-galactosidase के स्तर की माप मुख्य रूप से मायोसिन प्रमोटर से संश्लेषण पर हस्तक्षेप के प्रभाव को दर्शाता है. β-galactosidase गतिविधि का आकलन करने में महत्वपूर्ण कदम प्रभावी सुखाना सुनिश्चित करने के लिए है. प्रभावी ढंग से जानवरों सूखना करने में विफलता जानवरों के शरीर दीवार की मांसपेशियों में एक्स-लड़की सब्सट्रेट और इसलिए गरीब नीले रंग की गरीब प्रावधान में यह परिणाम है. Desiccator पर मुहर जाँच की जानी चाहिए और नमूना प्रगति का आकलन करने के लिए सुखाना भर में 5-10 मिनट के अंतराल पर जाँच की जानी चाहिए अच्छा सुखाना सुनिश्चित करने के लिए (यानी, 20 μl नमूना 10 मिनट और शेष 20 मिनट के भीतर सूख गए हैं चाहिए) व्यापक सुखाना सुनिश्चित करने के लिए है. β-galactosidase परख एक गतिविधि परख इसलिए एक उपयुक्त नियंत्रण आवश्यक है. साथ ही, कि गिरावट होने वाली है साबित नहीं करता नियंत्रित करने के लिए एक इलाज हालत सापेक्ष में वयस्कों के धुंधला कमी आई; बल्कि यह उपचार के जवाब में enzymatic गतिविधि में कमी आई इंगित करता है. गिरावट की पुष्टि करने के लिए, अधिक श्रम प्रधान पश्चिमी धब्बा विश्लेषण β-galactosidase 13 के खिलाफ पूरा किया और इस गिना कीड़े की छोटी आबादी में मात्रा का ठहराव प्रोटीन गिरावट की अनुमति देता है किया जाना चाहिए. पश्चिमी धब्बा बैंड घनत्व ImageJ 46 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस पद्धति की एक और सीमा ट्रांसजेनिक प्रोटीन का उपयोग गिरावट के शारीरिक लक्ष्य के रूप में और प्रोटिओमिक और / या लक्षित परिकल्पना संचालित पश्चिमी blots 13 नियोजित किया जाना चाहिए इस तरह के जवाब के लिए सूचित नहीं करता है. अन्त में, इन अध्ययनों में कार्यरत ट्रांसजेनिक प्रोटीन के संश्लेषण के रूप में जल्दी वयस्कता 19 में बंद हो जाता है सी में पेशी प्रोटीन संश्लेषण में परिवर्तन की जांच करने के इच्छुक हैं, तो अन्य तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए पेशी एलिगेंस; उदाहरण के लिए, स्थिर या रेडियोधर्मी आइसोटोप तरीकों.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

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References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

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विकास जीवविज्ञान अंक 93 फिजियोलॉजी, मांसपेशियों माइटोकॉन्ड्रिया sarcomeres उम्र बढ़ने
तरीके में पेशी के subcellular डिब्बों का आकलन करने के लिए<em&gt; सी. एलिगेंस</em
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Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

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